정점 아웃 장 오가노이드 생성 및 EdU-라벨링을 사용한 오가노이드 증식 속도 평가

요약

여기에서는 표준 매트릭스 내장 오가노이드 배양에서 정점 아웃 장 오가노이드를 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 활발하게 증식하는 세포에 EdU를 통합하고 EdU 양성 세포의 반자동 정량화를 간략하게 설명합니다.

초록

여기에서는 하이드로겔이 내장된 장 오가노이드 배양물에서 정점 밖으로 나온 장 오가노이드의 부유 배양 생성에 대해 설명합니다. 동시에, apical-out과 basal-out 오가노이드를 직접 비교하기 위해 floating basal-out 오가노이드 배양이 확립됩니다. 정점 아웃 오가노이드 및 기저 아웃 오가노이드는 세포 분열의 S기 동안 새로 합성된 DNA에 통합된 티미딘 유사체 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)에 노출됩니다. DNA에 대한 이러한 통합은 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 형태학적으로 온전한 오가노이드에서 시각화할 수 있습니다. Hoechst33342 및 EdU로 라벨링된 세포는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 반자동 방식으로 정량화됩니다. 전체 세포 수 중 EdU 양성 세포의 비율을 계산하면 3차원(3D) 오가노이드에서 세포 증식을 분석할 수 있습니다. 장 오가노이드의 증식 분석에 사용되기는 하지만, 이 프로토콜은 다른 오가노이드 또는 2차원 세포 배양에서 다양한 종류의 핵 특이적 염색 분석에도 적용할 수 있습니다.

서문

장 오가노이드(intestinal organoid)는 다양한 세포 유형으로 구성된 장 상피를 요약한 3차원 체외 모델입니다. 이러한 오가노이드는 장샘(intestinal crypt)에서 분리된 성체 줄기세포에서 쉽게 확립할 수 있습니다¹. 오가노이드는 생체 내 상피에 훨씬 더 가깝기 때문에 생물 의학 연구에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 장의 오가노이드는 생리학적 메커니즘 분석(예: 장 틈새 신호^{전달 2,3} 및 세포 분화 ^4,5)뿐만 아니라 감염성 질환 연구^6,7에도 사용됩니다. 그러나 중심 내강을 둘러싸고 있는 3D에서 편광 세포를 성장시키는 것은 정점 세포 표면이 오가노이드 내강 내에서 접근할 수 없기 때문에 어렵습니다. 정점 세포 표면과 기저측 세포 표면의 차이를 조사하는 것은 지방산 흡수의 차이⁸ 및 감염성 질환 연구^{의 차이} 9,10,11,12에서 알 수 있듯이 대사 연구에서 중요할 수 있습니다.

소위 정점 제거 오가노이드(apical-out organoid)를 생성하는 것은 이 문제를 극복할 수 있는 쉬운 옵션입니다. 표준 오가노이드 배양액(즉, 기저 외출, 매트릭스 내장 오가노이드)에서 세포외 기질을 제거하고 이러한 오가노이드를 매트릭스가 없는 배지에 시딩함으로써 극성 전환을 유도할 수 있습니다⁹.

이전에 발표한 바와 같이 대부분의 오가노이드는 12시간 이내에 극성을 반전시킵니다. 그러나 90% 이상의 정점-오가노이드가 있는 배양을 얻는 데 48-72시간이 걸립니다. 정점 세포 표면에 접근할 수 있다는 장점에도 불구하고, 정점 아웃 오가노이드는 극성 반전 후 증식이 현저히 감소하는 반면 세포 사멸률은 증가한다¹³. 증식 활동의 요인은 다양한 분석에서 혼란스러운 변수를 나타낼 수 있으므로 실험을 설계할 때 염두에 두어야 합니다.

여기에서는 다운스트림 분석을 위해 장 정점 출력 오가노이드 배양 및 부유 기저 출력 제어 오가노이드를 확립하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 또한, 새로 합성된 DNA에 통합된 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)으로 표지하여 활발하게 증식하는 세포를 표시합니다. 또한 EdU⁺ 세포의 정량화를 통해 arivis Pro(Zeiss) 소프트웨어를 사용하여 오가노이드의 증식 속도에 대한 반자동 이미지 분석에 대해 설명합니다. 프로세스의 개략도는 그림 1에 요약되어 있습니다.

프로토콜

Kramer et al., 2020¹⁴ 에 따라 확립된 개의 성체 줄기세포 유래 장 오가노이드를 사용했습니다. 기관 윤리 위원회 지침에 따르면, 치료적 절제 또는 사후 검시 중에 수집된 조직 물질의 사용은 모든 환자 소유자가 서명한 대학의 '치료에 대한 소유자의 동의서'에 포함됩니다.

1. 오가노이드 배양

1. 선택한 기저막 추출물(BME) 매트릭스에 내장된 성체 줄기세포 유래 장 오가노이드를 24웰 플레이트에서 배양하고 Pleguezuelos et al., 2020,¹⁵에 자세히 설명된 대로 유리 피펫을 사용하여 기계적으로 분할합니다.
   참고: 여기에 설명된 프로토콜의 경우 Geltrex가 BME로 사용되었습니다.
2. BME가 함유된 오가노이드에서 정제된 배지(표 1)를 조심스럽게 제거합니다.
3. 웰당 500μL의 0.05% 트립신-EDTA를 추가하고 위아래로 반복해서 피펫팅하여 웰에서 모든 매트릭스 돔을 분리합니다. 오가노이드를 15mL 튜브로 옮기고 하이드로겔 매트릭스를 완전히 해리하기 위해 잘 재현탁합니다.
4. 모든 오가노이드가 단일 세포 또는 작은 세포 클러스터로 해리될 때까지 37°C의 수조에서 0.05% 트립신-EDTA로 오가노이드를 배양합니다.
5. 트립신/세포 현탁액을 기저 배지로 희석합니다(표 1). 트립신보다 최소 두 배 많은 기초 배지를 사용하십시오.
6. 8°C에서 420g에서 5분 동안 × 세포 를 원심분리 가능한 한 많은 상층액을 제거하십시오.
7. 1.3단계에서 트립신화에 사용된 만큼의 웰에서 BME에 내장된 종자 세포. 정제된 배지로 공급합니다(표 1).
8. 세포 배양 인큐베이터에서 3일 동안 세포를 배양하고 2.1단계를 진행합니다.

2. 극성 반전 및 EdU 라벨링 유도

1. BME가 포함된 오가노이드에서 배지를 조심스럽게 제거합니다.
2. 각 웰에 500μL의 오가노이드 회수 용액을 추가하고 위아래로 반복해서 피펫팅하여 웰에서 모든 매트릭스 돔을 분리합니다. 오가노이드를 15mL 튜브로 옮기고 하이드로겔 매트릭스를 완전히 해리하기 위해 잘 재현탁합니다.
3. 15mL 튜브를 얼음에서 1.5시간 동안 배양합니다. 10분마다 튜브를 잘 흔들어 오가노이드의 응집을 방지하고 남아 있는 하이드로겔 성분의 균일한 해리를 보장합니다.
4. 배양하는 동안 96웰 플레이트에 부착 방지 용액을 코팅합니다. 1.3단계에서 트립신화된 24웰 플레이트의 각 웰에 대해 96웰 플레이트의 8웰을 코팅합니다. 실온(RT)에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
5. 15 mL 튜브와 원심분리에 사용된 오가노이드 수확 용액보다 최소 2배 많은 PBS를 8°C에서 150 × g에서 5 분 동안 첨가 합니다.
6. 상층액을 제거하고 오가노이드를 PBS 1mL에 재현탁합니다.
7. 500μL의 오가노이드/PBS 현탁액을 별도의 15mL 튜브에 옮기고 두 튜브를 8°C에서 150× g 으로 5분 동안 다시 원심분리합니다.
8. 96웰 플레이트에서 모든 접착 방지 용액을 제거합니다.
9. 원심분리 후 가능한 한 많은 상층액을 제거하십시오.
10. 튜브 중 하나는 플로팅 기저 출력(BO) 오가노이드 생성에 사용하고 다른 튜브는 APICAL-out(AO) 오가노이드 생성에 사용합니다.
11. BO 오가노이드의 경우, 96웰 플레이트의 웰당 7.5% BME를 함유한 정제된 배지 100μL를 하나의 튜브에 추가합니다. 잘 혼합하고 사전 코팅된 96웰 플레이트의 원하는 웰 수에 걸쳐 오가노이드를 고르게 분산시킵니다.
12. AO 오가노이드의 경우, 96웰 플레이트의 웰당 100μL 일반 정제 배지(BME가 추가되지 않음)를 다른 튜브에 추가합니다. 잘 혼합하고 사전 코팅된 96웰 플레이트의 원하는 웰 수에 걸쳐 오가노이드를 고르게 분산시킵니다.
13. 오가노이드를 37°C 및 5% CO₂에서 3일 동안 배양합니다.
    참고: 형태학적 차이는 1일차 이후에 보이기 시작합니다. 그러나 이전에 발표된 결과에 따르면 대다수의 오가노이드가 정점 극성¹³을 나타내는 데 약 3일이 걸린다고 합니다.
14. 정의된 시점(예: 극성 반전 유도 후 24시간/48시간/72시간)에서 정제된 배지로 희석된 3μM EdU 50μL를 라벨링할 오가노이드의 모든 웰에 추가하여 각 웰에서 1μM EdU의 최종 농도를 받습니다.
15. 37 ° C 및 5 % CO₂ 에서 1.5 시간 동안 배양합니다_.
16. 광폭 팁을 사용하여 EdU 표지 오가노이드를 수집하고 15mL 튜브로 옮깁니다.
17. 각 튜브에 동일한 양의 4% PFA(BO 및 AO 오가노이드, PFA의 최종 농도 = 2%)를 첨가하고 조심스럽게 혼합합니다.
18. RT에서 15분 동안 배양합니다.
19. 15mL 튜브에 부피가 있는 PBS의 두 배 이상을 추가하고 8°C에서 80× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
20. 상층액을 제거하고 오가노이드를 PBS 1mL에 재현탁합니다.
21. 8°C에서 80×g으로 5 분 동안 다시 원심분리기를 합니다.
22. 상층액을 제거하고 PBS 1mL에 오가노이드를 재현탁시킨 후 1.5mL 튜브로 옮깁니다. EdU 염색 반응을 수행할 때까지 오가노이드를 4°C에서 보관합니다(섹션 3 참조).
23. 분석할 모든 시점에 대해 2.14-2.22단계를 반복합니다.

3. Click-it EdU 염색 반응 및 Hoechst 33342 염색

1. 1.5mL 튜브에서 4°C, 50×g에서 5 분 동안 고정된 오가노이드(단계 2.22)를 원심분리합니다.
2. 상층액을 제거하고 광폭 팁을 사용하여 PBS에서 희석된 3% 소 혈청 알부민(BSA) 1mL에 오가노이드를 재현탁합니다.
3. 3.1단계를 반복합니다. 및 3.2(세척 단계).
4. 상층액을 제거하고 PBS에 희석된 0.5% Triton X-100 1mL에 오가노이드를 재현탁합니다.
5. RT에서 20분 동안 배양합니다.
6. 50 × g 의 RT에서 5분 동안 원심분리기 오가노이드.
7. 새 튜브에서 45 μL의 H₂O와 5 μL의 10x 완충 첨가제를 혼합하여 1x 완충 첨가제를 준비합니다.
8. 다른 튜브에서 385.8 μL의 H₂O, 43 μL의 10x 반응 완충액, 20 μL의 CuSO _4,1.2 μL의 Alexa Fluor 647 아지드 및 50 μL o 1x 완충액 첨가제(단계 3.7)를 혼합하여 반응 칵테일을 준비합니다.
   참고: 이 혼합물은 5회 반응에 충분하며 필요한 염색 반응 수에 따라 확장 및 축소할 수 있습니다.
9. 3.1단계를 반복합니다. 및 3.2. 두 번(세탁 단계).
10. 상층액을 제거하고 100 μL의 반응 칵테일(단계 3.8)을 오가노이드가 있는 각 튜브에 추가합니다.
11. 어둠 속에서 30분 동안 RT에서 배양합니다.
12. 3.1단계를 반복합니다. 및 3.2(세척 단계).
13. 원심분리기 오가노이드를 50 × g 에서 RT에서 5분 동안 가열합니다.
14. PBS에 희석된 10μg/mL Hoechst33342 1mL에 오가노이드를 재현탁합니다.
15. 어둠 속에서 45분 동안 RT에서 배양합니다.
16. 3.1단계를 반복합니다. 및 3.2(세척 단계).
17. 50 × g 의 오가노이드를 4°C에서 5분 동안 원심분리기
18. 선택한 BME 매트릭스의 오가노이드를 컨포칼 현미경과 호환되는 슬라이드(예: μ-Slide 18 well)에 시딩합니다.
19. 컨포칼 현미경으로 오가노이드를 이미지화합니다.

4. 반자동 이미지 분석

참고: 이 분석을 위해 arivis Pro 버전 4.2.2(이미지 분석 소프트웨어)가 사용되었습니다.

1. 컨포칼 현미경 이미지를 이미지 분석 소프트웨어로 가져오고 분석 파일이 저장될 폴더를 정의합니다. 이미지를 시점으로 옵션을 사용하여 여러 이미지를 가져옵니다(사진 복제, 다른 시점, 다른 처리 등). 그런 다음 각 이미지는 단일 시점으로 처리되어 개별 이미지 간에 쉽게 이동할 수 있습니다.
2. 분석 패널을 열고 보충 파일 1(arivis_EdU_pipeline)로 제공된 분석 파이프라인을 가져옵니다.
3. Place New Objects 도구 및 Sphere를 Organoid 태그와 함께 사용하여 잘 분리된 모든 오가노이드를 쉽게 둘러쌀 수 있습니다.
4. 다음 이미지, 즉 다음 시점으로 전환하고 모든 이미지에 대해 오가노이드 표시를 진행합니다.
5. 서로 매우 가깝기 때문에 Sphere 모드를 사용하여 분리할 수 없는 오가노이드의 경우 개체 목록을 열고 오가노이드 태그를 활성화합니다.
6. 폴리곤 모드에서 개체 그리기 도구를 계속 사용하여 오가노이드 윤곽선을 직접 표시합니다.
   참고: 개체 목록에서 모든 오가노이드가 표시되고 특정 시점에 할당됩니다. 이 시점은 4.1단계에서 가져온 이미지의 순서에 해당합니다. 이제 원하는 경우 원래 이미지 이름과 일치하도록 이러한 시점의 이름을 바꿀 수 있습니다.
7. 개체 목록에서 모든 개체(=오가노이드)를 표시하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 Remove Tags(태그 제거 )를 클릭하여 모든 개체에서 Manual 태그를 제거합니다.
8. 개체 목록에서 Organoid 태그를 비활성화하고 폴리곤 모드에서 개체 그리기 도구를 사용하여 이전에 정의된 개체 내의 모든 영역을 분석에서 제외해야 하는 모든 영역을 표시합니다. 이러한 영역에는 오가노이드 내강 내의 죽은 세포 또는 흐릿한 영역이 포함될 수 있으며, 이로 인해 분석이 왜곡될 수 있습니다.
9. 개체 목록을 열 때 모든 오가노이드가 오가노이드 태그와 함께 나열되어 있고 제외해야 하는 모든 영역에 수동 태그가 있는지 확인합니다.
10. 왼쪽 상단 패널에 있는 화살표를 클릭하여 분석 파이프라인을 시작합니다.
    참고: 이제 소프트웨어가 Hoechst33342 및 EdU 채널의 모든 핵을 분할합니다. 이 분석 파이프라인은 크기가 15μm²(즉, 핵 분절의 면적)보다 큰 분절된 Hoechst33342⁺ 및 EdU⁺ 핵만 고려하여 죽은 세포에서 유래했을 가능성이 가장 높은 작은 핵이 분석에서 제외되도록 합니다.
11. 객체 목록에서 Feature Columns 태그를 클릭하여 분석 결과를 찾습니다.
12. 마스터 세부 정보 보기로 전환하고 상단 패널에서 오가노이드 태그와 첫 번째 시점 기능을 선택합니다.
13. 아래쪽 패널에서 오가노이드별로 표시할 기능을 선택합니다. 투영(x/y/z) 영역(복셀), 평균 강도 # 1(EdU 채널) 및 SD 강도 #1을 사용합니다.
14. Excel 내보내기 기능을 사용하여 결과(마스터 세부 정보 보고서)를 내보냅니다.
15. 분석 파일을 저장하고 소프트웨어를 닫습니다.

5. 오가노이드 증식 속도의 측정

1. 4.14단계에서 내보낸 마스터 상세 보고서 파일을 엽니다.
2. 분석된 각 이미지에 대해 하나의 별도 탭이 있습니다. 각 이미지에 대한 핵 및 EdU 염색에 대한 면적/복셀 합계를 계산합니다. 그런 다음 모든 결과 데이터를 새 집합체 탭에 복사하고 동일한 시점을 참조하는 모든 데이터를 그룹화합니다.
3. 그런 다음 각 이미지에 대한 세포핵의 총 면적(즉, Hoechst33342⁺ 면적과 EdU⁺ 면적의 합)을 계산합니다.
4. 그런 다음 전체 면적을 자체(=100%)로 나누고 평균 EdU⁺ 면적을 전체 면적(=EdU⁺ DNA의 백분율)으로 나눕니다.
5. BO 및 AO 오가노이드의 증식 DNA의 비율을 y축에 표시하고 x축에 다른 시점을 표시합니다.

결과

트립신화 후 3일 동안 성장한 오가노이드는 그림 2A와 같이 50-250μm가 이상적이어야 합니다. 이보다 상당히 큰 오가노이드는 극성을 효율적으로 역전시키지 못할 수 있습니다. 더 큰 오가노이드도 싹트기 시작할 수 있으며, 우리는 이러한 오가노이드가 효율적인 극성 반전에도 문제가 있을 수 있다는 것을 알게 되었습니다. Basal-out 및 ...

토론

이 프로토콜은 표준 성체 줄기 세포 유래 장 오가노이드 배양에서 극성 반전을 유도하는 방법을 자세히 설명합니다. 정점 아웃 오가노이드는 일반적으로 오가노이드 내강을 향하는 정점 세포 표면에 접근하는 목적을 제공합니다. 정점 표면을 조사할 수 있다는 것은 생체 내 생리학적 조건에서 모든 소화관 내용물에 노출되는 세포막의 일부이기 때문에 특정 응용 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Biologix	07-6024
[Leu15]-Gastrin I human, ≥95% (HPLC)	Sigma-Aldrich	G-9145
µ-Slide 18 Well Glass Bottom	ibidi	81817
100X Penicillin-Streptomycin supplement for Media	Gibco/Thermo	15140122
A 83-01	Tocris Bioscience	2939/10
Anti-Adherence Rinsing Solution	StemCell Technologies	7010
arivis Pro	Zeiss	Version 4.2.2
B27 SerumFree Supplement (50X), liquid	Gibco/Thermo	17504044
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)	Abcam	ab145597
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye	Thermo Scientific	C10340
DMEM-F12	Gibco/Thermo	11320033
Geltrex	Gibco/Thermo	A1413202
GlutaMAX Supplement	Gibco/Thermo	35050061
HEPES Buffer Solution 1 M, liquid	Gibco/Thermo	15630056
Human FGF-basic	PeproTech	100-18B-100µG
Human HGF	PeproTech	100-39-100µG
Human IGF-I	PeproTech	100-11-100µG
Human NOGGIN (Mammalian)	PeproTech	120-10C-200µG
N-Acetyl-L-cysteine,cell culture tested, BioReagent	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Organoid Harvesting Solution	Thermo	C10340
Triton(TM) X-100,for molecular biology	Sigma-Aldrich	T8787-250ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco/Thermo	25300054