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要約

創傷は世界的な健康課題です。この研究では、創傷測定のばらつきを最小限に抑えるために、デジタル面積測定を利用した標準化されたフォトブースを開発しました。マウスの創傷を14日間にわたってモニタリングしたところ、創傷面積と周囲が最初に増加し、その後徐々に閉鎖されることが明らかになりました。この方法論は、前臨床モデルにおける創傷閉鎖動態の評価に役立つ可能性があります。

要約

慢性創傷は、その高い有病率により、深刻な世界的な健康問題です。効果的な治療戦略は、治癒を大幅に加速し、それによって合併症のリスクを減らし、医療システムの経済的負担を軽減することができます。創傷治癒については数多くの実験的研究が研究されていますが、そのほとんどは定性的観察または定量的な直接測定に依存しています。この研究の目的は、デジタル プラニメトリーを使用した間接創傷測定方法を標準化することであり、デジタル スケーリングとセグメンテーションを組み込んでいます。このアプローチは、正確な創傷評価のための詳細な段階的な方法論の欠如に対処します。フォトドキュメンテーションブースが設計および建設され、コンピューター支援のデジタル面積測定ツールが採用されて、創傷領域、周囲、および創傷の中心からその端までの距離の測定のばらつきが最小限に抑えられました。円形の外傷性創傷(直径5mm)を、雄のCD1マウス(n = 4、10週齢、30〜35g)の肩甲骨レベルの背側正中線上に作成しました。創傷の進展は、照明条件、焦点距離、被写体の位置を制御するカスタムデザインのフォトブースを使用して、14日間フォトドキュメンテーションされました。スケーリングと創傷測定は、ImageJソフトウェアのセグメンテーションを使用して実行し、統計分析ソフトウェアは統計分析ソフトウェアを使用して実行しました。創傷閉鎖の動態は、0日目と2日目の間に創傷のサイズと周囲がわずかに増加し、その後、14日目までに完全に閉鎖するまで徐々に減少することを示しました。フォトドキュメンテーションブースとコンピューター支援デジタル面積測定により、ばらつきを最小限に抑えた定量的測定が可能になりました。結論として、これらのツールは、前臨床モデルにおける創傷閉鎖動態を評価するための信頼性と再現性のある方法を提供します。

概要

外傷性創傷治癒には約 21 日かかり、(1) 止血、(2) 炎症、(3) 増殖、(4) リモデリング1 の 4 つの異なる段階の明確な順序があります。創傷治癒のいずれかの段階が長引くと、慢性創傷の発症につながる可能性があります1。その高い有病率、潜在的な合併症2、および重大な経済的負担のために、彼らは世界的な健康問題と見なされています。

前臨床試験は、包括的な創傷再上皮化3,4,5を促進し、合併症を予防し、治療コストを削減することにより、より迅速な治癒を達成することを目的としています。これらの研究では、生体材料の開発、薬理学的介入、その他の再生医療処置など、さまざまな戦略が評価されています6,7,8,9。

外傷性創傷の研究のために、複数の実験モデルが開発されています。いくつかは、サイズ、炎症指標、肉芽組織の存在、分泌物、かさぶた形成など、巨視的に見える定性的特性に焦点を当てています5。また、面積、周囲長、半径、直径、色、深さ、傷の中心から端までの距離などの定量的データを分析しているものもあります。

この点で、ほとんどのin vivo研究は創傷の半径と深さを直接測定します。しかし、巨視的画像における創傷エッジの手動による描写は、測定にバイアスをもたらす可能性がある10。他の研究では、透明な格子状のプラスチックシートを使用して、創傷の端が以前に描かれている場所で、機械的面積測定を使用しています。どちらの場合も、面積または周囲を取得するには、定規やデジタル平面計などの手動機器が必要です。今日では、コンピュータ支援デジタルプラニメトリーにより、創傷やプラスチックシートの巨視的画像のコンピュータによる分析が可能になりました。その場での操作と巨視的画像の品質には制限がありますが、このツール11,12,13,14は、面積と周囲の測定値の間のばらつきを大幅に低減します。

この提案された方法論は、マウス15、16、17、18、19、20における創傷閉鎖を評価するための既存の技術よりも大きな利点を提供します。写真記録は、創傷閉鎖の動態を評価するための正確で一貫性のあるツールと見なされてきましたが、以前の研究21,22 では、観察者のバイアスや、照明やカメラの位置が一貫していないことによる変動性など、手動による創傷測定の限界が浮き彫りになっています。現在のアプローチでは、特注ブースを通じてイメージング条件を標準化することで、これらの問題に対処し、再現性と精度を向上させています。さらに、コンピュータ化されたデジタルプラニメトリーは、より正確な定量的評価を可能にし、治療介入の評価を強化し、測定誤差を最小限に抑えることができます。これは、手動技術とデジタル技術を比較する他の研究で証明されているように12,22、マウスモデルの創傷閉鎖動態の研究に特に適しており、画像取得条件を厳密に制御することで治療の正確な評価を可能にします。

プロトコル

実験用マウスを含むすべての実験手順は、実験動物の取り扱いと世話に関するメキシコの公式規格(NOM-062-ZOO-1999)に定められた倫理基準と規制に従って実施されました。このプロトコルは、国立原子核研究所(ININ)の実験動物のケアと使用のための内部委員会(CICUAL)によってレビューされ、参照番号CICUAL-01-23で承認されました。この研究では、体重が28〜32 gの10週齢の雄CD1マウス(n = 4)が使用されました。すべての動物は、系統、年齢、性別、および体重の均一性を確保し、実験結果のばらつきを最小限に抑えるように選択されました。試薬および使用した機器の詳細は、材料表に記載されています。

1. 巨視的画像取得のためのフォトブース施工

注:ライセンスされたSolidWorksソフトウェア(バージョン2015)を使用して、外部光源を排除するためのフォトブースを設計しました。40 cm × 40 cm の立方体は、厚さ 1 インチの白いアルミニウム プロファイルを使用して構築されました。キューブは、屋根、側壁、床の 3 つのセクションで構成され、順番に組み立てられました (図 1A)。

  1. 屋根工事
    注意: 屋根は、前端(A)、後端(B)、および側面端(CおよびD)の向きに地域化されています(図1B)。
    1. 屋根の側端(CおよびD)の内側領域に、幅1.5 cm、厚さ2.51 cm、長さ34.9 cmのスロット付きアルミニウムプロファイル(ガラスを保持するように設計されています)を固定します(図1B)。
    2. 長さ34.5cm×幅13cmの長方形のアルミニウムプレートを2枚、中央にポリエチレンを敷き詰め、各ルーフプロファイル( 図1Cのプレート1と2)の溝に置き、両方のプロファイルの溝をスライドできるようにします。
    3. 色温度範囲が20〜9000 K(図1C)の20 cm RGB LEDチューブライトを、両面テープを使用してパネル1の下側の端に45°の角度で取り付けます。
    4. 屋根パネル1および2に、カメラレンズを取り付けることができるように、中央に直径7.82cmの円形の切り欠きが付いた32 cm x 12 cmの長方形のフォームボードパネルを取り付けます(図1C)。
  2. 床の構造
    1. 40 cm x 40 cm四方の白いフォームボードを床面積のプロファイルの上に置きます。フォームボードの各角から一辺の長さが2.54cmの正方形を切り取ります(図1E)。
  3. 側壁の建設
    1. 40 cm x 40 cmの四角形のフォームボードパネル4枚をカットします。
    2. 側面CとDに2つのパネルをシリコンで接着して、左右の側面を形成します(図1F)。
    3. フックとループファスナーストリップをアルミニウムプロファイルAとBに取り付けて、内部の写真ブース要素を簡単に操作できます。また、一列に並んだ接着剤の端から1cmのところに、片側の発泡スチロール段ボールの四角い部分に取り付け、前面と背面に貼ります(図1F)。
  4. 基準ベースの構築
    注:麻酔中および創傷の進展の文書化全体を通じてマウスを腹臥位に維持するためには、参照ベースが必要でした。3Dコンポーネントは、PLA材料と3Dプリンタ23,24を使用した熱溶解積層法(FDM)技術を使用して設計および製造されました。
    1. 幅、長さ、高さが2 cmのベースでマスクを3Dプリントし、事前にカットされた40 cm x 28 cmの白いフォームボードの長方形の端から11.5 cmの位置に配置して、マウスを吸入麻酔下に維持します(図1D、赤色)。
    2. 長方形のプラットフォーム(長さ9 cm、幅5 cm、高さ2.5 cm)を3Dプリントし、4つの押し出し領域を使用して、画像取得中にマウスの背側を位置合わせします。これらの領域は、腹臥位を維持するために頭、手足、腹部を支えていました。このプラットフォームをリファレンスベースの中心に接着します(図1D、緑色)。
    3. 定規ブロック(幅2 cm、長さ8 cm、高さ2.5 cm)を3Dプリントし、マウスベースの左側から1 cmに固定して、デジタル画像処理に必要な測定基準要素を配置します(図1D、青色)。
    4. 15 cmのステンレス鋼の目盛り付き定規を定規ブロックに取り付け、画像スケーリングのためにキャビン内にリファレンスベース全体を取り付けます(図1D)。

figure-protocol-2695
図1:巨視的画像取得キャビネットの構造図(A)キャビンのセクション(屋根、側壁、床)。(イ)屋根を形成するプロファイルの向き。フロント(A)、リア(B)、およびサイド(プロファイルの内側)の赤い「C、D」。(C)屋根パネル1、2、LEDライトチューブの取り付け、カメラのレンズプレート、床面の取り付け。(D)麻酔マスク(RED)、マウスプラットフォーム(GREEN)、および測定定規(BLUE)を基準ベースに配置するための長方形のプラットフォームのインストール。(E) 参照ベースの最終的な位置。(F)側面、前面、および背面の壁の設置。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. 動物の飼育

  1. 施設の生命倫理委員会から動物実験の許可を得てください。10週齢、体重28〜32gのCD1マウス(n = 4)を使用します。
  2. 標準的な条件下でマウスを飼育します:温度を21°C、明暗サイクルを12/12時間、湿度45%に維持し、フォトドキュメンテーションセッション中を除き、水と餌に 自由 にアクセスできるようにします。

3.外傷性創傷の発生

  1. 手順の8時間前にマウスを絶食します。マウスを腹腔内ナトリウムペントバルビタールで 65 mg/kg25 で麻酔します (施設で承認されたプロトコルに従います)。
    1. 指間ピンチ時の離脱反射の欠如をチェックして、麻酔の深さを確認します。麻酔中の乾燥を防ぐために、眼科用軟膏を目に塗ります。.手術中および回復中は、マウスを37°Cの安定した温度に保ちます(20分)。
  2. マウスを腹側褥瘡の位置に置き、外科用ブレードを使用して頸部から2.5 cm x 3 cmの領域を尾側に脱毛します。裂傷を避けるために皮膚を伸ばします。ポビドンヨードと滅菌水すすぎを交互に使用して、無菌と消毒を行います。
  3. 滅菌済みの5mm生検パンチを使用し、円を描くように圧力をかけて、肩甲骨レベルで真皮表皮切開を行います。鋸歯状の鉗子でフラップを取り外し、虹彩先端のはさみで切ります(図2A)。
  4. 創傷に出血点がある場合は、電気焼灼装置を使用して電気ショックを適用して止血を達成します。
  5. ジュエラー鉗子を使用して、直径1cmの円形の皮膚フィルムを傷口に貼り付け、汚染と収縮を防ぎます。
  6. すべてのサバイバル手術は無菌条件下で行ってください。ポビドンヨードなどの消毒剤で手術部位を準備します。滅菌手袋とマスクを着用し、滅菌器具を使用し、非滅菌表面との接触を最小限に抑えることにより、手順全体を通して滅菌を維持します。
    1. 手術後、マウスを24°Cの個々のケージに入れ、胸骨の位置を維持するのに十分な意識を取り戻すまでマウスを監視します。手術中および手術後の体温管理を確認し、外部熱源を使用して低体温症を予防します。
  7. ケトロラックを飲料水で5 mg / kg26に希釈することにより、4日目まで鎮痛剤を投与します。.
  8. 14日後、健康なげっ歯類の創傷が通常治癒の進行段階に達したら、国際基準に従ってCO2チャンバーでマウスをO2置換して安楽死させます。これは、研究のエンドポイントを示しています。

4. 巨視的画像取得

  1. 創傷の画像を 14 日間連続して毎日キャプチャし、創傷閉鎖の連続的な動態を監視します。セミプロ用またはプロ用のカメラを使用してください。フォトブースの屋根の円形の開口部にレンズを配置します。
    注:実験条件に基づいて、必要に応じてスケジュールを調整してください。
  2. RGB LEDライトチューブを相関色温度(CCT)モードで使用し、照明に9000Kと100%の明るさに設定します。
  3. リファレンスベースをフォトブースの床の中央に配置します。
  4. マウスを吸入麻酔チャンバーに3分間置きます(図2B)。
  5. 麻酔を誘発した後、マウスをマウスプラットフォーム上で腹臥位に置きます。セボフルラン麻酔マスク内に鼻を固定し、1.5 L / minの酸素流量で5%セボフルランを送達します(図2C)。
  6. 画像を撮影する前に、ジュエラー鉗子を使用して傷口から皮膚フィルムをはがし、リファレンスベースをカメラのレンズに合わせます。
  7. フォトブースの前面壁を設置し、絞りf / 3.2、露出時間1/200秒、ISO感度80、焦点距離4mmの設定で巨視的な画像を撮影します。
  8. ジュエラー鉗子を使用して、麻酔マスクを取り外す前に、直径1cmの皮膚フィルムを傷口に貼り付けます。マウスを個々のケージに移し、運動が回復するまで観察します。

5. 画像処理

  1. 巨視的イメージのバックアップ・コピーを生成します。ImageJソフトウェアを使用して画像を処理します。
  2. ImageJ でバックアップ イメージを開くには、イメージ内の [ファイル] > [開く] > [検索 ] の順にクリックします。
  3. 参照して画像を拡大縮小する:画像を最大化し、直線ツールを選択し、+キーを使用してマウスの横にある定規を拡大し、定規画像に10 mmの直線を描き、[分析]>>[スケールの設定]に移動し、[既知の距離]に「10」を入力し>長さの単位をmmに設定し、[OK]をクリックします。これにより、巨視的な画像のピクセルと距離の比率が決まります (図 2D)。
  4. 創傷領域を画像から分離する:長方形ツールを使用して、創傷の周囲の領域を選択します(w = 150、h = 150)。XとYの値を記録し、 長方形を右クリックして>Duplicate>件名に名前を付け>Enterキーを押します。新しい画像で、+を2回押してズームインします(図2E)。
  5. 次のパスに従ってトリミングした画像を保存します: File > Save As > Tiff > 名前を入力して Save>。
  6. セグメンテーション中の変更を避けるために、切り抜いた画像の複製を作成する: 切り抜いた>画像を右クリックして [複製] > 最後に「Segmentation」を追加して名前を付けます。次に、Enterキーを押します。新しい画像で、+ を 2 回押してズームインします。
  7. イメージをカラーチャネルに分割するには、 イメージ>タイプ>RGBスタックのパスに従います。赤チャンネルの画像(1/3赤)で、[ 複製]を右クリックし、[複製]ウィンドウで [OK ]を押します。
  8. 赤チャンネルの画像をセグメント化します。赤チャンネルの画像をクリックし、[ Image > Adjust > Threshold]をクリックします。次に、[ Default (デフォルト)] > [Apply (適用 )] を選択します (図 2F )。
  9. 関心領域(ROI)を補正して、完全な創傷カバレッジを確保し、セグメンテーションの歪みを回避します。
    注意: 傷口の周囲の領域がセグメンテーションに含まれていない場合は、 穴を埋めるプロセス>バイナリ>に進みます。傷口の外側の黒い点を取り除くには、 Process > Binary > Erodeに進みます。[Erode]コマンドによって傷のサイズが小さくなる場合は、[Process > Binary > Dilate]を使用して傷のサイズを矯正します。
  10. ROIの周囲をマークします: 「選択範囲の編集」>「選択範囲の作成」>。ROIは黄色で囲まれます。[ Edit > Selection] > [Add to Manager ] (図 2G) に従って、ROI Manager に追加します。
  11. セグメンテーションの検証: ROI マネージャー ウィンドウを開き、レビューする ROI を選択します: [その他] > [翻訳] を選択します。手順4で記録したX値とY値を入力し、[ OK]を押します。
    1. 元の画像を最大化し、ROI マネージャーで ROI を選択します。矢印キーを使用して、ROIが傷口と揃うまでROIを調整します(図2H)。ROIが創傷と一致する場合、セグメンテーションは成功しています。それ以外の場合は、手順 2 から繰り返します。
  12. セグメンテーションが確認されたら、創傷測定値を取得します: 分析>測定。結果テーブルには、面積、周囲長、および X/Y 位置の値が表示されます。これらの値をSPSSソフトウェアにコピーして、文書化と統計解析を行います(図2I)。

figure-protocol-7921
図2:デジタルプラニメトリーおよびセグメンテーション技術を使用した創傷測定のワークフロー(A)滅菌5mm生検パンチを使用した真皮表皮切開。(B)マウスを吸入麻酔チャンバーに3分間置く(C)麻酔をかけたマウスをフォトブースに配置し、その鼻をセボフルランマスク内に固定することにより、写真記録。(D)取得した画像をImageJで開き、定規を基準にして拡大縮小します。(E)長方形ツールを使用して創傷領域を抽出します。(F)画像をRGBチャンネルに分離し、赤チャンネルを処理します。(G)関心領域(ROI)の概要と管理。(H)ROIを創傷と一致させることにより、セグメンテーションを検証します。(I)創傷パラメータを測定し、統計分析のために結果を記録する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6.手続き後の安楽死

注:この研究は14日後に終了し、その時点で健康なげっ歯類の創傷は通常、治癒の進行段階に達します。この段階で、マウスは、確立された制度的に承認された安楽死手順に従って人道的に安楽死させられました。

  1. 機器を準備します。安楽死チャンバーが清潔で乾燥しており、過密にならずにマウスを収容するための適切なサイズであることを確認してください。チャンバーをフローレギュレーターで医療グレードのCO2 供給に接続します。
  2. ストレスを最小限に抑えるために、マウスをチャンバーに優しく移します。彼らが外部からの妨害を最小限に抑えた穏やかな環境にいることを確認してください。
  3. 動物の安楽死に関するAVMAガイドラインで推奨されているように、CO2の流量をチャンバーの容積の1分あたりの20%〜30%に設定します。マウスに苦痛や不快感を誘発しないように、CO2濃度を徐々に増やします。
  4. 処置中はマウスを間近で観察してください。活動や呼吸の減少、その後の無呼吸や心停止など、意識が徐々に失われる兆候を探します。
  5. マウスが呼吸しなくなり、動きの兆候が見られなくなったら、死亡を確認します。重要な機能が完全に停止することを確認するために、さらに1〜2分待ちます。反射(角膜反射など)と心臓の活動の欠如を確認して、死亡を確認します。
  6. 死骸を指定された生物学的有害廃棄物容器に移します。動物の遺体を安全に処分するための制度的プロトコルと国のガイドラインに従ってください。
  7. 安楽死させた動物の数、日付、および関連する観察結果を記録して、倫理的および制度的基準の遵守を確保します。

結果

ImageJソフトウェアで画像をスケーリングした後、創傷の平均周囲長(表1)と面積(表2)、およびそれぞれの標準偏差をデジタルセグメンテーションによって取得しました。これらの値は、0 日目から 14 日目 (D0-D14) まで記録されました。

日周囲長(mm)...

ディスカッション

前臨床モデルでは、前臨床モデルにおける外傷性創傷の進化を定量的に分析することは、創傷の大きさ、局所的な炎症反応34、位置、および/または操作などの要因による課題に直面します。これらの測定には、直接手動36および間接デジタル11,16,37,38の面積測定法が存在します。<...

開示事項

著者らは、この研究に関連する利益相反がないことを宣言します。

謝辞

著者らは、助成金を通じてConsejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCyT, CVU: 933600)、およびLaboratorio Nacional de Investigación y Desarrollo de Radiofármacos del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (LANIDER-ININ)の支援に感謝します。さらに、図2は、BioRender.com/p67z056 で入手可能なBioRenderソフトウェア(2020)の支援を受けて作成されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mm Biopsy PunchMILTEX, USA33-35To mark the wound edges
Aluminum with polyethylene coreAlucobond,USABright Silver 119For the construction of the macroscopic Image Acquisition Booth
Camera Lens Sony, JapanSEL2470ZTo focus the images to photograph
ElectrocauteryBonart, USAART-E1To eliminates bleeding points in the wound if present.
Hook and loop fastener strips VELCRO
IBM SPSS Statistics Version 22IBM Corporation, USAhttps://www.ibm.com/analytics/spss-statisticsUsed for statistical analysis of wound measurements, including area and perimeter data.
ImageJ Version 1.53tNational Institutes of Health, USAhttps://imagej.nih.gov/ij/Used for processing macroscopic images, including scaling, segmentation, and measurement of wound parameters.
KetorolacSIEGFRIED RHEIN, Mexico493977For postoperative pain management
Miltex Iris Scissors, 4-1/8" CurvedMILTEX, USAV95-306To cut the wound flap generated with the biopsy punch
RGB LED Light TubeANDOER, China‎ B09F8RLMSYTo illuminate the Macroscopic Image Acquisition Booth
Semi profesional cameraSony, Japan DSC-HX300To take the photos
Serrated ForcepsMILTEX, USAV96-118To hold the flap during the cut
SevofluraneBaxter, USAAMX2L9117PRFor inhaled anaesthesia
Sodium PentobarbitalAranda, Mexico734.448.001.212For intraperitoneal anaesthesia
SolidWorks Version 2015Dassault Systèmes, France https://www.solidworks.com/Used to design and create 3D models for constructing  accessories for the photodocumentation booth.
Surgical blades HERGOM, MexicoH10To shave the hair in the area where the wound will be created
Transparent Adhesive Dressing3M, USAF51CA07To cover the traumatic wound

参考文献

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