Geração de organoides intestinais apicais e avaliação da taxa de proliferação de organoides usando marcação EdU

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar organoides intestinais apicais a partir de culturas organoides incorporadas à matriz padrão. Ele também descreve a incorporação subsequente de EdU em células de proliferação ativa e a quantificação semiautomática de células EdU-positivas.

Resumo

Aqui, descrevemos a geração de culturas flutuantes de organoides intestinais apicais a partir de culturas organoides intestinais embebidas em hidrogel. Ao mesmo tempo, culturas organoides basais flutuantes são estabelecidas para comparação direta entre organoides apicais e basais. Os organoides apicais e basais são subsequentemente submetidos ao análogo da timidina 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), que é integrado ao DNA recém-sintetizado durante a fase S da divisão celular. Essa incorporação ao DNA pode ser visualizada em organoides morfologicamente intactos usando microscopia confocal de varredura a laser. As células marcadas com Hoechst33342 e EdU são então quantificadas de maneira semiautomática usando software de análise de imagem. O cálculo da porcentagem de células EdU-positivas do número total de células permite a análise da proliferação celular em organoides tridimensionais (3D). Apesar de ser usado aqui para a análise de proliferação em organoides intestinais, o protocolo é aplicável à análise de colorações específicas do núcleo de vários tipos em outros organoides ou culturas de células bidimensionais também.

Introdução

Os organoides intestinais são modelos tridimensionais in vitro que recapitulam o epitélio intestinal compreendendo diferentes tipos de células. Esses organoides podem ser facilmente estabelecidos a partir de células-tronco adultas isoladas de criptas intestinais¹. Como os organoides estão muito mais próximos do epitélio in vivo, eles estão se tornando cada vez mais importantes na pesquisa biomédica. Os organoides do intestino não são usados apenas para a análise de mecanismos fisiológicos (por exemplo, sinalização do nicho intestinal ^2,3 e diferenciação celular ^4,5), mas também para pesquisas sobre doenças infecciosas ^6,7. No entanto, o crescimento de células polarizadas em 3D envolvendo um lúmen central é um desafio, pois a superfície da célula apical acaba inacessível dentro do lúmen organoide. Examinar as diferenças entre as superfícies celulares apicais e basolaterais pode ser importante em estudos metabólicos, como exemplificado por diferenças na captação de ácidos graxos⁸ e pesquisa de doenças infecciosas 9,10,11,12.

A geração dos chamados organoides apical-out é uma opção fácil para superar esse problema. Ao remover a matriz extracelular de culturas organoides padrão (ou seja, organoides basais e embutidos na matriz) e semear esses organoides em um meio livre de matriz, uma mudança de polaridade pode ser induzida⁹.

Como publicamos anteriormente, a maioria dos organoides inverte sua polaridade em 12 h. No entanto, são necessárias 48-72 h para obter uma cultura com mais de 90% de organoides apicais. Apesar de sua vantagem de permitir o acesso à superfície celular apical, os organoides apicais apresentam proliferação significativamente diminuída após a inversão da polaridade, enquanto as taxas de morte celular aumentam¹³. O fator de atividade proliferativa pode representar uma variável de confusão em várias análises e deve ser mantido em mente ao projetar um experimento.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para estabelecer culturas de organoides apicais intestinais e organoides de controle basais flutuantes para análises a jusante. Além disso, descrevemos a marcação com 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), incorporada ao DNA recém-sintetizado e, portanto, marca as células em proliferação ativa. Descrevemos ainda a análise semiautomática de imagens da taxa de proliferação dos organoides usando o software arivis Pro (Zeiss) por quantificação de células EdU⁺ . Um esquema do processo é descrito na Figura 1.

Protocolo

Foram utilizados organoides intestinais derivados de células-tronco adultas de cães, estabelecidos de acordo com Kramer et al., 2020¹⁴ . Com base nas diretrizes do comitê de ética institucional, o uso de material tecidual coletado durante a excisão terapêutica ou post-mortem está incluído no 'consentimento do proprietário para o tratamento' da universidade, que foi assinado por todos os proprietários dos pacientes.

1. Cultura organoide

1. Cultive organoides intestinais derivados de células-tronco adultas incorporados na matriz de extrato de membrana basal (BME) de escolha em placas de 24 poços e divida-os mecanicamente usando pipetas de vidro, conforme descrito em detalhes em Pleguezuelos et al., 2020¹⁵.
   NOTA: Para o protocolo aqui descrito, o Geltrex foi utilizado como BME.
2. Remova cuidadosamente o meio refinado (Tabela 1) dos organoides incorporados ao BME.
3. Adicione 500 μL de tripsina-EDTA a 0,05% por poço e retire todas as cúpulas da matriz do poço pipetando para cima e para baixo repetidamente. Transfira os organoides para um tubo de 15 mL e ressuspenda bem para dissociar totalmente a matriz de hidrogel.
4. Incubar organoides com 0,05% de tripsina-EDTA a 37 °C em banho-maria até que todos os organoides estejam dissociados em células individuais ou pequenos aglomerados de células.
5. Diluir a suspensão tripsina/célula com meio basal (Tabela 1). Use pelo menos duas vezes mais meio basal do que tripsina.
6. Centrifugar as células a 8 °C a 420 × g durante 5 min. Remova o máximo de sobrenadante possível.
7. Células-semente incorporadas em BME em tantos poços quanto foram usadas para tripsinização na etapa 1.3. e fornecê-los com meio refinado (Tabela 1).
8. Incubar as células durante 3 dias numa incubadora de cultura de células e prosseguir com o passo 2.1.

2. Indução de inversão de polaridade e marcação EdU

1. Remova cuidadosamente o meio dos organoides embutidos no BME.
2. Adicione 500 μL de solução de coleta de organoides a cada poço e separe todas as cúpulas da matriz do poço pipetando para cima e para baixo repetidamente. Transfira os organoides para um tubo de 15 mL e ressuspenda bem para dissociar totalmente a matriz de hidrogel.
3. Incube o tubo de 15 mL em gelo por 1,5 h. Agite bem o tubo a cada 10 minutos para evitar a aglomeração dos organoides e garantir a dissociação uniforme dos componentes restantes do hidrogel.
4. Durante a incubação, cubra uma placa de 96 poços com solução antiaderente. Para cada poço de uma placa de 24 poços tripsinizada na etapa 1.3., reveste 8 poços de uma placa de 96 poços. Incubar durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente (RT).
5. Adicione pelo menos duas vezes mais PBS do que a solução de colheita de organoide foi usada ao tubo de 15 mL e centrifugue a 8 ° C a 150 × g por 5 min.
6. Remova o sobrenadante e ressuspenda os organoides em 1 mL de PBS.
7. Transferir 500 μl da suspensão organoide/PBS num tubo separado de 15 ml e centrifugar ambos os tubos novamente a 8 °C a 150 × g durante 5 min.
8. Remova toda a solução antiaderente da placa de 96 poços.
9. Remover o máximo de sobrenadante possível após centrifugação.
10. Use um dos tubos para a geração de organoides basais flutuantes (BO) e o outro tubo para organoides apical-out (AO).
11. Para organoides BO, adicione 100 μL de meio refinado contendo 7,5% de BME por poço da placa de 96 poços a um tubo. Misture bem e disperse os organoides uniformemente pelo número desejado de poços da placa pré-revestida de 96 poços.
12. Para organoides AO, adicione 100 μL de meio refinado simples (sem adição de BME) por poço da placa de 96 poços ao outro tubo. Misture bem e disperse os organoides uniformemente pelo número desejado de poços da placa pré-revestida de 96 poços.
13. Incubar os organoides a 37 °C e 5% de CO₂ por 3 dias.
    NOTA: As diferenças morfológicas começarão a ser visíveis após o dia 1. No entanto, resultados publicados anteriormente mostram que leva cerca de 3 dias para que a grande maioria dos organoides apresente polaridade apical-out¹³.
14. Em pontos de tempo definidos, por exemplo, 24 h / 48 h / 72 h após a indução da inversão de polaridade, adicione 50 μL de 3 μM EdU diluído em meio refinado a todos os poços de organoides a serem marcados, para receber uma concentração final de 1 μM EdU em cada poço.
15. Incubar a 37 °C e 5% de CO₂ por 1,5 h_.
16. Colete organoides marcados com EdU usando pontas de furo largo e transfira-os para um tubo de 15 mL.
17. Adicione uma quantidade igual de 4% de PFA a cada tubo (organoides BO e AO; concentração final de PFA = 2%) e misture cuidadosamente.
18. Incubar em RT por 15 min.
19. Adicione pelo menos o dobro da quantidade de PBS conforme houver volume no tubo de 15 ml e centrifugue a 8 °C a 80 × g durante 5 min.
20. Remova o sobrenadante e ressuspenda os organoides em 1 mL de PBS.
21. Centrifugar novamente a 8 °C a 80 × g durante 5 min.
22. Remova o sobrenadante, ressuspenda os organoides em 1 mL de PBS e transfira-os para um tubo de 1,5 mL. Conservar os organoides a 4 °C até realizar a reação de coloração EdU (ver secção 3).
23. Repita as etapas 2.14-2.22 para cada ponto de tempo a ser analisado.

3. Reação de coloração Click-it EdU e coloração Hoechst 33342

1. Centrifugar os organoides fixos (do passo 2.22.) num tubo de 1,5 ml a 4 °C a 50 × g durante 5 min.
2. Remova o sobrenadante e ressuspenda os organoides em 1 mL de albumina de soro bovino a 3% (BSA) diluída em PBS usando pontas de calibre largo.
3. Repita as etapas 3.1. e 3.2 (etapas de lavagem).
4. Remova o sobrenadante e ressuspenda os organoides em 1 mL de Triton X-100 a 0,5% diluído em PBS.
5. Incubar em RT por 20 min.
6. Centrifugar organoides em RT a 50 × g por 5 min.
7. Em um tubo novo, prepare 1x Buffer Additive misturando 45 μL de H₂O com 5 μL de 10x Buffer Additive.
8. Em outro tubo, prepare o Coquetel de Reação misturando os seguintes componentes: 385,8 μL de H₂O, 43 μL de Tampão de Reação 10x, 20 μL de CuSO _4,1,2 μL de azida Alexa Fluor 647 e 50 μL o Aditivo Tampão 1x (da etapa 3.7.).
   NOTA: Esta mistura é suficiente para cinco reações e pode ser ampliada e reduzida de acordo com o número necessário de reações de coloração.
9. Repita as etapas 3.1. e 3.2. duas vezes (etapas de lavagem).
10. Remova o sobrenadante e adicione 100 μL de coquetel de reação (etapa 3.8.) em cada tubo com organoides.
11. Incube em RT por 30 min no escuro.
12. Repita as etapas 3.1. e 3.2 (etapas de lavagem).
13. Centrifugar organoides a 50 × g durante 5 min a RT.
14. Ressuspender organoides em 1 mL de 10 μg/mL Hoechst33342 diluído em PBS.
15. Incubar em RT por 45 min no escuro.
16. Repita as etapas 3.1. e 3.2 (etapas de lavagem).
17. Centrifugar organoides a 50 × g durante 5 min a 4 °C.
18. Semente de organoides na matriz BME de escolha em uma lâmina compatível com microscopia confocal (por exemplo, poço μ-Slide 18)
19. Organoides de imagem sob um microscópio confocal.

4. Análise de imagem semiautomática

NOTA: Para esta análise, foi utilizado o arivis Pro versão 4.2.2 (software de análise de imagem).

1. Importe as imagens do microscópio confocal para o software de análise de imagem e defina uma pasta na qual o arquivo de análise será salvo. Use a opção Imagens como pontos de tempo para importar várias imagens (replicar imagens, diferentes pontos de tempo, diferentes tratamentos etc.). Cada imagem será então tratada como um único ponto de tempo, permitindo uma fácil mudança entre as imagens individuais.
2. Abra o painel de análise e importe o pipeline de análise fornecido como Arquivo Suplementar 1 (arivis_EdU_pipeline).
3. Use a ferramenta Inserir novos objetos e Esfera com a tag Organoid para circundar facilmente todos os organoides bem separados.
4. Mude para a próxima imagem, ou seja, o próximo ponto de tempo, e prossiga para marcar organoides para todas as imagens.
5. Para organoides que estão muito próximos uns dos outros e, portanto, não podem ser separados usando o modo Sphere , abra a lista de objetos e ative a tag Organoid.
6. Continue usando a ferramenta Desenhar objetos no modo Polígono para marcar contornos organoides manualmente.
   NOTA: Na lista de objetos, todos os organoides agora são marcados e atribuídos a um ponto de tempo específico. Este ponto de tempo corresponde à ordem das imagens importadas na etapa 4.1. Esses pontos de tempo agora podem ser renomeados para corresponder ao nome da imagem original, se preferir.
7. Na lista de objetos, marque todos os objetos (=organoides) e clique com o botão direito do mouse e clique em Remover tags para remover a tag manual de todos os objetos.
8. Desative a tag Organoid na lista de objetos e marque todas as áreas dentro de objetos previamente definidos que devem ser excluídas da análise usando a ferramenta Desenhar objetos no modo Polígono . Essas áreas podem incluir células mortas dentro do lúmen organoide ou áreas borradas, o que pode distorcer a análise.
9. Ao abrir a lista de objetos, certifique-se de que todos os organoides estejam listados com a tag Organoid e que todas as áreas que devem ser excluídas tenham a tag Manual.
10. Inicie o pipeline de análise clicando na seta no painel superior esquerdo.
    NOTA: O software agora segmenta todos os núcleos nos canais Hoechst33342 e EdU. Este pipeline de análise considera apenas núcleos Hoechst33342⁺ e EdU⁺ segmentados maiores que 15 μm² de tamanho (ou seja, área no segmento do núcleo) para garantir que pequenos núcleos, provavelmente originários de células mortas, sejam excluídos da análise.
11. Localize os resultados da análise na lista de objetos clicando na tag Colunas de Recursos .
12. Alterne para a Visualização de detalhes mestre e selecione a tag Organoids no painel superior e o recurso Primeiro ponto de tempo.
13. No painel inferior, selecione os recursos a serem exibidos por organoide. Use Projeção (x/y/z) Área (voxel), Intensidade média # 1 (canal EdU) e Intensidades SD #1.
14. Exporte os resultados (Relatório de detalhes mestre) usando a função Exportar do Excel .
15. Salve o arquivo de análise e feche o software.

5. Determinação das taxas de proliferação de organoides

1. Abra o arquivo Relatório de detalhes mestre exportado na etapa 4.14.
2. Há uma guia separada para cada imagem analisada. Calcule a soma da área/voxel para núcleos e coloração EdU para cada imagem. Em seguida, copie todos os dados resultantes em uma nova guia coletiva e agrupe todos os dados referentes ao mesmo ponto de tempo.
3. Em seguida, calcule a área total dos núcleos celulares (ou seja, a soma da área de Hoechst33342⁺ e da área EdU⁺ ) para cada imagem.
4. Em seguida, divida a área total por si mesma (= 100%) e a área média de EdU⁺ pela área total (= porcentagem de DNA de EdU⁺ ).
5. Plote a porcentagem de DNA proliferativo dos organoides BO e AO no eixo y e os diferentes pontos de tempo no eixo x.

Resultados

Os organoides cultivados por 3 dias após a tripsinização devem estar idealmente entre 50-250 μm, conforme ilustrado na Figura 2A. Organoides consideravelmente maiores do que isso podem não reverter sua polaridade com eficiência. Organoides maiores também podem começar a brotar, e notamos que esses organoides também podem ter problemas com a inversão eficiente da polaridade. Os organoides basais e apicais-externos apresentam dif...

Discussão

Este protocolo descreve em detalhes como induzir a inversão de polaridade em culturas organoides intestinais derivadas de células-tronco adultas padrão. Os organoides apicais servem ao propósito de obter acesso à superfície da célula apical, que geralmente é orientada para o lúmen organoide. Ser capaz de sondar a superfície apical pode ser de grande importância para certas aplicações, pois esta é a porção da membrana celular que é exposta a todo o conteúdo do trato dige...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Biologix	07-6024
[Leu15]-Gastrin I human, ≥95% (HPLC)	Sigma-Aldrich	G-9145
µ-Slide 18 Well Glass Bottom	ibidi	81817
100X Penicillin-Streptomycin supplement for Media	Gibco/Thermo	15140122
A 83-01	Tocris Bioscience	2939/10
Anti-Adherence Rinsing Solution	StemCell Technologies	7010
arivis Pro	Zeiss	Version 4.2.2
B27 SerumFree Supplement (50X), liquid	Gibco/Thermo	17504044
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)	Abcam	ab145597
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye	Thermo Scientific	C10340
DMEM-F12	Gibco/Thermo	11320033
Geltrex	Gibco/Thermo	A1413202
GlutaMAX Supplement	Gibco/Thermo	35050061
HEPES Buffer Solution 1 M, liquid	Gibco/Thermo	15630056
Human FGF-basic	PeproTech	100-18B-100µG
Human HGF	PeproTech	100-39-100µG
Human IGF-I	PeproTech	100-11-100µG
Human NOGGIN (Mammalian)	PeproTech	120-10C-200µG
N-Acetyl-L-cysteine,cell culture tested, BioReagent	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Organoid Harvesting Solution	Thermo	C10340
Triton(TM) X-100,for molecular biology	Sigma-Aldrich	T8787-250ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco/Thermo	25300054