Génération d’organoïdes intestinaux apical-out et évaluation du taux de prolifération des organoïdes à l’aide du marquage EdU

Résumé

Ici, nous décrivons un protocole pour générer des organoïdes intestinaux apical-out à partir de cultures d’organoïdes standard enrobées de matrice. Il décrit également l’incorporation ultérieure de l’EdU dans les cellules à prolifération active et la quantification semi-automatique des cellules positives à l’EdU.

Résumé

Ici, nous décrivons la génération de cultures flottantes d’organoïdes intestinaux apical-out à partir de cultures d’organoïdes intestinaux enrobés d’hydrogel. En même temps, des cultures d’organoïdes basal-out flottants sont établies pour une comparaison directe entre les organoïdes apicaux et basaux. Les organoïdes apical-out et basal-out sont ensuite soumis à l’analogue de la thymidine 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), qui est intégrée dans l’ADN nouvellement synthétisé pendant la phase S de la division cellulaire. Cette incorporation dans l’ADN peut être visualisée dans des organoïdes morphologiquement intacts à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser. Les cellules marquées avec Hoechst33342 et EdU sont ensuite quantifiées de manière semi-automatique à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Le calcul du pourcentage de cellules EdU-positives par rapport au nombre total de cellules permet d’analyser la prolifération cellulaire dans les organoïdes tridimensionnels (3D). Bien qu’il soit utilisé ici pour l’analyse de la prolifération dans les organoïdes intestinaux, le protocole est applicable à l’analyse de colorations spécifiques au noyau de divers types dans d’autres organoïdes ou des cultures cellulaires bidimensionnelles.

Introduction

Les organoïdes intestinaux sont des modèles in vitro tridimensionnels récapitulant l’épithélium intestinal comprenant différents types de cellules. Ces organoïdes peuvent être facilement établis à partir de cellules souches adultes isolées dans des cryptes intestinales¹. Les organoïdes étant beaucoup plus proches de l’épithélium in vivo, ils prennent de plus en plus d’importance dans la recherche biomédicale. Les organoïdes de l’intestin ne sont pas seulement utilisés pour l’analyse des mécanismes physiologiques (par exemple, la signalisation de la niche intestinale ^2,3 et la différenciation cellulaire ^4,5), mais aussi pour la recherche sur les maladies infectieuses ^6,7. Cependant, la croissance de cellules polarisées en 3D entourant une lumière centrale est un défi, car la surface de la cellule apicale finit par être inaccessible dans la lumière organoïde. L’examen des différences entre les surfaces cellulaires apicales et basolatérales peut être important dans les études métaboliques, comme en témoignent les différences dans l’absorption des acides gras⁸ et la recherche sur les maladies infectieuses 9,10,11,12.

La génération d’organoïdes dits apicals est une option facile pour surmonter ce problème. En retirant la matrice extracellulaire des cultures d’organoïdes standard (c’est-à-dire les organoïdes basal-out, intégrés dans la matrice) et en ensemenceant ces organoïdes dans un milieu sans matrice, un changement de polarité peut être induit⁹.

Comme nous l’avons déjà publié, la plupart des organoïdes inversent leur polarité en 12 heures. Cependant, il faut 48 à 72 h pour obtenir une culture avec plus de 90 % d’organoïdes apicals. Malgré leur avantage de permettre l’accès à la surface cellulaire apicale, les organoïdes apical-out montrent une prolifération significativement réduite après l’inversion de polarité, tandis que les taux de mort cellulaire augmentent de¹³. Le facteur de l’activité proliférative peut représenter une variable confondante dans diverses analyses et doit être gardé à l’esprit lors de la conception d’une expérience.

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’établissement de cultures d’organoïdes apical-out intestinaux et d’organoïdes de contrôle basal-out flottants pour les analyses en aval. De plus, nous décrivons le marquage avec la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), incorporée dans l’ADN nouvellement synthétisé et marque ainsi les cellules en prolifération active. Nous décrivons plus en détail l’analyse semi-automatique d’images du taux de prolifération des organoïdes à l’aide du logiciel arivis Pro (Zeiss) par quantification des cellules EdU⁺ . Un schéma du processus est présenté à la figure 1.

Protocole

Des organoïdes intestinaux dérivés de cellules souches adultes de chiens, établis selon Kramer et al., 2020¹⁴ ont été utilisés. Selon les directives du comité d’éthique de l’établissement, l’utilisation de matériel tissulaire prélevé lors de l’excision thérapeutique ou de l’autopsie est incluse dans le « consentement du propriétaire pour le traitement » de l’université, qui a été signé par tous les patients propriétaires.

1. Culture d’organoïdes

1. Cultivez des organoïdes intestinaux dérivés de cellules souches adultes intégrés dans la matrice d’extrait de membrane basale (BME) de votre choix dans des plaques de 24 puits et divisez-les mécaniquement à l’aide de pipettes en verre, comme décrit en détail dans Pleguezuelos et al., 2020¹⁵.
   REMARQUE : Pour le protocole décrit ici, Geltrex a été utilisé comme BME.
2. Retirer avec précaution le milieu raffiné (Tableau 1) des organoïdes inclus dans le BME.
3. Ajouter 500 μL de trypsine-EDTA à 0,05 % par puits et détacher tous les dômes matriciels du puits en pipetant de haut en bas à plusieurs reprises. Transférez les organoïdes dans un tube de 15 mL et remettez-les bien en suspension pour dissocier complètement la matrice d’hydrogel.
4. Incuber des organoïdes avec 0,05 % de trypsine-EDTA à 37 °C dans un bain-marie jusqu’à ce que tous les organoïdes soient dissociés en cellules uniques ou en petits amas de cellules.
5. Diluer la trypsine/suspension cellulaire avec un milieu basal (tableau 1). Utilisez au moins deux fois plus de milieu de base que de trypsine.
6. Cellules de centrifugation à 8 °C à 420 × g pendant 5 min. Retirez autant de surnageant que possible.
7. Cellules germes intégrées dans BME dans autant de puits que ceux utilisés pour la trypsinisation à l’étape 1.3. et leur fournir un milieu raffiné (tableau 1).
8. Incuber des cellules pendant 3 jours dans un incubateur de culture cellulaire et passer à l’étape 2.1.

2. Induction de l’inversion de polarité et marquage EdU

1. Retirez délicatement le milieu des organoïdes incrustés dans le BME.
2. Ajoutez 500 μL de solution de récolte d’organoïdes dans chaque puits et détachez tous les dômes matriciels du puits en pipetant de haut en bas à plusieurs reprises. Transférez les organoïdes dans un tube de 15 mL et remettez-les bien en suspension pour dissocier complètement la matrice d’hydrogel.
3. Incuber le tube de 15 mL sur de la glace pendant 1,5 h. Bien agiter le tube toutes les 10 minutes pour éviter l’agglutination des organoïdes et assurer une dissociation uniforme des composants restants de l’hydrogel.
4. Pendant l’incubation, enduire une plaque de 96 puits d’une solution anti-adhérence. Pour chaque puits d’une plaque de 24 puits trypsinisée à l’étape 1.3., enduire 8 puits d’une plaque de 96 puits. Incuber pendant au moins 1 h à température ambiante (RT).
5. Ajouter au tube de 15 mL au tube de 15 mL au moins deux fois plus de PBS que la solution de prélèvement d’organoïdes a été utilisée et centrifuger à 8 °C à 150 × g pendant 5 min.
6. Retirer le surnageant et remettre les organoïdes en suspension dans 1 mL de PBS.
7. Transvaser 500 μL de la suspension organoïde/PBS dans un tube séparé de 15 mL et centrifuger à nouveau les deux tubes à 8 °C à 150 × g pendant 5 min.
8. Retirez toute la solution anti-adhérence de la plaque à 96 puits.
9. Éliminer autant de surnageant que possible après la centrifugation.
10. Utilisez l’un des tubes pour la génération d’organoïdes basaux flottants (BO) et l’autre tube pour les organoïdes apical-out (AO).
11. Pour les organoïdes BO, ajouter 100 μL de milieu raffiné contenant 7,5 % de BME par puits de la plaque de 96 puits dans un tube. Mélangez bien et répartissez uniformément les organoïdes sur le nombre souhaité de puits de la plaque pré-enduite de 96 puits.
12. Pour les organoïdes AO, ajouter 100 μL de milieu raffiné ordinaire (sans aucun BME ajouté) par puits de la plaque de 96 puits dans l’autre tube. Mélangez bien et répartissez uniformément les organoïdes sur le nombre souhaité de puits de la plaque pré-enduite de 96 puits.
13. Incuber les organoïdes à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 3 jours.
    REMARQUE : Les différences morphologiques commenceront à être visibles après le jour 1. Cependant, les résultats publiés précédemment montrent qu’il faut environ 3 jours pour que la grande majorité des organoïdes présentent une polarité apicale¹³.
14. À des moments définis, par exemple 24 h/48 h/72 h après l’induction de l’inversion de polarité, ajouter 50 μL de 3 μM d’EdU dilués dans un milieu raffiné à tous les puits d’organoïdes à étiqueter, pour obtenir une concentration finale de 1 μM EdU dans chaque puits.
15. Incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 1,5 h_.
16. Prélever les organoïdes marqués EdU à l’aide d’embouts à gros calibre et les transférer dans un tube de 15 ml.
17. Ajouter une quantité égale de 4 % de PFA dans chaque tube (organoïdes BO et AO ; concentration finale de PFA = 2 %) et mélanger soigneusement.
18. Incuber à RT pendant 15 min.
19. Ajouter au moins deux fois la quantité de PBS qu’il y a de volume dans le tube de 15 mL et centrifuger à 8 °C à 80 × g pendant 5 min.
20. Retirer le surnageant et remettre les organoïdes en suspension dans 1 mL de PBS.
21. Centrifuger à nouveau à 8 °C à 80 × g pendant 5 min.
22. Retirez le surnageant, remettez les organoïdes en suspension dans 1 mL de PBS et transférez-les dans un tube de 1,5 mL. Stockez les organoïdes à 4 °C jusqu’à ce que la réaction de coloration EdU soit effectuée (voir rubrique 3).
23. Répétez les étapes 2.14 à 2.22 pour chaque point temporel à analyser.

3. Réaction de coloration Click-it EdU et coloration Hoechst 33342

1. Centrifuger les organoïdes fixés (à partir de l’étape 2.22) dans un tube de 1,5 mL à 4 °C à 50 × g pendant 5 min.
2. Retirer le surnageant et remettre en suspension les organoïdes dans 1 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % diluée dans du PBS à l’aide d’embouts à large diamètre.
3. Répétez les étapes 3.1. et 3.2 (étapes de lavage).
4. Retirer le surnageant et remettre les organoïdes en suspension dans 1 mL de Triton X-100 à 0,5 % dilué dans du PBS.
5. Incuber à RT pendant 20 min.
6. Centrifuger les organoïdes à RT à 50 × g pendant 5 min.
7. Dans un tube frais, préparez 1x additif tampon en mélangeant 45 μL de H₂O avec 5 μL d’additif tampon 10x.
8. Dans un autre tube, préparez le cocktail réactionnel en mélangeant les composants suivants : 385,8 μL de H₂O, 43 μL de 10x tampon de réaction, 20 μL de CuSO, _4,1,2 μL d’azoture Alexa Fluor 647 et 50 μL ou 1x additif tampon (à partir de l’étape 3.7.).
   REMARQUE : Ce mélange est suffisant pour cinq réactions et peut être augmenté ou réduit en fonction du nombre requis de réactions de coloration.
9. Répétez les étapes 3.1. et 3.2. deux fois (étapes de lavage).
10. Retirer le surnageant et ajouter 100 μL de cocktail de réaction (étape 3.8.) dans chaque tube contenant des organoïdes.
11. Incuber à RT pendant 30 min dans l’obscurité.
12. Répétez les étapes 3.1. et 3.2 (étapes de lavage).
13. Centrifuger les organoïdes à 50 × g pendant 5 min à RT.
14. Mettre les organoïdes en suspension dans 1 mL de 10 μg/mL de Hoechst33342 dilué dans du PBS.
15. Incuber à RT pendant 45 min dans l’obscurité.
16. Répétez les étapes 3.1. et 3.2 (étapes de lavage).
17. Centrifuger les organoïdes à 50 × g pendant 5 min à 4 °C.
18. Intégrer les organoïdes de la matrice BME de votre choix dans une lame compatible avec la microscopie confocale (p. ex., puits μ-Slide 18)
19. Imagez des organoïdes au microscope confocal.

4. Analyse d’image semi-automatique

REMARQUE : Pour cette analyse, la version 4.2.2 d’arivis Pro (logiciel d’analyse d’images) a été utilisée.

1. Importez les images du microscope confocal dans le logiciel d’analyse d’images et définissez un dossier dans lequel le fichier d’analyse sera enregistré. Utilisez l’option Images comme points temporels pour importer plusieurs images (répliquer des images, différents points temporels, différents traitements, etc.). Chaque image sera alors traitée comme un point temporel unique, ce qui permettra de passer facilement d’une image à l’autre.
2. Ouvrez le panneau d’analyse et importez le pipeline d’analyse fourni en tant que Fichier supplémentaire 1 (arivis_EdU_pipeline).
3. Utilisez l’outil Placer de nouveaux objets et Sphère avec la balise Organoïde pour encercler facilement tous les organoïdes bien séparés.
4. Passez à l’image suivante, c’est-à-dire au prochain point temporel, et procédez au marquage des organoïdes pour toutes les images.
5. Pour les organoïdes qui sont très proches les uns des autres et qui ne peuvent donc pas être séparés à l’aide du mode Sphère , ouvrez la liste d’objets et activez la balise Organoïde.
6. Continuez à utiliser l’outil Dessiner des objets en mode Polygone pour marquer les contours des organoïdes à la main.
   REMARQUE : Dans la liste d’objets, tous les organoïdes sont maintenant marqués et attribués à un point temporel spécifique. Ce point temporel correspond à l’ordre des images importées à l’étape 4.1. Ces points temporels peuvent désormais être renommés pour correspondre au nom de l’image d’origine si vous le souhaitez.
7. Dans la liste des objets, marquez tous les objets (=organoïdes) et cliquez avec le bouton droit de la souris, puis cliquez sur Supprimer les balises pour supprimer la balise Manuel de tous les objets.
8. Désactivez la balise Organoïde dans la liste d’objets et marquez toutes les zones des objets précédemment définis qui doivent être exclues de l’analyse à l’aide de l’outil Dessiner des objets en mode Polygone . Ces zones peuvent inclure des cellules mortes dans la lumière organoïde ou des zones floues, ce qui peut fausser l’analyse.
9. Lorsque vous ouvrez la liste d’objets, assurez-vous que tous les organoïdes sont répertoriés avec l’étiquette Organoïde et que toutes les zones qui doivent être exclues ont l’étiquette Manuel.
10. Démarrez le pipeline d’analyse en cliquant sur la flèche dans le panneau supérieur gauche.
    REMARQUE : Le logiciel segmente désormais tous les noyaux dans les canaux Hoechst33342 et EdU. Ce pipeline d’analyse ne prend en compte que les noyaux segmentés de Hoechst33342⁺ et EdU⁺ de plus de 15 μm² (c’est-à-dire l’aire dans le segment du noyau) afin de s’assurer que les petits noyaux, très probablement provenant de cellules mortes, sont exclus de l’analyse.
11. Recherchez les résultats de l’analyse dans la liste d’objets en cliquant sur la balise Feature Columns .
12. Passez à la vue détaillée principale et sélectionnez la balise Organoids dans le panneau supérieur et la fonction Premier point de temps.
13. Dans le panneau inférieur, sélectionnez les fonctionnalités à afficher par organoïde. Utilisez la zone de projection (x/y/z) (voxel), l’intensité moyenne # 1 (canal EdU) et les intensités SD #1.
14. Exportez les résultats (Master Detail Report) à l’aide de la fonction d’exportation Excel .
15. Enregistrez le fichier d’analyse et fermez le logiciel.

5. Détermination des taux de prolifération des organoïdes

1. Ouvrez le fichier de rapport détaillé principal exporté à l’étape 4.14.
2. Il y a un onglet distinct pour chaque image analysée. Calculez la somme aire/voxel pour les noyaux et la coloration EdU pour chaque image. Ensuite, copiez toutes les données résultantes dans un nouvel onglet collectif et regroupez toutes les données faisant référence au même point temporel.
3. Ensuite, calculez l’aire totale des noyaux cellulaires (c’est-à-dire la somme de l’aire de Hoechst33342⁺ et de l’aire EdU⁺ ) pour chaque image.
4. Ensuite, divisez la surface totale par elle-même (= 100 %) et la surface moyenne EdU⁺ par la surface totale (=pourcentage d’ADN EdU⁺ ).
5. Tracez le pourcentage d’ADN prolifératif des organoïdes BO et AO sur l’axe des y et les différents points temporels sur l’axe des x.

Résultats

Les organoïdes cultivés pendant 3 jours après la trypsinisation doivent idéalement avoir une taille comprise entre 50 et 250 μm, comme le montre la figure 2A. Les organoïdes qui sont considérablement plus grands que cela peuvent ne pas inverser efficacement leur polarité. Les organoïdes plus grands peuvent également commencer à bourgeonner, et nous avons remarqué que ces organoïdes peuvent également avoir des problèmes d?...

Discussion

Ce protocole décrit en détail comment induire l’inversion de polarité dans des cultures d’organoïdes intestinaux standard dérivés de cellules souches adultes. Les organoïdes apicals servent à accéder à la surface de la cellule apicale, qui est généralement orientée vers la lumière organoïde. Être capable de sonder la surface apicale peut être d’une grande importance pour certaines applications, car il s’agit de la partie de la membrane cellulaire qui est exposée...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Biologix	07-6024
[Leu15]-Gastrin I human, ≥95% (HPLC)	Sigma-Aldrich	G-9145
µ-Slide 18 Well Glass Bottom	ibidi	81817
100X Penicillin-Streptomycin supplement for Media	Gibco/Thermo	15140122
A 83-01	Tocris Bioscience	2939/10
Anti-Adherence Rinsing Solution	StemCell Technologies	7010
arivis Pro	Zeiss	Version 4.2.2
B27 SerumFree Supplement (50X), liquid	Gibco/Thermo	17504044
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)	Abcam	ab145597
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye	Thermo Scientific	C10340
DMEM-F12	Gibco/Thermo	11320033
Geltrex	Gibco/Thermo	A1413202
GlutaMAX Supplement	Gibco/Thermo	35050061
HEPES Buffer Solution 1 M, liquid	Gibco/Thermo	15630056
Human FGF-basic	PeproTech	100-18B-100µG
Human HGF	PeproTech	100-39-100µG
Human IGF-I	PeproTech	100-11-100µG
Human NOGGIN (Mammalian)	PeproTech	120-10C-200µG
N-Acetyl-L-cysteine,cell culture tested, BioReagent	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Organoid Harvesting Solution	Thermo	C10340
Triton(TM) X-100,for molecular biology	Sigma-Aldrich	T8787-250ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco/Thermo	25300054