EdU標識を用いたアピカルアウト腸オルガノイドの作製とオルガノイド増殖速度の評価

要約

ここでは、標準的なマトリックス包埋オルガノイド培養物からアピカルアウト腸オルガノイドを生成するためのプロトコールについて説明します。また、その後の活発増殖細胞へのEdUの組み込みと、EdU陽性細胞の半自動定量についても概説します。

要約

ここでは、ハイドロゲル包埋腸オルガノイド培養物からアピカルアウト腸オルガノイドのフローティング培養物の生成について説明します。同時に、アピカルアウトオルガノイドとベイサルアウトオルガノイドを直接比較するために、フローティングベースアウトオルガノイド培養が確立されます。その後、アピカルアウトオルガノイドとベイサルアウトオルガノイドをチミジンアナログ5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)にかけ、細胞分裂のS期に新たに合成されたDNAに組み込まれます。このDNAへの取り込みは、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて、形態学的に無傷のオルガノイドで可視化することができます。Hoechst33342およびEdUで標識された細胞は、画像解析ソフトウェアを使用して半自動で定量されます。全細胞数に占めるEdU陽性細胞の割合を計算することで、三次元(3D)オルガノイドにおける細胞増殖の解析が可能になります。ここでは腸管オルガノイドの増殖の解析に使用されていますが、このプロトコルは、他のオルガノイドや二次元細胞培養におけるさまざまな種類の核特異的染色の解析にも適用できます。

概要

腸オルガノイドは、異なる細胞タイプからなる腸上皮を再現した三次元のin vitroモデルです。これらのオルガノイドは、腸管陰窩から単離された成体幹細胞から容易に樹立できます¹。オルガノイドはin vivo上皮にはるかに近いため、生物医学研究においてますます重要性を増しています。腸のオルガノイドは、生理学的メカニズム(腸内ニッチシグナル伝達^2,3や細胞分化^4,5など)の解析だけでなく、感染症^の研究6,7にも利用されています。しかし、中央の内腔を囲む3Dで分極細胞を増殖させることは、頂端細胞表面がオルガノイド内腔内でアクセスできなくなるため、困難です。細胞表面の頂端部と基底外側の細胞表面の違いを調べることは、脂肪酸の取り込みの違い⁸や感染症の研究^{9、10、11、12}に代表されるように、代謝研究において重要になり得る。

いわゆるアピカルアウトオルガノイドの作製は、この問題を克服するための簡単な選択肢です。標準的なオルガノイド培養物(すなわち、基底アウト、マトリックス包埋オルガノイド)から細胞外マトリックスを除去し、これらのオルガノイドをマトリックスフリー培地に播種することにより、極性スイッチ^{を誘発することができる}9。

以前に発表したように、ほとんどのオルガノイドは12時間以内に極性を反転させます。しかし、90%を超えるアピカルオルガノイドを含む培養物を得るには、48〜72時間かかります。アピカルアウトオルガノイドは、頂端細胞表面へのアクセスを可能にするという利点にもかかわらず、極性反転後に増殖が有意に減少し、細胞死率は増加します¹³。増殖活性の因子は、さまざまな分析で交絡変数を表す可能性があるため、実験を設計する際には留意する必要があります。

ここでは、腸内アピカルアウトオルガノイド培養を確立するための詳細なプロトコルと、ダウンストリーム分析のためのフローティングベースアウトコントロールオルガノイドを紹介します。さらに、新たに合成されたDNAに組み込まれ、活発に増殖する細胞をマークする5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)による標識についても説明します。さらに、EdU⁺ 細胞の定量化によるソフトウェアarivis Pro(Zeiss)を使用したオルガノイドの増殖速度の半自動画像解析について説明します。このプロセスの概略図を 図 1 に示します。

プロトコル

Kramer et al., 2020¹⁴ に従って確立されたイヌ由来の成体幹細胞由来腸オルガノイドを使用しました。施設倫理委員会のガイドラインに基づき、治療的切除または死後に収集された組織材料の使用は、すべての患者所有者が署名した大学の「治療に対する所有者の同意」に含まれています。

1. オルガノイド培養

1. 24ウェルプレートの基底膜抽出物(BME)マトリックスに埋め込まれた成体幹細胞由来の腸オルガノイドを培養し、ガラスピペットを使用して機械的に分割します(Pleguezuelos et al., 2020,¹⁵)。
   注:ここで説明するプロトコルでは、GeltrexをBMEとして使用しました。
2. BMEに包埋されたオルガノイドから精製された培地(表1)を慎重に取り出します。
3. ウェルあたり500 μLの0.05 % トリプシン-EDTAを添加し、ピペッティングを繰り返してすべてのマトリックスドームをウェルから取り外します。オルガノイドを15 mLチューブに移し、再懸濁してハイドロゲルマトリックスを完全に解離させます。
4. オルガノイドを0.05 % トリプシン-EDTAと0.05 % トリプシン-EDTAと水浴中でインキュベートし、すべてのオルガノイドが単一細胞または小さな細胞クラスターに解離するまでインキュベートします。
5. トリプシン/細胞懸濁液を基礎培地で希釈します(表1)。トリプシンの少なくとも2倍の基礎培地を使用してください。.
6. 細胞を8°C、420 × g で5分間遠心分離します。上清をできるだけ取り除きます。
7. ステップ1.3でトリプシン化に使用したのと同じ数のウェルにBMEに埋入されたシード細胞。精製された媒体を供給します(表1)。
8. 細胞培養インキュベーターで細胞を3日間インキュベートし、ステップ2.1に進みます。

2. 極性反転の誘導とEdUラベリング

1. BMEに埋め込まれたオルガノイドから培地を慎重に取り出します。
2. 各ウェルに500 μLのオルガノイド回収溶液を加え、ピペッティングを繰り返してすべてのマトリックスドームをウェルから取り外します。オルガノイドを15 mLチューブに移し、再懸濁してハイドロゲルマトリックスを完全に解離させます。
3. 15 mLチューブを氷上で1.5時間インキュベートします。オルガノイドの凝集を防ぎ、残りのヒドロゲル成分が均一に解離するように、チューブを10分ごとによく振ってください。
4. インキュベーション中に、96ウェルプレートを付着防止溶液でコーティングします。ステップ1.3でトリプシン処理した24ウェルプレートの各ウェルについて、96ウェルプレートの8ウェルをコーティングします。室温(RT)で少なくとも1時間インキュベートします。
5. 使用したオルガノイド回収液の少なくとも2倍のPBSを15 mLチューブに加え、8°C、150 × g で5分間遠心分離します。
6. 上清を取り除き、オルガノイドを1 mLのPBSに再懸濁します。
7. オルガノイド/PBS懸濁液500 μLを別の15 mLチューブに移し、両方のチューブを再び8°C、150 × g で5分間遠心分離します。
8. 96ウェルプレートからすべての付着防止液を取り除きます。
9. 遠心分離後は、上清をできるだけ取り除いてください。
10. チューブの1つはフローティングベースアウト(BO)オルガノイドの生成に使用し、もう1つのチューブはアピカルアウト(AO)オルガノイドの生成に使用します。
11. BOオルガノイドの場合は、96ウェルプレートのウェルあたり7.5%BMEを含む精製培地100μLを1本のチューブに加えます。よく混合し、プレコートされた96ウェルプレートの所望のウェル数にオルガノイドを均等に分散させます。
12. AOオルガノイドの場合は、96ウェルプレートのウェルあたり100 μLのプレーン精製培地(BMEを添加していない)をもう一方のチューブに加えます。よく混合し、プレコートされた96ウェルプレートの所望のウェル数にオルガノイドを均等に分散させます。
13. オルガノイドを37°Cおよび5%CO₂で3日間インキュベートします。
    注:形態学的な違いは、1日目以降に見え始めます。しかし、以前に発表された結果によると、大多数のオルガノイドがアピカルアウト極性を示すのに約3日かかることが示されています¹³。
14. 極性反転の誘導後24時間/48時間/72時間後など、定義された時点で、精製培地で希釈した3 μM EdUを50 μLを標識するオルガノイドのすべてのウェルに加え、各ウェルに1 μM EdUの最終濃度を注入します。
15. 37°Cおよび5%CO₂ で1.5時間インキュベートします_。
16. EdU標識オルガノイドをワイドボアチップで回収し、15 mLチューブに移します。
17. 各チューブに同量の4%PFA(BOおよびAOオルガノイド、PFAの最終濃度= 2%)を加え、慎重に混合します。
18. 室温で15分間インキュベートします。
19. 15 mLチューブに容量があるため、PBSの量を少なくとも2倍追加し、8°C、80 × g で5分間遠心分離します。
20. 上清を取り除き、オルガノイドを1 mLのPBSに再懸濁します。
21. 再度、8°C、80 × g で5分間遠心分離します。
22. 上清を取り除き、オルガノイドを1 mLのPBSに再懸濁し、1.5 mLのチューブに移します。オルガノイドは、EdU染色反応を行うまで4°Cで保存します(セクション3を参照)。
23. 分析するすべての時点について、手順 2.14 から 2.22 を繰り返します。

3. Click-it EdU 染色反応と Hoechst 33342 染色

1. 固定オルガノイド(ステップ2.22)を1.5 mLチューブに入れ、4°C、50 × g で5分間遠心分離します。
2. 上清を取り除き、幅広の穴の先端を使用してPBSで希釈した3%ウシ血清アルブミン(BSA)1 mLにオルガノイドを再懸濁します。
3. 手順3.1を繰り返します。および3.2(洗浄ステップ)。
4. 上清を取り除き、PBSで希釈した0.5% Triton X-100 1 mLにオルガノイドを再懸濁します。
5. 室温で20分間インキュベートします。
6. オルガノイドを室温で50 × g で5分間遠心分離します。
7. 新しいチューブで、45 μLのH₂Oと5 μLの10x Buffer Additiveを混合して、1x Buffer Additiveを調製します。
8. 別のチューブで、次の成分を混合して反応カクテルを調製します:385.8 μLのH₂O、43 μLの10x Reaction Buffer、20 μLのCuSO₄、_1.2 μLのAlexa Fluor 647アジド、および50 μL o 1xバッファー添加剤(ステップ3.7から)。
   注:この混合物は5つの反応に十分であり、必要な染色反応の数に応じてスケールアップおよびスケールダウンできます。
9. 手順3.1を繰り返します。および 3.2.2回(洗浄ステップ)。
10. 上清を取り除き、オルガノイドを含む各チューブに100 μLのリアクションカクテル(ステップ3.8.)を加えます。
11. 暗闇の中でRTで30分間インキュベートします。
12. 手順3.1を繰り返します。および3.2(洗浄ステップ)。
13. オルガノイドを50 × g でRTで5分間遠心分離します。
14. オルガノイドをPBSで希釈した10 μg/mL Hoechst33342 1 mLに再懸濁します。
15. 暗闇の中でRTで45分間インキュベートします。
16. 手順3.1を繰り返します。および3.2(洗浄ステップ)。
17. オルガノイドを50 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
18. 選択したBMEマトリックス中のオルガノイドを共焦点顕微鏡法に適合したスライドに播種します(例:μ-Slide 18ウェル)
19. 共焦点顕微鏡下でオルガノイドを画像化します。

4. 半自動画像解析

注:この解析には、arivis Proバージョン4.2.2(画像解析ソフトウェア)を使用しました。

1. 共焦点顕微鏡の画像を画像解析ソフトウェアにインポートし、解析ファイルを保存するフォルダを定義します。「 画像をタイムポイントとして 」オプションを使用して、複数の画像をインポートします(画像の複製、異なるタイムポイント、異なる処理など)。その後、各画像は 1 つの時点として扱われるため、個々の画像間で簡単に移動できます。
2. 解析パネルを開き、 Supplementary File 1 (arivis_EdU_pipeline) として提供されている解析パイプラインをインポートします。
3. 「新規オブジェクト配置」ツールと「球体」に「オルガノイド」のタグを付けると、十分に分離されたすべてのオルガノイドを簡単に囲むことができます。
4. 次の画像、つまり次の時点に切り替えて、すべての画像のオルガノイドのマークに進みます。
5. オルガノイドが互いに非常に近く、 したがって球 体モードを使用して分離できない場合は、オブジェクトリストを開き、 オルガノイドタグをアクティブにします。
6. ポリゴンモードでオブジェクトの描画ツールを続けて使用し、オルガノイドの輪郭を手でマークします。
   注:オブジェクトリストでは、すべてのオルガノイドがマークされ、特定の時点に割り当てられます。この時点は、手順 4.1 でインポートした画像の順序に対応します。これらの時点は、必要に応じて元の画像名と一致するように名前を変更できるようになりました。
7. オブジェクトリストで、すべてのオブジェクト(=オルガノイド)をマークして右クリックし、[ タグの削除 ]をクリックして、すべてのオブジェクトから 手動 タグを削除します。
8. オブジェクトリストのオルガノイドタグを非アクティブにし、ポリゴンモードのオブジェクト描画ツールを使用して、以前に定義したオブジェクト内の分析から除外する必要があるすべての領域をマークします。これらの領域には、オルガノイド内腔内の死んだ細胞やぼやけた領域が含まれる場合があり、分析を歪める可能性があります。
9. オブジェクトリストを開くときは、すべてのオルガノイドが オルガノイド タグ付きでリストされていること、および除外する必要があるすべての領域に 手動タグが付いていることを確認してください。
10. 左上のパネルにある矢印をクリックして、解析パイプラインを開始します。
    注:ソフトウェアは、Hoechst33342チャネルとEdUチャネルのすべての核をセグメント化しました。この解析パイプラインでは、セグメント化された Hoechst33342⁺ および EdU⁺ 核のサイズが 15 μm² より大きい (つまり、核セグメントの面積) ことのみを考慮し、死細胞に由来する可能性が最も高い小さな核が解析から除外されるようにします。
11. オブジェクトリストで解析結果を見つけるには、[ フィーチャ列 ]タグをクリックします。
12. マスターディテールビューに切り替えて、上部パネルのオルガノイドタグと機能「First Timepoint」を選択します。
13. 下部パネルで、オルガノイドごとに表示する特徴を選択します。 投影(x / y / z)エリア(ボクセル)、平均強度#1(EdUチャネル)、および SD強度#1を使用します。
14. Excelのエクスポート機能を使用して、結果(マスター詳細レポート)をエクスポートします。
15. 解析ファイルを保存し、ソフトウェアを閉じます。

5. オルガノイド増殖速度の測定

1. 手順4.14でエクスポートした マスター詳細レポート ファイルを開きます。
2. 分析された画像ごとに 1 つの個別のタブがあります。各画像の原子核とEdU染色の面積/ボクセル和を計算します。次に、結果のすべてのデータを新しい集合タブにコピーし、同じ時点を参照するすべてのデータをグループ化します。
3. 次に、各画像の細胞核の総面積(つまり、Hoechst33342⁺ 面積とEdU⁺ 面積の合計)を計算します。
4. 続いて、総面積をそれ自体で割り(= 100%)、平均EdU ⁺ 面積を総面積(= EdU ⁺ DNAの割合)で割ります。
5. BOオルガノイドとAOオルガノイドの増殖性DNAの割合をy軸に、x軸に異なる時点をプロットします。

結果

トリプシン処理後3日間培養したオルガノイドは、図2Aに示すように、理想的には50〜250μmである必要があります。これよりもかなり大きいオルガノイドは、極性を効率的に反転させない可能性があります。より大きなオルガノイドも出芽を開始する可能性があり、これらのオルガノイドは効率的な極性反転にも問題があることに?...

ディスカッション

このプロトコールでは、標準的な成体幹細胞由来の腸オルガノイド培養において極性反転を誘導する方法を詳細に説明しています。アピカルアウトオルガノイドは、通常、オルガノイド内腔に向けられた頂端細胞表面にアクセスする目的を果たします。頂端表面をプローブできることは、in vivoの生理学的条件下ですべての消化管内容物にさらされる細胞膜の?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Biologix	07-6024
[Leu15]-Gastrin I human, ≥95% (HPLC)	Sigma-Aldrich	G-9145
µ-Slide 18 Well Glass Bottom	ibidi	81817
100X Penicillin-Streptomycin supplement for Media	Gibco/Thermo	15140122
A 83-01	Tocris Bioscience	2939/10
Anti-Adherence Rinsing Solution	StemCell Technologies	7010
arivis Pro	Zeiss	Version 4.2.2
B27 SerumFree Supplement (50X), liquid	Gibco/Thermo	17504044
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)	Abcam	ab145597
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye	Thermo Scientific	C10340
DMEM-F12	Gibco/Thermo	11320033
Geltrex	Gibco/Thermo	A1413202
GlutaMAX Supplement	Gibco/Thermo	35050061
HEPES Buffer Solution 1 M, liquid	Gibco/Thermo	15630056
Human FGF-basic	PeproTech	100-18B-100µG
Human HGF	PeproTech	100-39-100µG
Human IGF-I	PeproTech	100-11-100µG
Human NOGGIN (Mammalian)	PeproTech	120-10C-200µG
N-Acetyl-L-cysteine,cell culture tested, BioReagent	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Organoid Harvesting Solution	Thermo	C10340
Triton(TM) X-100,for molecular biology	Sigma-Aldrich	T8787-250ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco/Thermo	25300054