著者は、彼の継続的な技術サポートのためにIkiel Ptitoに感謝します。 MPにNSERC助成金。

パート1：組織の前処理が行われるのは、Burkeらによると行う必要があります。 （2009）5。 <ol><li>簡単に言えば、組織はよくパラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはホルマリンで灌流してください。これは通常、他の臓器を収穫するために使用される標準transcardial灌流によって達成することができます。本研究では被験者は深く、（10 mg / kgを、IM）塩酸ケタミンで鎮静したペントバルビタールナトリウムの過剰投与（25 mg / kgを、IV）を使用して、安楽死させ、完全に放血するまで0.1MのPBSでtranscardially灌流。これは、5分（〜1リットル）のためのPBS中4％パラホルムアルデヒド溶液が続いている。組織はよくparaformaldeyhde、グルタルアルデヒド、またはホルマリンで灌流してください。脳が定位、ブロックされた頭蓋骨から削除すべきである、凍結保護、および5冷凍、、定める量を重量を量った。 </li></ol>第2部：組織の系統的サンプリング、Burkeらによると。 （2009）6。 <ol><li>この例では、ベルベットモンキーの脳の前頭葉に焦点を当てた。参照のスペースは中央の溝から左半球の前頭極への皮質組織を含むように定義されていました。我々の目的のためにシリーズは50μmので切片化、皮質全体の10分の1のセクションに設定した。つの完全なシリーズは、クレシルバイオレット（シリーズ＃1）で染色した。シリーズ2は、分割されたので、セクションの半分は、ミエリンの啓示とアセチルコリンエステラーゼのための残りの半分のステンドグラス（特定の皮質下の領域の描写のため）のために金の塩化物で染色した。すべての他のシリーズは、当社の長期的な研究計画の一環として、抗原の保護区でバンクレジスタれた。 </li></ol>パート3：立体学（詳細については、ムートン2002を参照してください）4 <ol><li>細胞数の合計推定（N）は次式に基づいて計算されます。 N = SSF -1 xのASF -1 xのTSF -1 xのΣQ - SSFは、セクションのサンプリングの割合です、ASFは、地域のサンプリング率、厚さのサンプリング割合に応じTSF（組織の測定された厚みがディセクタ高さで割ったされている場所）、およびΣQです-カウント対象となるオブジェクトの合計数です。解剖する人の中。このプロトコルの次のセクションでは、SSF、ASF、TSFとΣQを決定する方法を示します。 </li><li>節のサンプリング分数（非コンピュータベース） <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>全体の基準のスペースは十分前方から後方と腹側の背側に定義する必要があります。この例では、前頭葉に興味を持っていたと前頭極（前方）の先端から中心溝（後方）と外側溝（腹側）までの領域として定義されており、島を除外しています。 </li><li>この特定の主題の前頭葉のために760のセクションの合計は、体系的にクレシルバイオレットで76ステンドグラスを収集した。ターゲットは、基準空間の全体にわたって10個のセクションだったので1月6日クレシルバイオレット染色された切片は1 / 60のセクションのサンプルの分画につながる、サンプリングされた。我々は、ランダムに最初の6クレシルバイオレットで染色したセクションのいずれかで開始し、体系的に、その後1 / 6サンプリング。 13セクションの合計は、選択対象（図2）のために採取した。 </li></ol></li><li> エリアのサンプル画（コンピューターベース） <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>パイロット研究では、約100から300 disectorsで参照空間をサンプリングするために、最適なグリッドサイズ、エリアサンプリングの分数を示します。前頭葉内に、2500μm2であるのグリッドサイズは、この主題は254 disectors（図2）の平均値が得られた。 disectorの大きさは、このケースでは、0から5まで約カウントオブジェクトの間の神経細胞を生成する必要があります。 </li></ol></li><li>厚さのサンプルのフラクション（コンピューターベース） <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>各disector場所で、組織の高さを測定し、この高さの割合は、サンプリングされ、これは厚さサンプリング分数として知られています。最後のオブジェクトにフォーカスが出たばかり表示されるまで測定された厚さを決定するために、最初のセルまで、z平面でフォーカスは、セクションの上部、すなわちにわずかにバックアップし、子音が鳴ります。細胞がボケがほとんどになるまで、組織の底を確認するには、z平面でフォーカス。 </li><li> z平面を通じて着目し、細胞はすべての深度で染色する必要がある、そうでない場合、これはセクションを再染色されるべき場合には、組織の染色または不均一な脱水の不完全浸透している可能性があります。この予防措置は、比較的厚い組織切片を通じてimmunoprobesの浸透を必要とする免疫染色組織のために特に重要です。このような理由から、免疫染色組織は軽く好塩基性染色（例えば、クレシルバイオレット、HEMAで対比されるべきであるtoxylin）正確にセクションの上部と底部を決定し、抗体の浸透性を確認するため。本研究ではセクションが50μmのミクロトーム設定でスライスされた。すべての組織の処理が完了した後、測定された組織の厚さは約65％の平均収縮で、17.9μm（図2）を平均した。これらの結果は、ルーチン組織プレパラート7で処理された組織の典型的な収縮を表すことに注意してください。 </li><li>典型的な研究のためのデフォルトのdisectorの高さは、10μmである。 disector高さと測定されたセクションの厚みの違いは、ガードの高さは、生物学的機能がカウントされていない組織の体積である。ガードの高さを使用するには（例えば、失われたキャップ）のセクショニング面で組織の損傷を避けることができます。 </li></ol></li><li>カウントされたオブジェクトの合計数、ΣQ - <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li>認識誤りからのバイアスを避けるために、それは標準的な定義が関心のある特定の生物学的機能のために続いていることが不可欠です。このケースでは、我々は神経細胞を数えることにも興味があった。そのため、ニューロンがグリア細胞は、一般的に目に見える核小体と細胞質に欠けていたのに対し、目に見える中心部に位置する核小体と明確に定義された細胞質を持つものとして定義されました。この主題457ニューロンをカウントしたため。 </li></ol></li></ol>パート4：Stereologer -コンピュータによる立体学系（立体学リソースセンター、チェスター、MD） <ol><li> Stereologerシステムは、ユーザーがステップバイステップ方式で必要な情報を記入するよう求められます。 &quot;調査情報&quot;のセクションでは研究のパラメータが確立されています。基準スペースが研究のために定義する必要があるため、ボリュームのパラメータは（参照のスペースのためカヴァリエリの推定量を選択する必要があります）を選択してください。オブジェクトのボリュームも関心のオブジェクトの集団の数加重量を推定するためにここで選択することができる。この例では、基準空間の唯一のボリュームが選択されまし​​た。各オブジェクトの場合は、番号を選択し、この場合のニューロンで、興味の機能を定義します。 </li><li>ケースの初期化：このセクションでは、サンプリングの情報が確立されている。スラブサンプリング間隔を（組織の別のスラブが徹底的にスライスされ、各セクションを順番に配置されている場合は、ここで1を入力）を入力します。基準スペース（この場合は760）を介して行わセクションの合計数を入力してください。その後、セクションのサンプリング間隔を（この場合59）を入力します。システムは、サンプリングされるセクション（この場合13）の数を計算します。 </li><li>プローブパラメータ：このセクションでは、グリッドとdisectorのサイズを定義します。ボリュームの場合は、編集メニューの下のグリッド間隔を定義するために2.5倍、10倍の低倍率を使用してください。オブジェクトの倍率は100倍（NA 1.3または1.4）で行ってください。フレーム領域は、disectorの大きさですこの場合、我々は50％のスクリーンを使用。フレームの高さはdisectorの厚さであり、ここで10μm以下に設定。フレームの間隔は、グリッドのサイズです。私たちのパイロットスタディでは、150から200フレームの間の2500μmの利回りが比較的大きな基準空間を体系的、統一的な方法で間隔をあけていることがわかった。小規模な地域については、より小さいグリッドサイズを使用する必要があります。パイロット研究では、各特定の研究のための光プローブのパラメータを識別します。 </li><li>試験パラメータが確立されれば、組織を介してサンプリングすると、進むことができます。プログラムは最初のセクションをサンプリングするように要求されるステップ1：このプログラムは、セクションの参照領域をトレースするために、低倍率で、ユーザーに要求します。その後、システムはそのポイントが基準空間内に収まることを確認されるプローブのパラメータおよびユーザーに基づいて、セクションの上にグリッドを配置します。ポイントは基準空間内にない場合は、単にポイントをクリックすると、ボリュームに計算されませんステップ2：システムはフレームの間隔のパラメータに基づいて、基準空間上の新しいグリッドを配置します。交点は、基準空間内に収まることを確認してくださいステップ3：。。システムは、ユーザーがより高い倍率の目標に切り替え、最初のセクタにするためにステージを移動するプロンプトが表示されますは、 手順4：この時点でシステムはユーザが定義するプロンプトをセクションの上部と下部には、システムはz軸のサンプリング間隔を設定ステップ5：。その後、ユーザーは、z平面を通してdisector内にある各オブジェクトをクリックします。赤い線またはdisectorの底面に触れないオブジェクトはカウントされないことがあります。各オブジェクトがカウントされると、[次へ]をクリックします。ステージは次のdisectorと4と5が繰り返されるステップに移動します。一度、すべてのセクションに対してdisectorsのがカウントされている、システムは、検出対象に次の順番のセクションを挿入するようユーザーにプロンプ​​トが表示されます。シーケンシャルセクションのすべてが完了するまでステップ1〜5が繰り返されます。サンプリングされた。システムは、ASF、SSF、TSF、及びΣQの計算を提供します。これらのパラメータに基づいて、システムは、基準量を推定Nを生成し、CEの推定数とボリュームの両方になります。また、より効率的になることやCE（図2）を削減する勧告を与える。 </li></ol>パート5：代表的な結果： 公平な立体学は、基準空間内の細胞集団の効率的かつ信頼性の高い推定値を提供します。システマティックサンプリングと定義されている基準空間に依存するすべてが利用可能なコンピュータベースの立体的システムの数があります。我々は、0.042の平均CEで828百万​​（図3）以上になる2歳のvervetsの大脳皮質の総神経人口を推定するためにBioQuantライフサイエンスシステムを使用している。私たちは、その後、前頭葉は皮質ニューロン8の約半分数を占めていると推定するStereologerシステムを使用している。 <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="図1" /> 図1コンピュータベースの立体学システム。立体学システムの基本的なアップセットは、電動ステージ（XYZ）と同じ、顕微鏡、ステージコン ​​トローラ、ビデオカメラ、コンピュータ、およびソフトウェアです。最終的に選択されているシステムは、効率性、必要性、およびコスト分析に基づいている必要があります。 <div style="border:1px #000000 solid"><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2">検査情報</td></tr><tr><td>スタディ名</td><td>前頭皮質</td></tr><tr><td>治験責任医師</td><td>メガバイト</td></tr><tr><td>種</td><td> AG </td></tr><tr><td>リファレンススペース前頭葉</td><td>皮質</td></tr><tr><td colspan="2">ノート</td></tr><tr><td colspan="2">ケース情報</td></tr><tr><td>データコレクタ</td><td>メガバイト</td></tr><tr><td>日</td><td>年、2008年4月30日</td></tr><tr><td>グループ</td><td>コントロール</td></tr><tr><td>対象と</td><td> O26 </td></tr><tr><td colspan="2">ノート</td></tr><tr><td colspan="2">サンプリング特性</td></tr><tr><td>スラブサンプリング間隔</td><td> 1 </td></tr><tr><td>セクションの合計数</td><td> 760 </td></tr><tr><td>節のサンプリング間隔</td><td> 59 </td></tr><tr><td>始まるセクション</td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="2">分別</td></tr><tr><td> ASF </td><td> 0.0002 </td></tr><tr><td> SlabSF </td><td> 1.0000 </td></tr><tr><td> SSF </td><td> 0.0169 </td></tr><tr><td> TSF </td><td> 0.5587 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="6">結果の概要</td></tr><tr><td>パラメータ</td><td>プローブ</td><td>の名前</td><td>その結果</td><td> CE </td><td> SD </td></tr><tr><td>厚</td><td> --- </td><td> --- </td><td> 17.8996μ </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td>数</td><td> Disector </td><td>ニューロン</td><td> 243833769.1473 </td><td> 0.0474 </td><td> N / </td></tr><tr><td>ボリューム</td><td>カヴァリエーリポイントグリッド</td><td>ボリュームを</td><td> 1719769397954.1284μ^ 3 </td><td> 0.0078 </td><td> N / </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2">勧告</td></tr><tr><td>プローブ</td><td>オブジェクト番号（ニューロン） </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0.0474 </td></tr><tr><td>推奨事項</td><td> CEは許容範囲です。 </td></tr></tbody></テーブル&gt; <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2">閲覧Disectorsの数が多すぎると、Disector間隔を増やします。 </td></tr><tr><td>プローブ</td><td>地域の音量（ボリューム） </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0.0078 </td></tr><tr><td>推奨事項</td><td> CEは許容範囲です。 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> SECTIONの結果</td></tr><tr><td>セクション</td><td>ニューロンNumObjectsニューロンNumCorners </td><td>ボリュームRegPoints </td></tr><tr><td> 1。 40 </td><td> 48 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> 2。 26 </td><td> 52 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 3。 29 </td><td> 56 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> 4。 39 </td><td> 100 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 5。 49 </td><td> 112 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 6。 53 </td><td> 156 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 7。 65 </td><td> 128 </td><td> 106 </td></tr><tr><td> 8。 45 </td><td> 108 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 9。 52 </td><td> 100 </td><td> 77 </td></tr><tr><td> 10。 26 </td><td> 64 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 11。 21 </td><td> 44 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 12。 11 </td><td> 36 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> 13。 1 </td><td> 12 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table></div> Stereologerシステムで得られた源泉のローブから図2の結果。前頭葉では、立体的プロセスの最も長い部分は、体系的なサンプリングとセクショニングにあった。地形、体積と神経細胞の推定値は、各科目の約1日で完了した。左半球を採取し数は両半球のおおよその見積もりにテキストを2倍に。 <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="図3" /> 図3 BioQuantで得られた皮質神経人口推計。BioQuantシステムは前の細胞計数の正確な地形が必要です。その13セクションの平均値をサンプリングした。皮質地形とそれに続くボリュームの推定では、被験者ごとに15〜20時間の間にかかりました。地形は、2.5xの目的で行ったとカウントは、100倍油浸対物レンズ（NA 1.3）使用して行われました。すべての第百セクションは、サンプリングされた180 disectorsの平均と左半球全体に選ばれました。地形が完了した後は神経細胞のカウントは一日かかりました。左半球を採取し数は両半球のおおよその見積もりにテキストを2倍に。

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	<li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li><li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+cut+it:+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods.">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practices of Unbiased Stereology. , (2002).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space.">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+banking:+Making+the+most+of+your+research.">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP/PS1:+Neuroimaging,+Stereology,+And+Biochemistry.">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li><li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure.">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li><li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain.">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li></ol>

霊長類の脳における公平な立体学は、他の生体試料のそれと似ています。しかし、霊長類の脳の大きさを考えると、慎重な処理計画が50μmの時にスライスするときにベルベットモンキーの単一の半球は、1200以上のセクションをもたらすので、推奨されます。まず、定位、ブロックおよびサブジェクト間のセクションの標準的な平面を提供するブロック間の部分的なセクションを最小限に抑え?...

<table><tbody><tr><td>Stereologer</td><td>Stereology Resource Center (Chester, MD)</td><td>www.disector.com</td><td></td></tr><tr><td>Stereology Tool-Kit Stereologer system</td><td>BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain

ヒト以外の霊長類はヒトの脳の正常機能と疾患のプロセスを理解する上で重要な並進種です。公平な立体学、組織切片における生物学的なオブジェクトの定量化のための最先端のように受け入れられる方法<sup&gt; 2</sup&gt;、哺乳類の脳の生物​​学的機能の信頼性の高い構造データを生成します。<sup&gt; 3</sup&gt;。アプローチの主要なコンポーネントは、公平であり内のセルの番号とサイズ、繊維と毛細管の長さ、表面積、地域のボリュームと生物学的オブジェクトの空間分布の定量化と組み合わせて解剖学的に定義された構造（基準空間）、の（体系的ランダム）サンプリング基準空間<sup&gt; 4</sup&gt;。以前の方法に比べてこれらの立体的なアプローチの利点は、障害のある仮定と非検証可能なモデルに起因する系統的な（非ランダム）エラーの既知のすべての源の回避です。本研究では、ベルベットモンキーの脳の前頭皮質における総神経人口を推定するためにコンピュータ化された立体学の生物学的応用について説明（<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;）、2つの市販の立体学プログラム、BioQuantライフサイエンスとStereologer（図1）から支援を受けて。コントラストとBioQuant両方の結果の比較とに加え、<em&gt; Stereologer</em&gt;システム、本研究では、の詳細なプロトコルを提供します。<em&gt; Stereologer</em&gt;システム。

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Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

霊長類の脳の解剖学的組織は、ヒトの正常と病理学的状態に重要な洞察を提供することができます。公平な立体学が正確かつ効率的に所定の基準空間の合計ニューロンの数を（または他の細胞型）を推定するための方法です。<sup&gt; 1</sup&gt;。

非ヒト霊長類の脳の公平な立体学を：大切なのを知ること

The non-human primate is an important translational species for understanding the normal function and disease processes of the human brain. Unbiased ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.7K ビュー.  University of Montreal. 霊長類の脳の解剖学的組織は、ヒトの正常と病理学的状態に重要な洞察を提供することができます。公平な立体学が正確かつ効率的に所定の基準空間の合計ニューロンの数を（または他の細胞型）を推定するための方法です。 1。

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Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In addition, the use of non-human primates has recently afforded the opportunity to naturally model complex psychiatric disorders such as alcohol abuse7. Here we describe a technique for blocking the brain in the coronal plane of the vervet monkey (Chlorocebus aethiops sabeus) in the intact skull in stereotaxic space. The method described here provides a standard plane of section between blocks and subjects and minimizes partial sections between blocks. Sectioning a block of tissue in the coronal plane also facilitates the delineation of an area of interest. This method provides manageable sized blocks since a single hemisphere of the vervet monkey yields more than 1200 sections when slicing at 50&mu;m. Furthermore by blocking the brain into 1cm blocks, it facilitates penetration of sucrose for cyroprotection and allows the block to be sliced on a standard cryostat.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of the normal processing of the brain. The anatomical organization of the primate brain can provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

定位空間における非ヒト霊長類の脳を解剖

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

生物学

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1. To achieve this goal 6-10 systematic sections should be probed covering the entire structure. Typically this involves processing 1/5 sections which leaves a significant amount of material unprocessed. In order to maximize the material, we propose an inexpensive method for preserving fixed tissue as part of a long-term storage research plan. As tissue is sliced and processed for the desired stain or antibody, alternate sections should be systematically placed in antigen preserve at -20&deg;C for future processing. Using 24-well plates, sections can be placed in order for future retrieval. Using this method, tissue can be stored and processed for immunohistochemistry over the course of years.

Brain banking and systematic sampling of biological material provides the basis for unbiased stereology and maximizes the potential data obtained from each specimen.

脳バンキング：あなたの研究の標本のほとんどを作る

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1.  To ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

全モンキー脳の大規模なタンパク質の検出のためのバッチの免疫染色

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a comprehensive survey of the morphological characteristics observed among a selective neuronal population. Combination of these techniques constitutes a novel approach for the collection and analysis of neuroanatomical data. Together, these techniques enable large-scale, and therefore more comprehensive, sampling of selective neuronal populations and establish unbiased quantitative methods for describing morphologically unique neuronal classes within a population.
The protocol outlines the use of modified rabies virus to selectively label neurons. G-deleted rabies virus acts like a retrograde tracer following stereotaxic injection into a target brain structure of interest and serves as a vehicle for the delivery and expression of EGFP in neurons. Large numbers of neurons are infected using this technique and express GFP throughout their dendrites, producing &#34;Golgi-like&#34; complete fills of individual neurons. Accordingly, the virus-mediated retrograde tracing method improves upon traditional dye-based retrograde tracing techniques by producing complete intracellular fills.
Individual well-isolated neurons spanning all regions of the brain area under study are selected for reconstruction in order to obtain a representative sample of neurons. The protocol outlines procedures to reconstruct cell bodies and complete dendritic arborization patterns of labeled neurons spanning multiple tissue sections. Morphological data, including positions of each neuron within the brain structure, are extracted for further analysis. Standard programming functions were utilized to perform independent cluster analyses and cluster evaluations based on morphological metrics. To verify the utility of these analyses, statistical evaluation of a cluster analysis performed on 160 neurons reconstructed in the thalamic reticular nucleus of the thalamus (TRN) of the macaque monkey was made. Both the original cluster analysis and the statistical evaluations performed here indicate that TRN neurons are separated into three subpopulations, each with unique morphological characteristics.

This protocol describes large-scale reconstructions of selective neuronal populations, labeled following retrograde infection with a modified rabies virus expressing fluorescent markers, and independent, unbiased cluster analyses that enable comprehensive characterization of morphological metrics among distinct neuronal subclasses.

大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

神経科学

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells or structures. These methods have been revolutionary for quantitative analysis of the mammalian brain, in which volumetric cell populations are too high to count manually, and stereology is now the technique of choice whenever estimates of three-dimensional quantities need to be extracted from measurements on two-dimensional sections. All stereological methods are in principle unbiased; however, they rely on proper knowledge about the structure of interest and the characteristics of the tissue. Stereology is based on Systematic Uniformly Random Sampling (SURS), with adjustment of sampling to the most efficient level in respect to precision, providing reliable, quantitative information about the whole structure of interest. Here we present the optical fractionator in conjunction with BrdU immunohistochemistry to estimate the production and survival of newly-formed neurons in the granule cell layer (including the sub-granular zone) of the rat hippocampus following electroconvulsive stimulation, which is among the most potent stimulators of neurogenesis. The optical fractionator technique is designed to provide estimates of the total number of cells from thick sections sampled from the full structure. Thick sections provide the opportunity to observe cells in their full 3-D extent and thus, allow for easy and robust cell classification based on morphological criteria. When correctly implemented, the sensitivity and efficiency of the optical fractionator provides accurate estimates with a fixed and predetermined precision.

Here, we present a stereological method, the optical fractionator, used to quantify the formation of new neurons, and their survival, in the rat hippocampus following electroconvulsive stimulation. When correctly implemented, the sensitivity and efficiency of stereological methods ensures accurate estimates with a fixed and predetermined precision.

電気ショック療法のラットモデルにおける細胞数の推定のための光学分画器技術

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

対称Bihemispheric死後脳人間に健康と病理学的脳条件を研究するためにカッティング

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

医学

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the substantia nigra, is essential. To estimate the total dopaminergic neuron number, unbiased stereology using the optical fractionator method is currently considered the gold standard. Because the theory behind the optical fractionator method is complex and because stereology is difficult to achieve without specialized equipment, several commercially available complete stereology systems that include the necessary software do exist, purely for cell counting reasons. Since purchasing a specialized stereology setup is not always feasible, for many reasons, this report describes a method for the stereological estimation of dopaminergic neuronal cell counts using standard microscopy equipment, including a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane) with imaging software, and a computer for analysis. A step-by-step explanation is given on how to perform stereological quantification using the optical fractionator method, and pre-programmed files for the calculation of estimated cell counts are provided. To assess the accuracy of this method, a comparison to data obtained from a commercially available stereology apparatus was performed. Comparable cell numbers were found using this protocol and the stereology device, thus demonstrating the precision of this protocol for unbiased stereology.

This work presents a step-by-step protocol for the unbiased stereological estimation of dopaminergic neuronal cell numbers in the mouse substantia nigra using standard microscopy equipment (i.e., a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane), and public domain software for digital image analysis.

光分留と標準的な顕微鏡装置を用いたマウス中脳のドーパミン作動性ニューロン数の薬剤の評価

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

A MRI-Based Toolbox for Neurosurgical Planning in Nonhuman Primates

In this paper, we outline a method for surgical preparation that allows for the practical planning of a variety of neurosurgeries in NHPs solely using data extracted from magnetic resonance imaging (MRI). This protocol allows for the generation of 3D printed anatomically accurate physical models of the brain and skull, as well as an agarose gel model of the brain modeling some of the mechanical properties of the brain. These models can be extracted from MRI using brain extraction software for the model of the brain, and custom code for the model of the skull. The preparation protocol takes advantage of state-of-the-art 3D printing technology to make interfacing brains, skulls, and molds for gel brain models. The skull and brain models can be used to visualize brain tissue inside the skull with the addition of a craniotomy in the custom code, allowing for better preparation for surgeries directly involving the brain. The applications of these methods are designed for surgeries involved in neurological stimulation and recording as well as injection, but the versatility of the system allows for future expansion of the protocol, extraction techniques, and models to a wider scope of surgeries.

The method outlined below aims to provide a comprehensive protocol for the preparation of nonhuman primate (NHP) neurosurgery using a novel combination of three-dimensional (3D) printing methods and MRI data extraction.

非ヒト霊長類の脳神経外科計画のためのMRIベースのツールボックス

In this paper, we outline a method for surgical preparation that allows for the practical planning of a variety of neurosurgeries in NHPs solely using ...

生物工学

NHP脳神経外科計画のためのMRIからの自動3D脳と頭蓋骨のモデリング

A Neural Implant Design Toolbox for Nonhuman Primates

This paper describes an in-house method of 3D brain and skull modeling from magnetic resonance imaging (MRI) tailored for nonhuman primate (NHP) neurosurgical planning. This automated, computational software-based technique provides an efficient way of extracting brain and skull features from MRI files as opposed to traditional manual extraction techniques using imaging software. Furthermore, the procedure provides a method for visualizing the brain and craniotomized skull together for intuitive, virtual surgical planning. This generates a drastic reduction in time and resources from those required by past work, which relied on iterative 3D printing. The skull modeling process creates a footprint that is exported into modeling software to design custom-fit cranial chambers and headposts for surgical implantation. Custom-fit surgical implants minimize gaps between the implant and the skull that could introduce complications, including infection or decreased stability. By implementing these pre-surgical steps, surgical and experimental complications are reduced. These techniques can be adapted for other surgical processes, facilitating more efficient and effective experimental planning for researchers and, potentially, neurosurgeons.

著者スポットライト:NHP研究における脳神経外科計画の強化のための脳と頭蓋骨の合理化モデリング

This paper outlines automated processes for nonhuman primate neurosurgical planning based on magnetic resonance imaging (MRI) scans. These techniques use procedural steps in programming and design platforms to support customized implant design for NHPs. The validity of each component can then be confirmed using three-dimensional (3D) printed life-size anatomical models.