Генерация апикальных кишечных органоидов и оценка скорости пролиферации органоидов с помощью EdU-мечения

Резюме

Здесь мы описываем протокол генерации апикальных кишечных органоидов из стандартных органоидных культур, встроенных в матрицу. В ней также описывается последующее включение EdU в активно пролиферирующие клетки и полуавтоматическая количественная оценка EdU-положительных клеток.

Аннотация

Здесь мы описываем генерацию плавающих культур апикальных кишечных органоидов из интеграционных органоидных культур, встроенных в гидрогель. Одновременно с этим создаются плавающие базальные органоидные культуры для прямого сравнения между апикальными и базальными органоидами. Апикальные и базальные органоиды впоследствии подвергаются воздействию тимидинового аналога 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU), который встраивается во вновь синтезированную ДНК во время S-фазы деления клеток. Это включение в ДНК может быть визуализировано в морфологически интактных органоидах с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Ячейки, помеченные с помощью Hoechst33342 и EdU, затем количественно оцениваются полуавтоматическим образом с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Расчет процентного соотношения EdU-положительных клеток от общего числа клеток позволяет проводить анализ клеточной пролиферации в трехмерных (3D) органоидах. Несмотря на то, что протокол используется здесь для анализа пролиферации в кишечных органоидах, он применим и для анализа специфических для ядра окрашиваний различных видов в других органоидах или двумерных клеточных культурах.

Введение

Кишечные органоиды представляют собой трехмерные модели in vitro, воспроизводящие эпителий кишечника, состоящий из различных типов клеток. Эти органоиды могут быть легко установлены из взрослых стволовых клеток, выделенных из кишечных крипт¹. Поскольку органоиды находятся гораздо ближе к эпителию in vivo, они приобретают все большее значение в биомедицинских исследованиях. Органоиды кишечника используются не только для анализа физиологических механизмов (например, передачи сигналов в кишечной нише ^2,3 и дифференцировки клеток ^4,5), но и для исследований инфекционных заболеваний ^6,7. Тем не менее, выращивание поляризованных клеток в 3D, охватывающих центральный просвет, является сложной задачей, поскольку поверхность апикальной клетки оказывается недоступной в пределах органоидного просвета. Изучение различий между апикальными и базолатеральными поверхностями клеток может иметь важное значение в метаболических исследованиях, о чем свидетельствуют различия^{в поглощении} жирных кислот 8 и исследованиях инфекционных заболеваний ^9,10,11,12.

Генерация так называемых апикальных органоидов является простым вариантом решения этой проблемы. Путем удаления внеклеточного матрикса из стандартных органоидных культур (т.е. базально-исходных, встроенных в матрицу органоидов) и засеивания этих органоидов в среду, свободную от матрицы,^можно индуцировать переключение полярности9.

Как мы уже писали ранее, большинство органоидов инвертируют свою полярность в течение 12 часов. Однако для получения культуры с более чем 90% апикальных органоидов требуется 48-72 ч. Несмотря на то, что они обеспечивают доступ к апикальной поверхности клетки, апикальные органоиды демонстрируют значительное снижение пролиферации после смены полярности, в то время как скорость гибели клеток увеличивается^{в 13} раз. Фактор пролиферативной активности может представлять собой искажающую переменную в различных анализах, и его следует учитывать при планировании эксперимента.

Здесь мы представляем подробный протокол для создания кишечных апикальных органоидных культур и плавающих базальных контрольных органоидов для последующих анализов. Кроме того, мы описываем мечение 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU), включенным в вновь синтезированную ДНК и таким образом маркирующим активно пролиферирующие клетки. Далее мы описываем полуавтоматический анализ скорости пролиферации органоидов с помощью программного обеспечения arivis Pro (Zeiss) путем количественного определения клеток EdU⁺ . Схема этого процесса представлена на рисунке 1.

протокол

Были использованы кишечные органоиды, полученные из взрослых стволовых клеток собак, полученные по данным Kramer et al., 2020¹⁴ . В соответствии с руководящими принципами институционального комитета по этике, использование тканевого материала, собранного во время терапевтического иссечения или вскрытия, включено в университетское «Согласие владельца на лечение», которое было подписано всеми владельцами пациентов.

1. Органоидная культура

1. Культивируйте кишечные органоиды, полученные из взрослых стволовых клеток, встраиваемые в выбранную матрицу экстракта базальной мембраны (BME) в 24-луночные планшеты и механически разделяйте их с помощью стеклянных пипеток, как подробно описано в Pleguezuelos et al., 2020,¹⁵.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для описанного здесь протокола в качестве BME использовался Geltrex.
2. Осторожно удалите очищенную среду (Таблица 1) из органоидов, встроенных в БМЭ.
3. Добавьте 500 мкл 0,05 % трипсина-ЭДТА в лунку и отсоедините все матричные купола от лунки путем многократного пипетирования вверх и вниз. Перенесите органоиды в пробирку объемом 15 мл и хорошо ресуспендируйте для полной диссоциации гидрогелевой матрицы.
4. Инкубируйте органоиды с 0,05 % трипсин-ЭДТА при 37 °C на водяной бане до тех пор, пока все органоиды не диссоциируют на отдельные клетки или небольшие кластеры клеток.
5. Разбавляют трипсин/клеточную суспензию базальной средой (табл. 1). Используйте как минимум в два раза больше базальной среды, чем трипсина.
6. Центрифугируйте ячейки при 8 °C при 420 × г в течение 5 мин. Удалите как можно больше надосадочной жидкости.
7. Затравочные клетки встраивали в БМЭ в столько лунок, сколько было использовано для трипсинизации на этапе 1.3. и снабжают их очищенной средой (табл. 1).
8. Инкубируйте клетки в течение 3 дней в инкубаторе для клеточных культур и приступайте к шагу 2.1.

2. Индукция переполюсовки и маркировка EdU

1. Осторожно удалите среду из органоидов, встроенных в BME.
2. Добавьте 500 мкл раствора для сбора органоидов в каждую лунку и отсоедините все матричные купола от лунки путем многократного пипетирования вверх и вниз. Перенесите органоиды в пробирку объемом 15 мл и хорошо ресуспендируйте для полной диссоциации гидрогелевой матрицы.
3. Инкубируйте пробирку объемом 15 мл на льду в течение 1,5 ч. Хорошо встряхивайте пробирку каждые 10 минут, чтобы предотвратить слипание органоидов и обеспечить равномерную диссоциацию оставшихся компонентов гидрогеля.
4. Во время инкубации покройте 96-луночный планшет раствором, препятствующим прилипанию. Для каждой лунки 24-луночного планшета, трипсинизированного на шаге 1.3, покрыть 8 лунок 96-луночного планшета. Инкубировать не менее 1 ч при комнатной температуре (RT).
5. Добавьте не менее чем в два раза больше PBS, чем использовался раствор для сбора органоидов, в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 8 °C при 150 × г в течение 5 минут.
6. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте органоиды в 1 мл PBS.
7. Перенесите 500 мкл органоида/суспензии PBS в отдельную пробирку объемом 15 мл и снова центрифугируйте обе пробирки при 8 °C при 150 × г в течение 5 мин.
8. Удалите весь антиадгезивный раствор с 96-луночного планшета.
9. Удалите как можно больше надосадочной жидкости после центрифугирования.
10. Используйте одну из трубок для генерации плавающих базальных органоидов (BO), а другую — для апикальных органоидов (AO).
11. Для органоидов BO добавьте 100 мкл очищенной среды, содержащей 7,5% BME, на лунку 96-луночного планшета в одну пробирку. Хорошо перемешайте и равномерно распределите органоиды по желаемому количеству лунок предварительно покрытой 96-луночной пластины.
12. Для органоидов АО добавьте 100 мкл простой очищенной среды (без добавления BME) на лунку 96-луночного планшета в другую пробирку. Хорошо перемешайте и равномерно распределите органоиды по желаемому количеству лунок предварительно покрытой 96-луночной пластины.
13. Инкубируйте органоиды при 37 °C и 5%_CO2 в течение 3 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Морфологические различия начнут проявляться после 1-го дня. Тем не менее, ранее опубликованные результаты показывают, что подавляющему большинству органоидов требуется около 3 дней, чтобы проявить апикальную полярность¹³.
14. В определенные моменты времени, например, через 24 ч/48 ч/72 ч после индукции смены полярности, добавьте 50 мкл 3 мкМ EdU, разведенных в очищенной среде, во все лунки с органоидами, подлежащими маркировке, чтобы получить конечную концентрацию 1 мкМ EdU в каждой лунке.
15. Инкубировать при 37 °C и 5%_CO2 в течение 1,5 ч_.
16. Соберите органоиды, меченные EdU, с помощью наконечников с широким отверстием и перенесите их в пробирку объемом 15 мл.
17. Добавьте равное количество 4% PFA в каждую пробирку (органоиды BO и AO; конечная концентрация PFA = 2%) и тщательно перемешайте.
18. Инкубировать при RT в течение 15 минут.
19. Добавьте не менее чем в два раза больше PBS, так как объем пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте при 8 °C при 80 × г в течение 5 минут.
20. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте органоиды в 1 мл PBS.
21. Снова центрифугируйте при 8 °C и 80 × г в течение 5 минут.
22. Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте органоиды в 1 мл PBS и перенесите их в пробирку объемом 1,5 мл. Храните органоиды при температуре 4 °C до начала реакции окрашивания EdU (см. раздел 3).
23. Повторите шаги 2.14-2.22 для каждой временной точки, которую необходимо проанализировать.

3. Реакция окрашивания Click-it EdU и окрашивание Hoechst 33342

1. Центрифугируйте фиксированные органоиды (начиная с шага 2.22.) в пробирке объемом 1,5 мл при 4 °C при 50 × г в течение 5 мин.
2. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте органоиды в 1 мл 3% бычьего сывороточного альбумина (БСА), разведенного в PBS, с помощью наконечников с широким отверстием.
3. Повторите шаги 3.1. и 3.2 (этапы промывки).
4. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте органоиды в 1 мл 0,5% Triton X-100, разведенного в PBS.
5. Инкубировать при RT в течение 20 минут.
6. Центрифугировать органоиды в RT при 50 × г в течение 5 мин.
7. В свежей пробирке приготовьте 1x буферную добавку, смешав 45 мкл H₂O с 5 мкл 10x буферной добавки.
8. В другой пробирке приготовьте реакционный коктейль, смешав следующие компоненты: 385,8 мкл H₂O, 43 мкл 10x реакционного буфера, 20 мкл CuSO, _4,1,2 мкл азида Alexa Fluor 647 и 50 мкл 1x буферной добавки (начиная с шага 3.7.).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта смесь достаточна для пяти реакций и может быть увеличена и уменьшена в соответствии с требуемым количеством реакций окрашивания.
9. Повторите шаги 3.1. и 3.2. два раза (этапы промывки).
10. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 100 μL Reaction Cocktail (шаг 3.8.) в каждую пробирку с органоидами.
11. Инкубировать при RT в течение 30 минут в темноте.
12. Повторите шаги 3.1. и 3.2 (этапы промывки).
13. Центрифугировать органоиды при 50 × г в течение 5 мин при РТ.
14. Ресуспендировать органоиды в 1 мл 10 мкг/мл Hoechst33342, разведенных в PBS.
15. Инкубировать при RT в течение 45 минут в темноте.
16. Повторите шаги 3.1. и 3.2 (этапы промывки).
17. Центрифугируйте органоиды при 50 × г в течение 5 мин при 4 °C.
18. Засейте органоиды из выбранной матрицы BME в предметное стекло, совместимое с конфокальной микроскопией (например, μ-Слайд 18)
19. Изображение органоидов под конфокальным микроскопом.

4. Полуавтоматический анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого анализа использовался arivis Pro версии 4.2.2 (программное обеспечение для анализа изображений).

1. Импортируйте изображения конфокального микроскопа в программное обеспечение для анализа изображений и определите папку, в которую будет сохранен файл анализа. Используйте опцию «Изображения как временные точки » для импорта нескольких изображений (дублирование изображений, разных временных точек, разных обработок и т. д.). Каждое изображение будет рассматриваться как отдельная временная точка, что позволит легко переключаться между отдельными изображениями.
2. Откройте панель анализа и импортируйте конвейер анализа, предоставленный в виде дополнительного файла 1 (arivis_EdU_pipeline).
3. Используйте инструмент «Разместить новые объекты » и «Сферу » с тегом «Органоид », чтобы легко обвести все хорошо разделенные органоиды.
4. Переключитесь на следующее изображение, т.е. на следующую временную точку, и продолжайте отмечать органоиды для всех изображений.
5. Для органоидов, которые находятся очень близко друг к другу и поэтому не могут быть разделены с помощью режима Сфера , откройте список объектов и активируйте тег Органоид.
6. Продолжайте использовать инструмент «Рисовать объекты » в режиме «Многоугольник », чтобы отмечать контуры органоидов вручную.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В списке объектов все органоиды теперь помечены и назначены на определенный момент времени. Этот момент времени соответствует порядку импортируемых изображений на шаге 4.1. Эти временные точки теперь можно переименовать в соответствии с исходным именем изображения, если это необходимо.
7. В списке объектов отметьте все объекты (=органоиды) и щелкните правой кнопкой мыши, затем нажмите «Удалить теги », чтобы удалить тег «Вручную » со всех объектов.
8. Деактивируйте тег Органоид в списке объектов и отметьте все области внутри ранее определенных объектов, которые должны быть исключены из анализа, с помощью инструмента Рисовать объекты в режиме Полигон . Эти области могут включать мертвые клетки в просвете органоида или размытые области, которые могут исказить анализ.
9. При открытии списка объектов убедитесь, что все органоиды помечены тегом Organoid , а все области, которые должны быть исключены, имеют тег Manual.
10. Запустите конвейер анализа, щелкнув стрелку на верхней левой панели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение теперь сегментирует все ядра в каналах Hoechst33342 и EdU. В этом конвейере анализа учитываются только сегментированные ядра Hoechst33342⁺ и EdU⁺ размером более 15^мкм2 (т.е. площадь в сегменте ядра), чтобы гарантировать, что небольшие ядра, скорее всего, происходящие из мертвых клеток, исключены из анализа.
11. Результаты анализа можно найти в списке объектов, нажав на тег Feature Columns .
12. Переключитесь в режим Master Detail View и выберите тег Organoids на верхней панели и функцию First Timepoint.
13. На нижней панели выберите объекты для отображения для каждого органоида. Используйте Проекционную площадь (x/y/z) (воксель), Среднюю интенсивность # 1 (канал EdU) и Интенсивность SD #1.
14. Экспортируйте результаты (основной подробный отчет) с помощью функции экспорта в Excel .
15. Сохраните файл анализа и закройте программу.

5. Определение скоростей пролиферации органоидов

1. Откройте файл основного подробного отчета , экспортированный на шаге 4.14.
2. Для каждого анализируемого изображения предусмотрена отдельная вкладка. Рассчитайте сумму площадей/вокселей для ядер и окрашивания EdU для каждого изображения. Затем скопируйте все полученные данные в новую общую вкладку и сгруппируйте все данные, относящиеся к одному и тому же моменту времени.
3. Затем вычислите общую площадь ядра клетки (т. е. сумму площади Hoechst33342⁺ и площади EdU⁺ ) для каждого изображения.
4. Затем разделите общую площадь на саму (= 100%) и среднюю площадь EdU⁺ на общую площадь (= процент ДНК EdU⁺ ).
5. Нанесите график процентного соотношения пролиферативной ДНК органоидов BO и AO по оси y и различных временных точек по оси x.

Результаты

Органоиды, выращенные в течение 3 дней после трипсинизации, в идеале должны иметь плотность 50-250 мкм, как показано на рисунке 2А. Органоиды, которые значительно больше этого, могут не эффективно менять свою полярность. Более крупные органоиды ...

Обсуждение

В этом протоколе подробно описывается, как индуцировать смену полярности в стандартных культурах кишечных органоидов, полученных из взрослых стволовых клеток. Апикальные органоиды служат для получения доступа к апикальной поверхности клетки, которая обычно ориент?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Biologix	07-6024
[Leu15]-Gastrin I human, ≥95% (HPLC)	Sigma-Aldrich	G-9145
µ-Slide 18 Well Glass Bottom	ibidi	81817
100X Penicillin-Streptomycin supplement for Media	Gibco/Thermo	15140122
A 83-01	Tocris Bioscience	2939/10
Anti-Adherence Rinsing Solution	StemCell Technologies	7010
arivis Pro	Zeiss	Version 4.2.2
B27 SerumFree Supplement (50X), liquid	Gibco/Thermo	17504044
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)	Abcam	ab145597
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye	Thermo Scientific	C10340
DMEM-F12	Gibco/Thermo	11320033
Geltrex	Gibco/Thermo	A1413202
GlutaMAX Supplement	Gibco/Thermo	35050061
HEPES Buffer Solution 1 M, liquid	Gibco/Thermo	15630056
Human FGF-basic	PeproTech	100-18B-100µG
Human HGF	PeproTech	100-39-100µG
Human IGF-I	PeproTech	100-11-100µG
Human NOGGIN (Mammalian)	PeproTech	120-10C-200µG
N-Acetyl-L-cysteine,cell culture tested, BioReagent	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Organoid Harvesting Solution	Thermo	C10340
Triton(TM) X-100,for molecular biology	Sigma-Aldrich	T8787-250ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco/Thermo	25300054