Generazione di organoidi apicali intestinali e valutazione del tasso di proliferazione degli organoidi mediante marcatura EdU

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di organoidi intestinali apicali da colture di organoidi standard incorporate in matrice. Delinea inoltre la successiva incorporazione di EdU in cellule che proliferano attivamente e la quantificazione semiautomatica di cellule EdU-positive.

Abstract

Qui, descriviamo la generazione di colture galleggianti di organoidi intestinali apicali da colture di organoidi intestinali inclusi in idrogel. Contemporaneamente, vengono stabilite colture di organoidi basali galleggianti per il confronto diretto tra organoidi apical-out e basal-out. Gli organoidi apicali e basali vengono successivamente sottoposti all'analogo della timidina 5-etinil-2'-desossiuridina (EdU), che viene integrato nel DNA di nuova sintesi durante la fase S della divisione cellulare. Questa incorporazione nel DNA può essere visualizzata in organoidi morfologicamente intatti utilizzando la microscopia confocale a scansione laser. Le cellule marcate con Hoechst33342 ed EdU vengono quindi quantificate in modo semiautomatico utilizzando un software di analisi delle immagini. Il calcolo della percentuale di cellule EdU-positive sul numero totale di cellule consente l'analisi della proliferazione cellulare in organoidi tridimensionali (3D). Nonostante sia utilizzato qui per l'analisi della proliferazione negli organoidi intestinali, il protocollo è applicabile anche all'analisi di colorazioni nucleo-specifiche di vario tipo in altri organoidi o colture cellulari bidimensionali.

Introduzione

Gli organoidi intestinali sono modelli tridimensionali in vitro che ricapitolano l'epitelio intestinale comprendente diversi tipi di cellule. Questi organoidi possono essere facilmente stabiliti da cellule staminali adulte isolate da cripte intestinali¹. Poiché gli organoidi sono molto più vicini all'epitelio in vivo, stanno diventando sempre più importanti nella ricerca biomedica. Gli organoidi dell'intestino non sono utilizzati solo per l'analisi dei meccanismi fisiologici (ad esempio, la segnalazione della nicchia intestinale ^2,3 e la differenziazione cellulare ^4,5) ma anche per la ricerca sulle malattie infettive ^6,7. Tuttavia, la crescita di cellule polarizzate in 3D che racchiudono un lume centrale è impegnativa, poiché la superficie cellulare apicale finisce per essere inaccessibile all'interno del lume dell'organoide. L'esame delle differenze tra le superfici cellulari apicali e basolaterali può essere importante negli studi metabolici, come esemplificato dalle differenze nell'assorbimento degli acidi grassi⁸ e dalla ricerca sulle malattie infettive 9,10,11,12.

La generazione dei cosiddetti organoidi apical-out è un'opzione facile per superare questo problema. Rimuovendo la matrice extracellulare da colture di organoidi standard (cioè organoidi basali, incorporati nella matrice) e seminando questi organoidi in un mezzo privo di matrice, è possibile indurre un interruttore di polarità⁹.

Come abbiamo precedentemente pubblicato, la maggior parte degli organoidi inverte la propria polarità entro 12 ore. Tuttavia, occorrono 48-72 ore per ottenere una coltura con più del 90% di organoidi apicali. Nonostante il loro vantaggio di consentire l'accesso alla superficie cellulare apicale, gli organoidi apicali mostrano una proliferazione significativamente ridotta dopo l'inversione di polarità, mentre i tassi di morte cellulare aumentano¹³. Il fattore dell'attività proliferativa può rappresentare una variabile confondente in varie analisi e dovrebbe essere tenuto a mente quando si progetta un esperimento.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la creazione di colture di organoidi apicali intestinali e di organoidi di controllo basali galleggianti per le analisi a valle. Inoltre, descriviamo la marcatura con 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), incorporata nel DNA di nuova sintesi e quindi marcante le cellule che proliferano attivamente. Descriviamo ulteriormente l'analisi semiautomatica del tasso di proliferazione degli organoidi utilizzando il software arivis Pro (Zeiss) mediante quantificazione di cellule EdU⁺ . Uno schema del processo è delineato nella Figura 1.

Protocollo

Sono stati utilizzati organoidi intestinali adulti derivati da cellule staminali di cani, stabiliti secondo Kramer et al., 2020¹⁴ . Sulla base delle linee guida del comitato etico istituzionale, l'uso del materiale tissutale raccolto durante l'escissione terapeutica o post mortem è incluso nel "consenso del proprietario per il trattamento" dell'università, che è stato firmato da tutti i proprietari dei pazienti.

1. Coltura di organoidi

1. Coltivare organoidi intestinali derivati da cellule staminali adulte incorporati nella matrice di estratto della membrana basale (BME) di scelta in piastre a 24 pozzetti e dividerli meccanicamente utilizzando pipette di vetro, come descritto in dettaglio in Pleguezuelos et al., 2020¹⁵.
   NOTA: Per il protocollo qui descritto, Geltrex è stato utilizzato come BME.
2. Rimuovere con cautela il terreno raffinato (Tabella 1) dagli organoidi incorporati nel BME.
3. Aggiungere 500 μl di tripsina-EDTA allo 0,05% per pozzetto e staccare tutte le cupole della matrice dal pozzetto pipettando ripetutamente su e giù. Trasferire gli organoidi in una provetta da 15 ml e risospendere bene per dissociare completamente la matrice di idrogel.
4. Incubare gli organoidi con tripsina-EDTA allo 0,05 % a 37 °C in un bagno d'acqua fino a quando tutti gli organoidi sono dissociati in singole cellule o piccoli gruppi di cellule.
5. Diluire la sospensione tripsina/cellulare con terreno basale (Tabella 1). Utilizzare almeno il doppio del terreno basale rispetto alla tripsina.
6. Centrifugare le celle a 8 °C a 420 × g per 5 min. Rimuovere quanto più surnatante possibile.
7. Cellule di semi incorporate nel BME in tanti pozzetti quanti sono stati utilizzati per la tripsinizzazione nel passaggio 1.3. e fornire loro un terreno raffinato (Tabella 1).
8. Incubare le cellule per 3 giorni in un incubatore per colture cellulari e procedere con il passaggio 2.1.

2. Induzione dell'inversione di polarità e marcatura EdU

1. Rimuovere con cautela il terreno dagli organoidi incorporati nel BME.
2. Aggiungere 500 μl di soluzione per la raccolta di organoidi a ciascun pozzetto e staccare tutte le cupole della matrice dal pozzetto pipettando ripetutamente su e giù. Trasferire gli organoidi in una provetta da 15 ml e risospendere bene per dissociare completamente la matrice di idrogel.
3. Incubare la provetta da 15 mL con ghiaccio per 1,5 ore. Agitare bene la provetta ogni 10 minuti per evitare la formazione di grumi degli organoidi e garantire una dissociazione uniforme dei restanti componenti dell'idrogel.
4. Durante l'incubazione, rivestire una piastra a 96 pozzetti con una soluzione antiaderente. Per ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti tripsinizzata al punto 1.3., rivestire 8 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente (RT).
5. Aggiungere almeno il doppio della quantità di PBS utilizzata per la soluzione di raccolta degli organoidi nella provetta da 15 mL e centrifugare a 8 °C a 150 × g per 5 minuti.
6. Rimuovere il surnatante e risospendere gli organoidi in 1 mL di PBS.
7. Trasferire 500 μl di sospensione organoide/PBS in una provetta separata da 15 mL e centrifugare nuovamente entrambe le provette a 8 °C a 150 × g per 5 minuti.
8. Rimuovere tutta la soluzione antiaderente dalla piastra a 96 pozzetti.
9. Rimuovere quanto più surnatante possibile dopo la centrifugazione.
10. Utilizzare una delle provette per la generazione di organoidi basali galleggianti (BO) e l'altra provetta per gli organoidi apical-out (AO).
11. Per gli organoidi BO, aggiungere 100 μl di terreno raffinato contenente il 7,5% di BME per pozzetto della piastra a 96 pozzetti in una provetta. Mescolare bene e disperdere gli organoidi in modo uniforme sul numero desiderato di pozzetti della piastra a 96 pozzetti pre-rivestita.
12. Per gli organoidi AO, aggiungere 100 μl di terreno semplice raffinato (senza l'aggiunta di BME) per pozzetto della piastra a 96 pozzetti all'altra provetta. Mescolare bene e disperdere gli organoidi in modo uniforme sul numero desiderato di pozzetti della piastra a 96 pozzetti pre-rivestita.
13. Incubare gli organoidi a 37 °C e 5% di CO₂ per 3 giorni.
    NOTA: Le differenze morfologiche inizieranno ad essere visibili dopo il giorno 1. Tuttavia, i risultati pubblicati in precedenza mostrano che la stragrande maggioranza degli organoidi impiega circa 3 giorni per presentare la polarità apicale¹³.
14. In punti temporali definiti, ad esempio 24 ore/48 ore/72 ore dopo l'induzione dell'inversione di polarità, aggiungere 50 μL di 3 μM di EdU diluito in terreno raffinato a tutti i pozzetti degli organoidi da marcare, per ricevere una concentrazione finale di 1 μM di EdU in ciascun pozzetto.
15. Incubare a 37 °C e 5% di CO₂ per 1,5 h_.
16. Raccogliere gli organoidi marcati con EdU utilizzando puntali a foro largo e trasferirli in una provetta da 15 ml.
17. Aggiungere una quantità uguale di PFA al 4% in ogni provetta (organoidi BO e AO; concentrazione finale di PFA = 2%) e mescolare accuratamente.
18. Incubare a RT per 15 min.
19. Aggiungere almeno il doppio della quantità di PBS in base al volume della provetta da 15 mL e centrifugare a 8 °C a 80 × g per 5 minuti.
20. Rimuovere il surnatante e risospendere gli organoidi in 1 mL di PBS.
21. Centrifugare nuovamente a 8 °C a 80 × g per 5 min.
22. Rimuovere il surnatante, risospendere gli organoidi in 1 mL di PBS e trasferirli in una provetta da 1,5 mL. Conservare gli organoidi a 4 °C fino all'esecuzione della reazione di colorazione EdU (vedere paragrafo 3).
23. Ripetere i passaggi 2.14-2.22 per ogni punto temporale da analizzare.

3. Reazione di colorazione EdU Click-it e colorazione Hoechst 33342

1. Centrifugare gli organoidi fissati (dal punto 2.22) in una provetta da 1,5 mL a 4 °C a 50 × g per 5 min.
2. Rimuovere il surnatante e risospendere gli organoidi in 1 mL di albumina sierica bovina (BSA) al 3% diluita in PBS utilizzando punte a foro largo.
3. Ripetere i passaggi 3.1. e 3.2 (fasi di lavaggio).
4. Rimuovere il surnatante e risospendere gli organoidi in 1 mL di Triton X-100 allo 0,5% diluito in PBS.
5. Incubare a RT per 20 min.
6. Centrifugare gli organoidi a RT a 50 × g per 5 min.
7. In una provetta nuova, preparare 1x additivo tampone mescolando 45 μl di H₂O con 5 μl di additivo tampone 10x.
8. In un'altra provetta, preparare il cocktail di reazione mescolando i seguenti componenti: 385,8 μl di H₂O, 43 μl di tampone di reazione 10x, 20 μl di CuSO, _4,1,2 μl di azoturo Alexa Fluor 647 e 50 μl o 1x di additivo tampone (dal passaggio 3.7.).
   NOTA: Questa miscela è sufficiente per cinque reazioni e può essere scalata su e giù in base al numero richiesto di reazioni di colorazione.
9. Ripetere i passaggi 3.1. e 3.2. due volte (fasi di lavaggio).
10. Rimuovere il surnatante e aggiungere 100 μL di Cocktail di Reazione (passaggio 3.8.) in ogni provetta con organoidi.
11. Incubare a RT per 30 minuti al buio.
12. Ripetere i passaggi 3.1. e 3.2 (fasi di lavaggio).
13. Centrifugare gli organoidi a 50 × g per 5 minuti a RT.
14. Risospendere organoidi in 1 mL da 10 μg/mL Hoechst33342 diluito in PBS.
15. Incubare a RT per 45 minuti al buio.
16. Ripetere i passaggi 3.1. e 3.2 (fasi di lavaggio).
17. Centrifugare gli organoidi a 50 × g per 5 min a 4 °C.
18. Organoidi di semi nella matrice BME di scelta in un vetrino compatibile con la microscopia confocale (ad es. μ-Slide 18 pozzetti)
19. Immagine di organoidi al microscopio confocale.

4. Analisi semiautomatica delle immagini

NOTA: Per questa analisi è stata utilizzata la versione 4.2.2 di arivis Pro (software di analisi delle immagini).

1. Importare le immagini del microscopio confocale nel software di analisi delle immagini e definire una cartella in cui verrà salvato il file di analisi. Utilizzare l'opzione Immagini come punti temporali per importare più immagini (immagini replicate, punti temporali diversi, trattamenti diversi, ecc.). Ogni immagine verrà quindi trattata come un singolo punto temporale, consentendo un facile passaggio da un'immagine all'altra.
2. Aprite il pannello di analisi e importate la pipeline di analisi fornita come File supplementare 1 (arivis_EdU_pipeline).
3. Usa lo strumento Posiziona Nuovi Oggetti e Sfera con il tag Organoide per circondare facilmente tutti gli organoidi ben separati.
4. Passa all'immagine successiva, cioè al punto temporale successivo, e procedi alla marcatura degli organoidi per tutte le immagini.
5. Per gli organoidi che sono molto vicini tra loro e quindi non possono essere separati utilizzando la modalità Sfera , apri l'elenco degli oggetti e attiva il tag Organoide.
6. Continuate a utilizzare lo strumento Disegna oggetti in modalità Poligono per marcare a mano i contorni degli organoidi.
   NOTA: Nell'elenco degli oggetti, tutti gli organoidi sono ora contrassegnati e assegnati a un punto temporale specifico. Questo punto temporale corrisponde all'ordine delle immagini importate nel passaggio 4.1. Questi punti temporali possono ora essere rinominati in modo che corrispondano al nome dell'immagine originale, se lo si preferisce.
7. Nell'elenco degli oggetti, contrassegnare tutti gli oggetti (=organoidi) e fare clic con il pulsante destro del mouse, quindi fare clic su Rimuovi tag per rimuovere il tag Manuale da tutti gli oggetti.
8. Disattiva il tag Organoide nell'elenco degli oggetti e contrassegna tutte le aree all'interno degli oggetti precedentemente definiti che devono essere escluse dall'analisi utilizzando lo strumento Disegna Oggetti in modalità Poligono . Queste aree possono includere cellule morte all'interno del lume dell'organoide o aree sfocate, che potrebbero distorcere l'analisi.
9. Quando apri l'elenco degli oggetti, assicurati che tutti gli organoidi siano elencati con il tag Organoid e che tutte le aree che devono essere escluse abbiano il tag Manual.
10. Avvia la pipeline di analisi facendo clic sulla freccia nel pannello in alto a sinistra.
    NOTA: Il software ora segmenta tutti i nuclei nei canali Hoechst33342 e EdU. Questa pipeline di analisi considera solo i nuclei segmentati di Hoechst33342⁺ ed EdU⁺ di dimensioni superiori a 15 μm² (cioè l'area nel segmento del nucleo) per garantire che i piccoli nuclei, molto probabilmente provenienti da cellule morte, siano esclusi dall'analisi.
11. Trovare i risultati dell'analisi nell'elenco degli oggetti facendo clic sul tag Colonne funzionalità .
12. Passa alla vista Dettagli master e seleziona il tag Organoidi nel pannello superiore e la funzione Primo punto temporale.
13. Nel pannello inferiore, selezionare le funzioni da visualizzare per organoide. Usa l'area di proiezione (x/y/z) (voxel), l'intensità media # 1 (canale EdU) e le intensità SD #1.
14. Esporta i risultati (Master Detail Report) utilizzando la funzione di esportazione Excel .
15. Salvare il file di analisi e chiudere il software.

5. Determinazione dei tassi di proliferazione degli organoidi

1. Aprire il file del report dettagli master esportato nel passaggio 4.14.
2. C'è una scheda separata per ogni immagine analizzata. Calcola la somma area/voxel per i nuclei e la colorazione EdU per ogni immagine. Quindi, copia tutti i dati risultanti in una nuova scheda collettiva e raggruppa tutti i dati che si riferiscono allo stesso punto temporale.
3. Quindi, calcola l'area totale dei nuclei cellulari (cioè la somma dell'area di Hoechst33342⁺ e dell'area EdU⁺ ) per ogni immagine.
4. Successivamente, dividere l'area totale per se stessa (= 100%) e l'area media di EdU⁺ per l'area totale (=percentuale di DNA EdU⁺ ).
5. Tracciare la percentuale di DNA proliferativo degli organoidi BO e AO sull'asse y e i diversi punti temporali sull'asse x.

Risultati

Gli organoidi coltivati per 3 giorni dopo la tripsinizzazione dovrebbero essere idealmente compresi tra 50 e 250 μm, come illustrato nella Figura 2A. Gli organoidi che sono considerevolmente più grandi di questo potrebbero non invertire la loro polarità in modo efficiente. Anche gli organoidi più grandi possono iniziare a germogliare e abbiamo notato che questi organoidi possono avere problemi anche con un'efficiente inversione di po...

Discussione

Questo protocollo descrive in dettaglio come indurre l'inversione di polarità in colture standard di organoidi intestinali derivati da cellule staminali adulte. Gli organoidi apicali hanno lo scopo di accedere alla superficie cellulare apicale, che di solito è orientata verso il lume dell'organoide. Essere in grado di sondare la superficie apicale può essere di grande importanza per alcune applicazioni, in quanto questa è la porzione della membrana cellulare che è esposta a tutto il...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Biologix	07-6024
[Leu15]-Gastrin I human, ≥95% (HPLC)	Sigma-Aldrich	G-9145
µ-Slide 18 Well Glass Bottom	ibidi	81817
100X Penicillin-Streptomycin supplement for Media	Gibco/Thermo	15140122
A 83-01	Tocris Bioscience	2939/10
Anti-Adherence Rinsing Solution	StemCell Technologies	7010
arivis Pro	Zeiss	Version 4.2.2
B27 SerumFree Supplement (50X), liquid	Gibco/Thermo	17504044
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)	Abcam	ab145597
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100G
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye	Thermo Scientific	C10340
DMEM-F12	Gibco/Thermo	11320033
Geltrex	Gibco/Thermo	A1413202
GlutaMAX Supplement	Gibco/Thermo	35050061
HEPES Buffer Solution 1 M, liquid	Gibco/Thermo	15630056
Human FGF-basic	PeproTech	100-18B-100µG
Human HGF	PeproTech	100-39-100µG
Human IGF-I	PeproTech	100-11-100µG
Human NOGGIN (Mammalian)	PeproTech	120-10C-200µG
N-Acetyl-L-cysteine,cell culture tested, BioReagent	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Organoid Harvesting Solution	Thermo	C10340
Triton(TM) X-100,for molecular biology	Sigma-Aldrich	T8787-250ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco/Thermo	25300054