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Method Article
Wunden stellen eine globale gesundheitliche Herausforderung dar. In dieser Studie wurde eine standardisierte Fotokabine mit digitaler Planimetrie entwickelt, um die Variabilität der Wundmessung zu minimieren. Die Überwachung der Wunden bei Mäusen über einen Zeitraum von 14 Tagen zeigte eine anfängliche Zunahme der Wundfläche und des Wundumfangs, gefolgt von einem allmählichen Verschluss. Diese Methodik kann bei der Bewertung der Wundverschlusskinetik in präklinischen Modellen hilfreich sein.
Chronische Wunden sind aufgrund ihrer hohen Prävalenz ein ernstes globales Gesundheitsproblem. Wirksame Therapiestrategien können die Heilung deutlich beschleunigen und damit das Risiko von Komplikationen verringern und die Gesundheitssysteme wirtschaftlich entlasten. Obwohl zahlreiche experimentelle Studien die Wundheilung untersucht haben, stützen sich die meisten auf qualitative Beobachtungen oder quantitative direkte Messungen. Ziel dieser Studie war es, eine indirekte Wundmessmethode mittels digitaler Planimetrie unter Einbeziehung digitaler Skalierung und Segmentierung zu standardisieren. Dieser Ansatz behebt den Mangel an detaillierten Schritt-für-Schritt-Methoden für eine genaue Wundbewertung. Es wurde eine Fotodokumentationskabine entworfen und gebaut, und computergestützte digitale Planimetrie-Tools wurden eingesetzt, um die Variabilität bei der Messung des Wundbereichs, des Umfangs und des Abstands von der Wundmitte zu ihren Rändern zu minimieren. Bei männlichen CD1-Mäusen (n = 4, 10 Wochen alt, 30-35 g) wurde eine kreisförmige traumatische Wunde (5 mm Durchmesser) an der dorsalen Mittellinie auf Höhe des Schulterblatts erzeugt. Die Entwicklung der Wunde wurde 14 Tage lang mit der speziell angefertigten Fotokabine fotografdokumentiert, die die Lichtverhältnisse, die Brennweite und die Positionierung des Motivs steuerte. Skalierungs- und Wundmessungen wurden durch Segmentierung in der ImageJ-Software durchgeführt, und die statistische Analyse wurde mit der statistischen Analysesoftware durchgeführt. Die Kinetik des Wundverschlusses zeigte eine leichte Zunahme der Wundgröße und des Wundumfangs zwischen Tag 0 und Tag 2, gefolgt von einer allmählichen Abnahme bis zum vollständigen Verschluss am Tag 14. Die Fotodokumentationskabine und die computergestützte digitale Planimetrie ermöglichten quantitative Messungen mit minimaler Variabilität. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Werkzeuge eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Bewertung der Wundverschlusskinetik in präklinischen Modellen bieten.
Die traumatische Wundheilung dauert etwa 21 Tage und besteht aus einer genau definierten Abfolge von vier verschiedenen Phasen: (1) Hämostase, (2) Entzündung, (3) Proliferation und (4) Umbau1. Wenn eine Phase der Wundheilung verlängert wird, kann dies zur Entwicklung chronischer Wundenführen 1. Aufgrund ihrer hohen Prävalenz, ihrer potenziellen Komplikationen2 und ihrer erheblichen wirtschaftlichen Belastung gelten sie als globales Gesundheitsproblem.
Präklinische Studien zielen darauf ab, eine schnellere Heilung zu erreichen, indem sie eine umfassende Wundreepithelisierungfördern 3,4,5, Komplikationen verhindern und die Behandlungskosten senken. Diese Studien bewerten verschiedene Strategien, einschließlich der Entwicklung von Biomaterialien, pharmakologischen Interventionen und anderen Verfahren der regenerativen Medizin 6,7,8,9.
Für die Untersuchung traumatischer Wunden wurden mehrere experimentelle Modelle entwickelt. Einige konzentrieren sich auf makroskopisch sichtbare qualitative Merkmale wie Größe, Entzündungsindikatoren, Vorhandensein von Granulationsgewebe, Sekreten und Schorfbildung5. Andere analysieren quantitative Daten, einschließlich Fläche, Umfang, Radius, Durchmesser, Farbe, Tiefe und Abstände von der Mitte bis zu den Rändern von Wunden.
In diesem Zusammenhang wird bei den meisten in vivo-Untersuchungen der Wundradius und -tiefe direkt gemessen. Die manuelle Abgrenzung von Wundkanten in einem makroskopischen Bild kann jedoch zu Verzerrungen bei der Messungführen 10. Andere Studien verwenden mechanische Planimetrie unter Verwendung transparenter gerasterter Kunststoffplatten, bei denen die Wundränder zuvor abgegrenzt wurden; In beiden Fällen sind für die Ermittlung der Fläche oder des Umfangs manuelle Instrumente wie Lineale oder digitale Planimeter erforderlich. Heutzutage ermöglicht die computergestützte digitale Planimetrie die computergestützte Analyse von makroskopischen Bildern von Wunden oder Kunststoffplatten. Die In-situ-Manipulation und die Qualität des makroskopischen Bildes stellen eine Einschränkung dar, jedoch reduziert dieses Werkzeug 11,12,13,14 die Variabilität zwischen Flächen- und Umfangsmessungen erheblich.
Diese vorgeschlagene Methodik bietet signifikante Vorteile gegenüber bestehenden Techniken zur Bewertung des Wundverschlusses bei Mäusen 15,16,17,18,19,20. Während die Fotodokumentation als genaues und konsistentes Instrument zur Beurteilung der Wundverschlusskinetik angesehen wurde, haben frühere Studien21,22 die Grenzen der manuellen Wundmessung hervorgehoben, wie z. B. die Verzerrung des Beobachters und die Variabilität aufgrund inkonsistenter Beleuchtung und Kamerapositionierung. Der aktuelle Ansatz löst diese Probleme, indem er die Bildgebungsbedingungen durch eine speziell angefertigte Kabine standardisiert und so die Reproduzierbarkeit und Präzision verbessert. Darüber hinaus ermöglicht die computergestützte digitale Planimetrie genauere quantitative Bewertungen, verbessert die Bewertung therapeutischer Interventionen und minimiert Messfehler, wie in anderen Studien zum Vergleich manueller und digitaler Techniken gezeigtwurde 12,22, wodurch sie sich besonders für Studien zur Wundverschlusskinetik in Mausmodellen eignet und eine präzise Bewertung von Behandlungen ermöglicht, indem eine strenge Kontrolle über die Bildaufnahmebedingungen beibehalten wird.
Alle Versuchsverfahren mit Labormäusen wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards und Vorschriften durchgeführt, die im offiziellen mexikanischen Standard (NOM-062-ZOO-1999) für den Umgang und die Pflege von Labortieren festgelegt sind. Das Protokoll wurde vom Internen Ausschuss für die Pflege und Verwendung von Labortieren (CICUAL) des Nationalen Instituts für Kernforschung (ININ) unter der Referenznummer CICUAL-01-23 geprüft und genehmigt. In dieser Studie wurden männliche CD1-Mäuse (n = 4) im Alter von 10 Wochen mit einem Körpergewicht von 28-32 g verwendet. Alle Tiere wurden so ausgewählt, dass sie in Bezug auf Stamm, Alter, Geschlecht und Körpergewicht einheitlich waren und die Variabilität der Versuchsergebnisse minimiert wurde. Einzelheiten zu den verwendeten Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Bau einer Fotokabine für die Aufnahme von makroskopischen Bildern
HINWEIS: Für die Konstruktion einer Fotokabine wurde die lizenzierte SolidWorks Software (Version 2015) verwendet, um externe Lichtquellen zu eliminieren. Ein 40 cm × 40 cm großer Würfel wurde aus einem ein Zoll dicken weißen Aluminiumprofil konstruiert. Der Kubus bestand aus drei Abschnitten, die nacheinander zusammengesetzt wurden: dem Dach, den Seitenwänden und dem Boden (Abbildung 1A).
Abbildung 1: Schema für den Aufbau des makroskopischen Bildaufnahmeschranks. (A) Schnitte der Kabine (Dach, Seitenwände, Boden). (B)Ausrichtung der Profile, die das Dach bilden; vorne (A), hinten (B) und Seiten (Innenseite der Profile in rot "C,D"). (C) Dachpaneele 1 und 2, Installation des LED-Lichtrohrs, der Kameraobjektivplatte und der Bodeninstallation. (D) Installation der Anästhesiemaske (ROT), der Mausplattform (GRÜN) und der rechteckigen Plattform zur Positionierung des Messlineals (BLAU) auf der Referenzbasis. (E) Endgültige Position für die Referenzbasis. (F) Montage von Seiten-, Vorder- und Rückwänden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Erhaltung der Tiere
3. Traumatische Wundentstehung
4. Makroskopische Bilderfassung
5. Bildverarbeitung
Abbildung 2: Arbeitsablauf der Wundmessung mittels digitaler Planimetrie und Segmentierungstechniken. (A) Dermo-epidermale Inzision mit einem sterilen 5-mm-Biopsiestanzer. (B) Platzieren der Maus in einer inhalativen Anästhesiekammer für 3 Minuten. (C) Fotodokumentation durch Positionieren der anästhesierten Maus in der Fotokabine und Befestigen der Schnauze in einer Sevofluran-Maske. (D) Öffnen Sie das erhaltene Bild in ImageJ und skalieren Sie es mit dem Lineal als Referenz. (E) Extrahieren des Wundbereichs mit dem Rechteckwerkzeug. (F) Aufteilen des Bildes in RGB-Kanäle und Verarbeiten des Rotkanals. (G) Skizzierung und Verwaltung der Region of Interest (ROI). (H) Validierung der Segmentierung, indem der ROI mit der Wunde abgeglichen wird. (I) Messung der Wundparameter und Aufzeichnung der Ergebnisse für die statistische Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
6. Sterbehilfe nach dem Verfahren
HINWEIS: Die Studie endet nach 14 Tagen, zu diesem Zeitpunkt erreichen die Wunden bei gesunden Nagetieren in der Regel fortgeschrittene Stadien der Heilung. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Mäuse nach dem etablierten institutionell anerkannten Euthanasieverfahren human eingeschläfert.
Nach dem Skalieren der Bilder in der ImageJ-Software wurden der durchschnittliche Umfang (Tabelle 1) und die Fläche (Tabelle 2) der Wunden zusammen mit ihren jeweiligen Standardabweichungen durch digitale Segmentierung ermittelt. Diese Werte wurden vom Tag Null bis zum vierzehnten Tag (D0-D14) aufgezeichnet.
Tag | Umfang (mm) |
In präklinischen Modellen steht die quantitative Analyse der Entwicklung traumatischer Wunden in präklinischen Modellen vor Herausforderungen aufgrund von Faktoren wie Wundgröße, lokalisierte Entzündungsreaktion34, Lokalisation und/oder Manipulation. Für diese Messungen gibt es direkte manuelle36 und indirekte digitale11,16,37,38 ...
Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Forschung gibt.
Die Autoren danken dem Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías (CONAHCyT, CVU: 933600) für die Bereitstellung von Mitteln und dem Laboratorio Nacional de Investigación y Desarrollo de Radiofármacos del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (LANIDER-ININ) für ihre Unterstützung. Darüber hinaus wurde Abbildung 2 mit Hilfe der BioRender-Software (2020) erstellt, die unter BioRender.com/p67z056 verfügbar ist.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
5 mm Biopsy Punch | MILTEX, USA | 33-35 | To mark the wound edges |
Aluminum with polyethylene core | Alucobond,USA | Bright Silver 119 | For the construction of the macroscopic Image Acquisition Booth |
Camera Lens | Sony, Japan | SEL2470Z | To focus the images to photograph |
Electrocautery | Bonart, USA | ART-E1 | To eliminates bleeding points in the wound if present. |
Hook and loop fastener strips | VELCRO | ||
IBM SPSS Statistics Version 22 | IBM Corporation, USA | https://www.ibm.com/analytics/spss-statistics | Used for statistical analysis of wound measurements, including area and perimeter data. |
ImageJ Version 1.53t | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | Used for processing macroscopic images, including scaling, segmentation, and measurement of wound parameters. |
Ketorolac | SIEGFRIED RHEIN, Mexico | 493977 | For postoperative pain management |
Miltex Iris Scissors, 4-1/8" Curved | MILTEX, USA | V95-306 | To cut the wound flap generated with the biopsy punch |
RGB LED Light Tube | ANDOER, China | B09F8RLMSY | To illuminate the Macroscopic Image Acquisition Booth |
Semi profesional camera | Sony, Japan | DSC-HX300 | To take the photos |
Serrated Forceps | MILTEX, USA | V96-118 | To hold the flap during the cut |
Sevoflurane | Baxter, USA | AMX2L9117PR | For inhaled anaesthesia |
Sodium Pentobarbital | Aranda, Mexico | 734.448.001.212 | For intraperitoneal anaesthesia |
SolidWorks Version 2015 | Dassault Systèmes, France | https://www.solidworks.com/ | Used to design and create 3D models for constructing accessories for the photodocumentation booth. |
Surgical blades | HERGOM, Mexico | H10 | To shave the hair in the area where the wound will be created |
Transparent Adhesive Dressing | 3M, USA | F51CA07 | To cover the traumatic wound |
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