Generierung apikaler Darmorganoide und Bestimmung der Organoid-Proliferationsrate mittels EdU-Markierung

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung von apikal-out-Darmorganoiden aus Standard-Matrix-eingebetteten Organoidkulturen. Es skizziert auch den anschließenden Einbau von EdU in aktiv proliferierende Zellen und die halbautomatische Quantifizierung von EdU-positiven Zellen.

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Erzeugung von Schwimmkulturen von apikal-out-Darmorganoiden aus Hydrogel-eingebetteten Darmorganoidkulturen. Gleichzeitig werden schwimmende Basal-Out-Organoidkulturen für den direkten Vergleich zwischen apikal-out- und Basal-out-Organoiden etabliert. Apical-out- und Basal-out-Organoide werden anschließend dem Thymidin-Analogon 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU) ausgesetzt, das während der S-Phase der Zellteilung in die neu synthetisierte DNA integriert wird. Dieser Einbau in die DNA kann in morphologisch intakten Organoiden mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie sichtbar gemacht werden. Zellen, die mit Hoechst33342 und EdU markiert sind, werden dann halbautomatisch mit Hilfe einer Bildanalysesoftware quantifiziert. Die Berechnung des prozentualen Anteils der EdU-positiven Zellen an der Gesamtzahl der Zellen ermöglicht die Analyse der Zellproliferation in dreidimensionalen (3D) Organoiden. Obwohl das Protokoll hier für die Analyse der Proliferation in Darmorganoiden verwendet wird, ist es auch auf die Analyse von kernspezifischen Färbungen verschiedener Art in anderen Organoiden oder zweidimensionalen Zellkulturen anwendbar.

Einleitung

Darm-Organoide sind dreidimensionale In-vitro-Modelle, die das Darmepithel aus verschiedenen Zelltypen rekapitulieren. Diese Organoide lassen sich leicht aus adulten Stammzellen etablieren, die aus Darmkrypten isoliert wurden¹. Da Organoide viel näher am In-vivo-Epithel liegen, gewinnen sie in der biomedizinischen Forschung zunehmend an Bedeutung. Organoide des Darms werden nicht nur für die Analyse physiologischer Mechanismen (z.B. intestinale Nischensignalwege ^2,3 und Zelldifferenzierungen ^4,5) verwendet, sondern auch für die Erforschung von Infektionskrankheiten ^6,7. Die Züchtung polarisierter Zellen in 3D, die ein zentrales Lumen umschließen, ist jedoch eine Herausforderung, da die apikale Zelloberfläche innerhalb des organoiden Lumens unzugänglich ist. Die Untersuchung der Unterschiede zwischen apikalen und basolateralen Zelloberflächen kann in metabolischen Studien wichtig sein, wie z. B. Unterschiede in der Fettsäureaufnahme⁸ und die Erforschung von Infektionskrankheiten ^9,10,11,12 zeigen.

Die Erzeugung sogenannter apikaler Organoide ist eine einfache Möglichkeit, dieses Problem zu lösen. Durch Entfernen der extrazellulären Matrix aus Standard-Organoidkulturen (d. h. basal-out, matrixeingebetteten Organoiden) und Aussäen dieser Organoide in einem matrixfreien Medium kann ein Polaritätswechsel induziert werden⁹.

Wie wir bereits veröffentlicht haben, kehren die meisten Organoide ihre Polarität innerhalb von 12 h um. Es dauert jedoch 48-72 Stunden, um eine Kultur mit mehr als 90% apikalen Organoiden zu erhalten. Trotz ihres Vorteils, den Zugang zur apikalen Zelloberfläche zu ermöglichen, zeigen apikal-out-Organoide eine signifikant verringerte Proliferation nach Polaritätsumkehr, während die Zelltodraten steigen¹³. Der Faktor der proliferativen Aktivität kann in verschiedenen Analysen eine Störvariable darstellen und sollte bei der Planung eines Experiments berücksichtigt werden.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Etablierung von intestinalen apikalen Organoidkulturen und schwimmenden basalen Kontrollorganoiden für nachgelagerte Analysen vor. Des Weiteren beschreiben wir die Markierung mit 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU), das in neu synthetisierte DNA eingebaut wird und somit aktiv proliferierende Zellen markiert. Des Weiteren beschreiben wir die halbautomatische Bildanalyse der Proliferationsrate der Organoide mit der Software arivis Pro (Zeiss) durch Quantifizierung von EdU⁺ Zellen. Ein Schema des Prozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.

Protokoll

Es wurden adulte Stammzell-abgeleitete Darmorganoide von Hunden verwendet, die nach Kramer et al., 2020¹⁴ etabliert wurden. Basierend auf den Richtlinien der institutionellen Ethikkommission ist die Verwendung von Gewebematerial, das während der therapeutischen Exzision oder post mortem entnommen wurde, in der "Einverständniserklärung des Eigentümers zur Behandlung" der Universität enthalten, die von allen Patientenbesitzern unterzeichnet wurde.

1. Organoid-Kultur

1. Züchten Sie aus adulten Stammzellen gewonnene Darmorganoide, die in die Basalmembranextrakt-Matrix (BME) Ihrer Wahl eingebettet sind, in 24-Well-Platten und spalten Sie sie mechanisch mit Glaspipetten, wie ausführlich beschrieben in Pleguezuelos et al., 2020¹⁵.
   HINWEIS: Für das hier beschriebene Protokoll wurde Geltrex als BME verwendet.
2. Entfernen Sie vorsichtig das raffinierte Medium (Tabelle 1) von den BME-eingebetteten Organoiden.
3. Geben Sie 500 μl 0,05 % Trypsin-EDTA pro Vertiefung hinzu und lösen Sie alle Matrixkuppeln aus der Vertiefung, indem Sie wiederholt auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Organoide in ein 15-ml-Röhrchen und resuspendieren Sie sie gut, um die Hydrogelmatrix vollständig zu dissoziieren.
4. Organoide mit 0,05 % Trypsin-EDTA bei 37 °C im Wasserbad inkubieren, bis alle Organoide in einzelne Zellen oder kleine Zellcluster dissoziiert sind.
5. Verdünnen Sie die Trypsin/Zellsuspension mit Basalmedium (Tabelle 1). Verwenden Sie mindestens doppelt so viel Basalmedium wie Trypsin.
6. Zellen bei 8 °C bei 420 × g 5 min zentrifugieren. So viel Überstand wie möglich entfernen.
7. Keimzellen, die in BME eingebettet sind, in so vielen Vertiefungen, wie in Schritt 1.3 für die Trypsinisierung verwendet wurden. und versorgen sie mit raffiniertem Medium (Tabelle 1).
8. Inkubieren Sie die Zellen 3 Tage lang in einem Zellkultur-Inkubator und fahren Sie mit Schritt 2.1 fort.

2. Induktion der Polaritätsumkehr und EdU-Beschriftung

1. Entfernen Sie das Medium vorsichtig von den BME-eingebetteten Organoiden.
2. Geben Sie 500 μl Organoid-Erntelösung in jede Vertiefung und lösen Sie alle Matrixkuppeln aus der Vertiefung, indem Sie wiederholt auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Organoide in ein 15-ml-Röhrchen und resuspendieren Sie sie gut, um die Hydrogelmatrix vollständig zu dissoziieren.
3. Inkubieren Sie das 15-ml-Röhrchen 1,5 h lang auf Eis. Schütteln Sie das Röhrchen alle 10 Minuten gut, um ein Verklumpen der Organoide zu verhindern und eine gleichmäßige Dissoziation der verbleibenden Hydrogelkomponenten zu gewährleisten.
4. Beschichten Sie während der Inkubation eine 96-Well-Platte mit Anti-Adhärenzlösung. Für jede Vertiefung einer 24-Well-Platte, die in Schritt 1.3 trypsinisiert wurde, werden 8 Wells einer 96-Well-Platte beschichtet. Mindestens 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
5. Geben Sie mindestens doppelt so viel PBS wie die Organoid-Erntelösung in das 15-ml-Röhrchen gegeben und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 8 °C bei 150 × g .
6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Organoide in 1 ml PBS.
7. 500 μl der Organoid-/PBS-Suspension in ein separates 15-ml-Röhrchen überführen und beide Röhrchen erneut bei 8 °C bei 150 × g für 5 min zentrifugieren.
8. Entfernen Sie alle Anti-Adhärenz-Lösungen von der 96-Well-Platte.
9. Nach der Zentrifugation so viel Überstand wie möglich entfernen.
10. Verwenden Sie eine der Röhren für die Erzeugung von schwimmenden Basal-out-Organoiden (BO) und die andere Röhre für apikale (AO) Organoide.
11. Bei BO-Organoiden geben Sie 100 μl raffiniertes Medium mit 7,5 % BME pro Vertiefung der 96-Well-Platte in ein Röhrchen. Gut mischen und die Organoide gleichmäßig über die gewünschte Anzahl von Vertiefungen der vorbeschichteten 96-Well-Platte verteilen.
12. Bei AO-Organoiden geben Sie 100 μl raffiniertes Normalmedium (ohne Zugabe von BME) pro Vertiefung der 96-Well-Platte in das andere Röhrchen. Gut mischen und die Organoide gleichmäßig über die gewünschte Anzahl von Vertiefungen der vorbeschichteten 96-Well-Platte verteilen.
13. Inkubieren Sie die Organoide 3 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO₂.
    HINWEIS: Morphologische Unterschiede werden nach Tag 1 sichtbar. Zuvor veröffentlichte Ergebnisse zeigen jedoch, dass es etwa 3 Tage dauert, bis die überwiegende Mehrheit der Organoide eine apikale Polarität¹³ aufweist.
14. Zu definierten Zeitpunkten, z. B. 24 h/48 h/72 h nach Induktion der Polaritätsumkehr, werden 50 μL 3 μM EdU, verdünnt in raffiniertem Medium, in alle Vertiefungen der zu markierenden Organoide gegeben, um eine Endkonzentration von 1 μM EdU in jeder Vertiefung zu erhalten.
15. Bei 37 °C und 5 % CO₂ 1,5 h inkubieren_.
16. Sammeln Sie EdU-markierte Organoide mit breiten Spitzen und überführen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen.
17. In jedes Röhrchen (BO- und AO-Organoide; Endkonzentration von PFA = 2 %) wird die gleiche Menge PFA gegeben und vorsichtig gemischt.
18. 15 Minuten bei RT inkubieren.
19. Fügen Sie mindestens die doppelte Menge PBS hinzu, da das Volumen im 15-ml-Röhrchen vorhanden ist, und zentrifugieren Sie bei 8 °C bei 80 × g für 5 min.
20. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Organoide in 1 ml PBS.
21. Erneut bei 8 °C bei 80 × g 5 min zentrifugieren.
22. Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Organoide in 1 ml PBS und überführen Sie sie in ein 1,5 ml-Röhrchen. Lagern Sie die Organoide bei 4 °C, bis die EdU-Färbereaktion durchgeführt wird (siehe Abschnitt 3).
23. Wiederholen Sie die Schritte 2.14-2.22 für jeden zu analysierenden Zeitpunkt.

3. Click-it EdU-Färbereaktion und Hoechst 33342 Färbereaktion

1. Die fixierten Organoide (aus Schritt 2.22.) werden in einem 1,5 mL Röhrchen bei 4 °C bei 50 × g für 5 min zentrifugiert.
2. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Organoide in 1 ml 3 % Rinderserumalbumin (BSA), verdünnt in PBS, unter Verwendung von Spitzen mit breiter Bohrung.
3. Wiederholen Sie die Schritte 3.1. und 3.2 (Waschschritte).
4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie Organoide in 1 ml 0,5 % Triton X-100, verdünnt in PBS.
5. 20 Minuten bei RT inkubieren.
6. Zentrifugieren Sie die Organoide bei RT bei 50 × g für 5 min.
7. Bereiten Sie in einem frischen Röhrchen 1x Pufferadditiv vor, indem Sie 45 μl H₂O mit 5 μl 10x Pufferadditiv mischen.
8. Bereiten Sie den Reaktionscocktail in einem anderen Röhrchen zu, indem Sie die folgenden Komponenten mischen: 385,8 μl H₂O, 43 μl 10x Reaktionspuffer, 20 μl CuSO, _4,1,2 μl Alexa Fluor 647 azid und 50 μl oder 1x Pufferadditiv (aus Schritt 3.7.).
   HINWEIS: Diese Mischung ist für fünf Reaktionen ausreichend und kann entsprechend der erforderlichen Anzahl von Färbereaktionen nach oben und unten skaliert werden.
9. Wiederholen Sie die Schritte 3.1. und 3.2. zweimal (Waschschritte).
10. Den Überstand entfernen und 100 μl Reaktionscocktail (Schritt 3.8.) in jedes Röhrchen mit Organoiden geben.
11. Inkubieren Sie bei RT für 30 min im Dunkeln.
12. Wiederholen Sie die Schritte 3.1. und 3.2 (Waschschritte).
13. Organoide bei 50 × g für 5 min bei RT zentrifugieren.
14. Resuspendieren Sie Organoide in 1 ml von 10 μg/ml, Hoechst33342, verdünnt in PBS.
15. Inkubieren Sie bei RT für 45 Minuten im Dunkeln.
16. Wiederholen Sie die Schritte 3.1. und 3.2 (Waschschritte).
17. Organoide bei 50 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
18. Seed-Organoide in der BME-Matrix der Wahl in einen Objektträger, der mit der konfokalen Mikroskopie kompatibel ist (z. B. μ-Slide 18 Well)
19. Organoide unter einem konfokalen Mikroskop abbilden.

4. Halbautomatische Bildanalyse

HINWEIS: Für diese Analyse wurde arivis Pro Version 4.2.2 (Bildanalysesoftware) verwendet.

1. Importieren Sie die konfokalen Mikroskopbilder in die Bildanalysesoftware und definieren Sie einen Ordner, in dem die Analysedatei gespeichert wird. Verwenden Sie die Option Bilder als Zeitpunkte , um mehrere Bilder zu importieren (Bilder replizieren, verschiedene Zeitpunkte, unterschiedliche Behandlungen usw.). Jedes Bild wird dann als ein einzelner Zeitpunkt behandelt, was ein einfaches Wechseln zwischen den einzelnen Bildern ermöglicht.
2. Öffnen Sie den Analysebereich, und importieren Sie die Analysepipeline, die als ergänzende Datei 1 (arivis_EdU_pipeline) bereitgestellt wird.
3. Verwenden Sie das Werkzeug "Neue Objekte platzieren " und "Kugel " mit dem Tag "Organoid ", um alle gut getrennten Organoide einfach einzukreisen.
4. Wechseln Sie zum nächsten Bild, d.h. zum nächsten Zeitpunkt, und fahren Sie mit dem Markieren von Organoiden für alle Bilder fort.
5. Für Organoide, die sehr nahe beieinander liegen und daher nicht mit dem Kugelmodus getrennt werden können, öffnen Sie die Objektliste und aktivieren Sie den Tag Organoid.
6. Verwenden Sie weiterhin das Werkzeug "Objekte zeichnen " im Polygon-Modus , um organoide Umrisse von Hand zu markieren.
   HINWEIS: In der Objektliste sind nun alle Organoide markiert und einem bestimmten Zeitpunkt zugeordnet. Dieser Zeitpunkt entspricht der Reihenfolge der Bilder, die in Schritt 4.1 importiert wurden. Diese Zeitpunkte können jetzt bei Bedarf so umbenannt werden, dass sie mit dem ursprünglichen Bildnamen übereinstimmen.
7. Markieren Sie in der Objektliste alle Objekte (=Organoide) und klicken Sie mit der rechten Maustaste, dann klicken Sie auf Tags entfernen , um das manuelle Tag von allen Objekten zu entfernen.
8. Deaktivieren Sie das Organoid-Tag in der Objektliste und markieren Sie alle Bereiche innerhalb zuvor definierter Objekte, die von der Analyse ausgeschlossen werden sollen, mit dem Werkzeug Objekte zeichnen im Polygon-Modus . Zu diesen Bereichen können abgestorbene Zellen innerhalb des Organoidlumens oder verschwommene Bereiche gehören, die die Analyse verzerren könnten.
9. Achten Sie beim Öffnen der Objektliste darauf, dass alle Organoide mit dem Tag Organoid aufgelistet sind und alle Bereiche, die ausgeschlossen werden sollen, das Tag Manuell haben.
10. Starten Sie die Analysepipeline, indem Sie auf den Pfeil im oberen linken Bereich klicken.
    HINWEIS: Die Software segmentiert jetzt alle Kerne in den Hoechst33342- und EdU-Kanälen. Diese Analysepipeline berücksichtigt nur segmentierte Hoechst33342⁺ - und EdU⁺ -Kerne, die größer als 15 μm² sind (d. h. Fläche im Zellkernsegment), um sicherzustellen, dass kleine Zellkerne, die höchstwahrscheinlich aus toten Zellen stammen, von der Analyse ausgeschlossen werden.
11. Suchen Sie die Ergebnisse der Analyse in der Objektliste, indem Sie auf das Feld Feature-Spalten klicken.
12. Wechseln Sie in die Master-Detailansicht und wählen Sie im oberen Bereich das Tag Organoide und das Feature Erster Zeitpunkt.
13. Wählen Sie im unteren Bereich die Merkmale aus, die pro Organoid angezeigt werden sollen. Verwenden Sie Projektionsbereich (x/y/z) (Voxel), mittlere Intensität # 1 (EdU-Kanal) und SD-Intensitäten #1.
14. Exportieren Sie die Ergebnisse (Master Detail Report) mit der Excel-Export-Funktion .
15. Speichern Sie die Analysedatei, und schließen Sie die Software.

5. Bestimmung der Proliferationsraten von Organoiden

1. Öffnen Sie die in Schritt 4.14 exportierte Master-Detailberichtsdatei.
2. Für jedes analysierte Bild gibt es eine separate Registerkarte. Berechnen Sie die Flächen-/Voxelsumme für die Kerne und den EdU-Farbstoff für jedes Bild. Kopieren Sie dann alle resultierenden Daten in eine neue kollektive Registerkarte und gruppieren Sie alle Daten, die sich auf denselben Zeitpunkt beziehen.
3. Berechnen Sie dann die Gesamtfläche der Zellkerne (d. h. die Summe aus Hoechst33342⁺ Fläche und EdU⁺ Fläche) für jedes Bild.
4. Teilen Sie anschließend die Gesamtfläche durch sich selbst (= 100%) und die mittlere EdU⁺ -Fläche durch die Gesamtfläche (=% der EdU⁺ -DNA).
5. Plotten Sie den prozentualen Anteil der proliferativen DNA von BO- und AO-Organoiden auf der y-Achse und die verschiedenen Zeitpunkte auf der x-Achse.

Ergebnisse

Organoide, die 3 Tage nach der Trypsinisierung gezüchtet werden, sollten idealerweise zwischen 50 und 250 μm liegen, wie in Abbildung 2A dargestellt. Organoide, die deutlich größer sind, kehren ihre Polarität möglicherweise nicht effizient um. Größere Organoide können auch anfangen zu knospen, und wir haben festgestellt, dass diese Organoide auch Probleme mit einer effizienten Polaritätsumkehr haben können. Basal-out- und apik...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie eine Polaritätsumkehr in Standardkulturen von adulten Stammzellen aus Darmorganoiden induziert wird. Apikale Organoide dienen dem Zweck, Zugang zur apikalen Zelloberfläche zu erhalten, die in der Regel zum Organoidlumen hin orientiert ist. Die Möglichkeit, die apikale Oberfläche zu sondieren, kann für bestimmte Anwendungen von großer Bedeutung sein, da dies der Teil der Zellmembran ist, der unter physiologischen Bedingungen in vivo

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Biologix	07-6024
[Leu15]-Gastrin I human, ≥95% (HPLC)	Sigma-Aldrich	G-9145
µ-Slide 18 Well Glass Bottom	ibidi	81817
100X Penicillin-Streptomycin supplement for Media	Gibco/Thermo	15140122
A 83-01	Tocris Bioscience	2939/10
Anti-Adherence Rinsing Solution	StemCell Technologies	7010
arivis Pro	Zeiss	Version 4.2.2
B27 SerumFree Supplement (50X), liquid	Gibco/Thermo	17504044
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)	Abcam	ab145597
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye	Thermo Scientific	C10340
DMEM-F12	Gibco/Thermo	11320033
Geltrex	Gibco/Thermo	A1413202
GlutaMAX Supplement	Gibco/Thermo	35050061
HEPES Buffer Solution 1 M, liquid	Gibco/Thermo	15630056
Human FGF-basic	PeproTech	100-18B-100µG
Human HGF	PeproTech	100-39-100µG
Human IGF-I	PeproTech	100-11-100µG
Human NOGGIN (Mammalian)	PeproTech	120-10C-200µG
N-Acetyl-L-cysteine,cell culture tested, BioReagent	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Organoid Harvesting Solution	Thermo	C10340
Triton(TM) X-100,for molecular biology	Sigma-Aldrich	T8787-250ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco/Thermo	25300054