著者は、彼の継続的な技術サポートのためにIkiel Ptitoに感謝します。 MPにNSERC助成金。

パート1：組織の前処理が行われるのは、Burkeらによると行う必要があります。 （2009）5。 <ol><li>簡単に言えば、組織はよくパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはホルマリンで灌流してください。これは通常、他の臓器を収穫するために使用される標準transcardial灌流によって達成することができます。本研究では被験者は深く、（10 mg / kgを、IM）塩酸ケタミンで鎮静したペントバルビタールナトリウムの過剰投与（25 mg / kgを、IV）を使用して、安楽死させ、完全に放血するまで0.1MのPBSでtranscardially灌流。これは、5分（〜1リットル）のためのPBS中4％パラホルムアルデヒド溶液が続いている。組織はよくparaformaldeyhde、グルタルアルデヒド、またはホルマリンで灌流してください。脳が定位、ブロックされた頭蓋骨から削除すべきである、凍結保護、および5冷凍、、定める量を重量を量った。 </li></ol>第2部：組織の系統的サンプリング、Burkeらによると。 （2009）6。 <ol><li>この例では、ベルベットモンキーの脳の前頭葉に焦点を当てた。参照のスペースは中央の溝から左半球の前頭極への皮質組織を含むように定義されていました。我々の目的のためにシリーズは50μmので切片化、皮質全体の10分の1のセクションに設定した。つの完全なシリーズは、クレシルバイオレット（シリーズ＃1）で染色した。シリーズ2は、分割されたので、セクションの半分は、ミエリンの啓示とアセチルコリンエステラーゼのための残りの半分のステンドグラス（特定の皮質下の領域の描写のため）のために金の塩化物で染色した。すべての他のシリーズは、当社の長期的な研究計画の一環として、抗原の保護区でバンクレジスタれた。 </li></ol>パート3：立体学（詳細については、ムートン2002を参照してください）4 <ol><li>細胞数の合計推定（N）は次式に基づいて計算されます。 N = SSF -1 xのASF -1 xのTSF -1 xのΣQ - SSFは、セクションのサンプリングの割合です、ASFは、地域のサンプリング率、厚さのサンプリング割合に応じTSF（組織の測定された厚みがディセクタ高さで割ったされている場所）、およびΣQです-カウント対象となるオブジェクトの合計数です。解剖する人の中。このプロトコルの次のセクションでは、SSF、ASF、TSFとΣQを決定する方法を示します。 </li><li>節のサンプリング分数（非コンピュータベース） <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>全体の基準のスペースは十分前方から後方と腹側の背側に定義する必要があります。この例では、前頭葉に興味を持っていたと前頭極（前方）の先端から中心溝（後方）と外側溝（腹側）までの領域として定義されており、島を除外しています。 </li><li>この特定の主題の前頭葉のために760のセクションの合計は、体系的にクレシルバイオレットで76ステンドグラスを収集した。ターゲットは、基準空間の全体にわたって10個のセクションだったので1月6日クレシルバイオレット染色された切片は1 / 60のセクションのサンプルの分画につながる、サンプリングされた。我々は、ランダムに最初の6クレシルバイオレットで染色したセクションのいずれかで開始し、体系的に、その後1 / 6サンプリング。 13セクションの合計は、選択対象（図2）のために採取した。 </li></ol></li><li> エリアのサンプル画（コンピューターベース） <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>パイロット研究では、約100から300 disectorsで参照空間をサンプリングするために、最適なグリッドサイズ、エリアサンプリングの分数を示します。前頭葉内に、2500μm2であるのグリッドサイズは、この主題は254 disectors（図2）の平均値が得られた。 disectorの大きさは、このケースでは、0から5まで約カウントオブジェクトの間の神経細胞を生成する必要があります。 </li></ol></li><li>厚さのサンプルのフラクション（コンピューターベース） <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>各disector場所で、組織の高さを測定し、この高さの割合は、サンプリングされ、これは厚さサンプリング分数として知られています。最後のオブジェクトにフォーカスが出たばかり表示されるまで測定された厚さを決定するために、最初のセルまで、z平面でフォーカスは、セクションの上部、すなわちにわずかにバックアップし、子音が鳴ります。細胞がボケがほとんどになるまで、組織の底を確認するには、z平面でフォーカス。 </li><li> z平面を通じて着目し、細胞はすべての深度で染色する必要がある、そうでない場合、これはセクションを再染色されるべき場合には、組織の染色または不均一な脱水の不完全浸透している可能性があります。この予防措置は、比較的厚い組織切片を通じてimmunoprobesの浸透を必要とする免疫染色組織のために特に重要です。このような理由から、免疫染色組織は軽く好塩基性染色（例えば、クレシルバイオレット、HEMAで対比されるべきであるtoxylin）正確にセクションの上部と底部を決定し、抗体の浸透性を確認するため。本研究ではセクションが50μmのミクロトーム設定でスライスされた。すべての組織の処理が完了した後、測定された組織の厚さは約65％の平均収縮で、17.9μm（図2）を平均した。これらの結果は、ルーチン組織プレパラート7で処理された組織の典型的な収縮を表すことに注意してください。 </li><li>典型的な研究のためのデフォルトのdisectorの高さは、10μmである。 disector高さと測定されたセクションの厚みの違いは、ガードの高さは、生物学的機能がカウントされていない組織の体積である。ガードの高さを使用するには（例えば、失われたキャップ）のセクショニング面で組織の損傷を避けることができます。 </li></ol></li><li>カウントされたオブジェクトの合計数、ΣQ - <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>認識誤りからのバイアスを避けるために、それは標準的な定義が関心のある特定の生物学的機能のために続いていることが不可欠です。このケースでは、我々は神経細胞を数えることにも興味があった。そのため、ニューロンがグリア細胞は、一般的に目に見える核小体と細胞質に欠けていたのに対し、目に見える中心部に位置する核小体と明確に定義された細胞質を持つものとして定義されました。この主題457ニューロンをカウントしたため。 </li></ol></li></ol>パート4：Stereologer -コンピュータによる立体学系（立体学リソースセンター、チェスター、MD） <ol><li> Stereologerシステムは、ユーザーがステップバイステップ方式で必要な情報を記入するよう求められます。 &quot;調査情報&quot;のセクションでは研究のパラメータが確立されています。基準スペースが研究のために定義する必要があるため、ボリュームのパラメータは（参照のスペースのためカヴァリエリの推定量を選択する必要があります）を選択してください。オブジェクトのボリュームも関心のオブジェクトの集団の数加重量を推定するためにここで選択することができる。この例では、基準空間の唯一のボリュームが選択されまし​​た。各オブジェクトの場合は、番号を選択し、この場合のニューロンで、興味の機能を定義します。 </li><li>ケースの初期化：このセクションでは、サンプリングの情報が確立されている。スラブサンプリング間隔を（組織の別のスラブが徹底的にスライスされ、各セクションを順番に配置されている場合は、ここで1を入力）を入力します。基準スペース（この場合は760）を介して行わセクションの合計数を入力してください。その後、セクションのサンプリング間隔を（この場合59）を入力します。システムは、サンプリングされるセクション（この場合13）の数を計算します。 </li><li>プローブパラメータ：このセクションでは、グリッドとdisectorのサイズを定義します。ボリュームの場合は、編集メニューの下のグリッド間隔を定義するために2.5倍、10倍の低倍率を使用してください。オブジェクトの倍率は100倍（NA 1.3または1.4）で行ってください。フレーム領域は、disectorの大きさですこの場合、我々は50％のスクリーンを使用。フレームの高さはdisectorの厚さであり、ここで10μm以下に設定。フレームの間隔は、グリッドのサイズです。私たちのパイロットスタディでは、150から200フレームの間の2500μmの利回りが比較的大きな基準空間を体系的、統一的な方法で間隔をあけていることがわかった。小規模な地域については、より小さいグリッドサイズを使用する必要があります。パイロット研究では、各特定の研究のための光プローブのパラメータを識別します。 </li><li>試験パラメータが確立されれば、組織を介してサンプリングすると、進むことができます。プログラムは最初のセクションをサンプリングするように要求されるステップ1：このプログラムは、セクションの参照領域をトレースするために、低倍率で、ユーザーに要求します。その後、システムはそのポイントが基準空間内に収まることを確認されるプローブのパラメータおよびユーザーに基づいて、セクションの上にグリッドを配置します。ポイントは基準空間内にない場合は、単にポイントをクリックすると、ボリュームに計算されませんステップ2：システムはフレームの間隔のパラメータに基づいて、基準空間上の新しいグリッドを配置します。交点は、基準空間内に収まることを確認してくださいステップ3：。。システムは、ユーザーがより高い倍率の目標に切り替え、最初のセクタにするためにステージを移動するプロンプトが表示されますは、 手順4：この時点でシステムはユーザが定義するプロンプトをセクションの上部と下部には、システムはz軸のサンプリング間隔を設定ステップ5：。その後、ユーザーは、z平面を通してdisector内にある各オブジェクトをクリックします。赤い線またはdisectorの底面に触れないオブジェクトはカウントされないことがあります。各オブジェクトがカウントされると、[次へ]をクリックします。ステージは次のdisectorと4と5が繰り返されるステップに移動します。一度、すべてのセクションに対してdisectorsのがカウントされている、システムは、検出対象に次の順番のセクションを挿入するようユーザーにプロンプ​​トが表示されます。シーケンシャルセクションのすべてが完了するまでステップ1〜5が繰り返されます。サンプリングされた。システムは、ASF、SSF、TSF、及びΣQの計算を提供します。これらのパラメータに基づいて、システムは、基準量を推定Nを生成し、CEの推定数とボリュームの両方になります。また、より効率的になることやCE（図2）を削減する勧告を与える。 </li></ol>パート5：代表的な結果： 公平な立体学は、基準空間内の細胞集団の効率的かつ信頼性の高い推定値を提供します。システマティックサンプリングと定義されている基準空間に依存するすべてが利用可能なコンピュータベースの立体的システムの数があります。我々は、0.042の平均CEで828百万​​（図3）以上になる2歳のvervetsの大脳皮質の総神経人口を推定するためにBioQuantライフサイエンスシステムを使用している。私たちは、その後、前頭葉は皮質ニューロン8の約半分数を占めていると推定するStereologerシステムを使用している。 <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="図1" /> 図1コンピュータベースの立体学システム。立体学システムの基本的なアップセットは、電動ステージ（XYZ）と同じ、顕微鏡、ステージコン ​​トローラ、ビデオカメラ、コンピュータ、およびソフトウェアです。最終的に選択されているシステムは、効率性、必要性、およびコスト分析に基づいている必要があります。 <div style="border:1px #000000 solid"><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2">検査情報</td></tr><tr><td>スタディ名</td><td>前頭皮質</td></tr><tr><td>治験責任医師</td><td>メガバイト</td></tr><tr><td>種</td><td> AG </td></tr><tr><td>リファレンススペース前頭葉</td><td>皮質</td></tr><tr><td colspan="2">ノート</td></tr><tr><td colspan="2">ケース情報</td></tr><tr><td>データコレクタ</td><td>メガバイト</td></tr><tr><td>日</td><td>年、2008年4月30日</td></tr><tr><td>グループ</td><td>コントロール</td></tr><tr><td>対象と</td><td> O26 </td></tr><tr><td colspan="2">ノート</td></tr><tr><td colspan="2">サンプリング特性</td></tr><tr><td>スラブサンプリング間隔</td><td> 1 </td></tr><tr><td>セクションの合計数</td><td> 760 </td></tr><tr><td>節のサンプリング間隔</td><td> 59 </td></tr><tr><td>始まるセクション</td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="2">分別</td></tr><tr><td> ASF </td><td> 0.0002 </td></tr><tr><td> SlabSF </td><td> 1.0000 </td></tr><tr><td> SSF </td><td> 0.0169 </td></tr><tr><td> TSF </td><td> 0.5587 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="6">結果の概要</td></tr><tr><td>パラメータ</td><td>プローブ</td><td>の名前</td><td>その結果</td><td> CE </td><td> SD </td></tr><tr><td>厚</td><td> --- </td><td> --- </td><td> 17.8996μ </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td>数</td><td> Disector </td><td>ニューロン</td><td> 243833769.1473 </td><td> 0.0474 </td><td> N / </td></tr><tr><td>ボリューム</td><td>カヴァリエーリポイントグリッド</td><td>ボリュームを</td><td> 1719769397954.1284μ^ 3 </td><td> 0.0078 </td><td> N / </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2">勧告</td></tr><tr><td>プローブ</td><td>オブジェクト番号（ニューロン） </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0.0474 </td></tr><tr><td>推奨事項</td><td> CEは許容範囲です。 </td></tr></tbody></テーブル&gt; <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2">閲覧Disectorsの数が多すぎると、Disector間隔を増やします。 </td></tr><tr><td>プローブ</td><td>地域の音量（ボリューム） </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0.0078 </td></tr><tr><td>推奨事項</td><td> CEは許容範囲です。 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> SECTIONの結果</td></tr><tr><td>セクション</td><td>ニューロンNumObjectsニューロンNumCorners </td><td>ボリュームRegPoints </td></tr><tr><td> 1。 40 </td><td> 48 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> 2。 26 </td><td> 52 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 3。 29 </td><td> 56 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> 4。 39 </td><td> 100 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 5。 49 </td><td> 112 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 6。 53 </td><td> 156 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 7。 65 </td><td> 128 </td><td> 106 </td></tr><tr><td> 8。 45 </td><td> 108 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 9。 52 </td><td> 100 </td><td> 77 </td></tr><tr><td> 10。 26 </td><td> 64 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 11。 21 </td><td> 44 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 12。 11 </td><td> 36 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> 13。 1 </td><td> 12 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table></div> Stereologerシステムで得られた源泉のローブから図2の結果。前頭葉では、立体的プロセスの最も長い部分は、体系的なサンプリングとセクショニングにあった。地形、体積と神経細胞の推定値は、各科目の約1日で完了した。左半球を採取し数は両半球のおおよその見積もりにテキストを2倍に。 <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="図3" /> 図3 BioQuantで得られた皮質神経人口推計。BioQuantシステムは前の細胞計数の正確な地形が必要です。その13セクションの平均値をサンプリングした。皮質地形とそれに続くボリュームの推定では、被験者ごとに15〜20時間の間にかかりました。地形は、2.5xの目的で行ったとカウントは、100倍油浸対物レンズ（NA 1.3）使用して行われました。すべての第百セクションは、サンプリングされた180 disectorsの平均と左半球全体に選ばれました。地形が完了した後は神経細胞のカウントは一日かかりました。左半球を採取し数は両半球のおおよその見積もりにテキストを2倍に。

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	<li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li><li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+cut+it:+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods.">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practices of Unbiased Stereology. , (2002).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space.">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+banking:+Making+the+most+of+your+research.">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP/PS1:+Neuroimaging,+Stereology,+And+Biochemistry.">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li><li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure.">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li><li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain.">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li></ol>

霊長類の脳における公平な立体学は、他の生体試料のそれと似ています。しかし、霊長類の脳の大きさを考えると、慎重な処理計画が50μmの時にスライスするときにベルベットモンキーの単一の半球は、1200以上のセクションをもたらすので、推奨されます。まず、定位、ブロックおよびサブジェクト間のセクションの標準的な平面を提供するブロック間の部分的なセクションを最小限に抑え?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereologer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stereology Resource Center (Chester, MD)</td>
<td>www.disector.com</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereology Tool-Kit Stereologer system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>StereoInvestigator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroBright Field (Willston, VT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain

ヒト以外の霊長類はヒトの脳の正常機能と疾患のプロセスを理解する上で重要な並進種です。公平な立体学、組織切片における生物学的なオブジェクトの定量化のための最先端のように受け入れられる方法<sup&gt; 2</sup&gt;、哺乳類の脳の生物​​学的機能の信頼性の高い構造データを生成します。<sup&gt; 3</sup&gt;。アプローチの主要なコンポーネントは、公平であり内のセルの番号とサイズ、繊維と毛細管の長さ、表面積、地域のボリュームと生物学的オブジェクトの空間分布の定量化と組み合わせて解剖学的に定義された構造（基準空間）、の（体系的ランダム）サンプリング基準空間<sup&gt; 4</sup&gt;。以前の方法に比べてこれらの立体的なアプローチの利点は、障害のある仮定と非検証可能なモデルに起因する系統的な（非ランダム）エラーの既知のすべての源の回避です。本研究では、ベルベットモンキーの脳の前頭皮質における総神経人口を推定するためにコンピュータ化された立体学の生物学的応用について説明（<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;）、2つの市販の立体学プログラム、BioQuantライフサイエンスとStereologer（図1）から支援を受けて。コントラストとBioQuant両方の結果の比較とに加え、<em&gt; Stereologer</em&gt;システム、本研究では、の詳細なプロトコルを提供します。<em&gt; Stereologer</em&gt;システム。

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Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

霊長類の脳の解剖学的組織は、ヒトの正常と病理学的状態に重要な洞察を提供することができます。公平な立体学が正確かつ効率的に所定の基準空間の合計ニューロンの数を（または他の細胞型）を推定するための方法です。<sup&gt; 1</sup&gt;。

非ヒト霊長類の脳の公平な立体学を：大切なのを知ること

The non-human primate is an important translational species for understanding the normal function and disease processes of the human brain. Unbiased ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.6K ビュー.  University of Montreal. 霊長類の脳の解剖学的組織は、ヒトの正常と病理学的状態に重要な洞察を提供することができます。公平な立体学が正確かつ効率的に所定の基準空間の合計ニューロンの数を（または他の細胞型）を推定するための方法です。 1。

ビデオ: Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

慢性実験における実装電極やマイクロダイアリシスプローブ用光重合型歯科用接着性レジンの応用

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

生物学

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

RNAまたは特定の脳領域からのタンパク質抽出用のラット脳の微小解剖

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

無傷の開発脳内の生体内の単一細胞のエレクトロポレーション

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In addition, the use of non-human primates has recently afforded the opportunity to naturally model complex psychiatric disorders such as alcohol abuse7. Here we describe a technique for blocking the brain in the coronal plane of the vervet monkey (Chlorocebus aethiops sabeus) in the intact skull in stereotaxic space. The method described here provides a standard plane of section between blocks and subjects and minimizes partial sections between blocks. Sectioning a block of tissue in the coronal plane also facilitates the delineation of an area of interest. This method provides manageable sized blocks since a single hemisphere of the vervet monkey yields more than 1200 sections when slicing at 50&mu;m. Furthermore by blocking the brain into 1cm blocks, it facilitates penetration of sucrose for cyroprotection and allows the block to be sliced on a standard cryostat.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of the normal processing of the brain. The anatomical organization of the primate brain can provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

定位空間における非ヒト霊長類の脳を解剖

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

The visual system in humans is considered the gateway to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive processes. It is therefore not surprising that quality of vision is tied to quality of life . Despite widespread clinical and basic research surrounding the causes of visual disorders, many forms of visual impairments, such as retinitis pigmentosa and macular degeneration, lack effective treatments. Non-human primates have the closest general features of eye development to that of humans. Not only do they have a similar vascular anatomy, but amongst other mammals, primates have the unique characteristic of having a region in the temporal retina specialized for high visual acuity, the fovea1. Here we describe a general technique for dissecting the primate retina to provide tissue for retinal histology, immunohistochemistry, laser capture microdissection, as well as light and electron microscopy. With the extended use of the non-human primate as a translational model, our hope is that improved understanding of the retina will provide insights into effective approaches towards attenuating or reversing the negative impact of visual disorders on the quality of life of affected individuals.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of development and aging. The anatomical organization of the primate retina may provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

脳へのゲートウェイ：霊長目の解剖

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Moxi Zミニ自動セルカウンターを用いた哺乳類細胞数、細胞サイズと細胞の健康の決定

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

生理学ラボデモンストレーション：ラットにおける糸球体濾過率

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

ラットの外側尾静脈から血液をサンプリング

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Reverse Dissection and DiceCT Reveal Otherwise Hidden Data in the Evolution of the Primate Face

Facial expressions, or facial displays, of social or emotional intent are produced by many mammalian taxa as a means of visually communicating with conspecifics at a close range. These displays are achieved by contraction of the mimetic muscles, which are skeletal muscle attached to the dermis of the face. Reverse dissection, removing the full facial mask from the skull and approaching mimetic muscles in reverse, is an effective but destructive way of revealing the morphology of mimetic muscles but it is destructive. DiceCT is a novel mechanism for visualizing skeletal muscles, including mimetic muscles, and isolating individual muscle fascicles for quantitative measurement. Additionally, DiceCT provides a non-destructive mechanism for visualizing muscles. The combined techniques of reverse dissection and DiceCT can be used to assess the evolutionary morphology of mimetic musculature as well as potential contraction strength and velocity in these muscles. This study further demonstrates that DiceCT can be used to accurately and reliably visualize mimetic muscles as well as reverse dissection and provide a non-destructive method for sampling mimetic muscles.

Facial expressions are a mode of visual communication produced by mimetic muscles. Here, we present protocols for the novel techniques of reverse dissection and DiceCT to fully visualize and assess mimetic muscles. These combined techniques can examine both morphological and physiological aspects of mimetic musculature to determine functional aspects.

郭清と霊長類の顔の進化における DiceCT 明らかにする別の方法で非表示のデータを逆に

Facial expressions, or facial displays, of social or emotional intent are produced by many mammalian taxa as a means of visually communicating with ...