Gli autori desiderano ringraziare Ikiel Ptito per il suo continuo supporto tecnico. NSERC concedere a MP.

Parte 1: Pre-trattamento dei tessuti deve essere fatto secondo Burke et al. (2009) 5. <ol><li> In breve, il tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeide, glutaraldeide, o formalina. Questo può essere raggiunto attraverso standard di perfusione transcardial tipicamente usato per raccogliere altri organi. Nel presente studio il soggetto era profondamente sedato con cloridrato di ketamina (10 mg / kg, im), eutanasia con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (25 mg / kg, iv) e perfusi transcardially con 0,1 M PBS fino a completo dissanguato. Questa è seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 5 min (~ 1 litro). Tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeyhde, gluteraldehyde, o formalina. Il cervello deve essere stereotaxically bloccato, rimosso dal cranio, pesato, volume determinato, crioprotetti, e congelati 5. </li></ol> Parte 2: campionamento sistematico del tessuto, secondo Burke et al. (2009) 6. <ol><li> In questo esempio ci siamo concentrati sul lobo frontale del cervello vervet. Lo spazio di riferimento è stato definito per includere tessuto corticale dal solco centrale al polo frontale dell&#39;emisfero sinistro. Per i nostri scopi la serie sono stati fissati a 1 / 10 sezioni in tutta la corteccia, sezionati a 50 micron. Una serie completa era macchiata di violetto cresolo (serie # 1). Serie 2 è stata suddivisa in modo che la metà delle sezioni sono state colorate con cloruro d&#39;oro per la rivelazione della mielina e macchiato altra metà per l&#39;acetilcolina esterasi (per la definizione di talune regioni subcorticali). Tutte le altre serie sono state sopraelevate nel preservare l&#39;antigene come parte dei nostri piani a lungo termine della ricerca. </li></ol> Parte 3: stereologia (per maggiori dettagli, vedere Mouton 2002) 4 <ol><li> La stima totale del numero di cellule (N) è calcolato in base alla seguente equazione: N = -1 x ssf asf -1 x -1 x tsf Σ Q - Dove SSF è la frazione di campionamento sezione, asf è la frazione di campionamento dell&#39;area, TSF se la frazione di campionamento spessore (dove lo spessore del tessuto misurato viene diviso per l&#39;altezza dissettore) e Σ Q - è il numero totale di oggetti di interesse contati all&#39;interno del dissettore. Le sezioni successive di questo protocollo mostrano come determinare la SSF, asf, TSF e Σ Q. </li><li> Sezione Frazione di campionamento (non su computer) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Lo spazio intero riferimento devono essere ben definiti da anteriore a posteriore e dorsale a ventrale. In questo esempio siamo stati interessati al lobo frontale e lo hanno definito come la regione dalla punta del polo frontale (anteriore) al solco centrale (posteriore) e il solco laterale (ventrale) ed esclusa l&#39;insula. </li><li> Per il lobo frontale di questo particolare argomento per un totale di 760 sezioni sono stati sistematicamente raccolti con 76 colorati per violetto cresolo. Dal momento che l&#39;obiettivo era di 10 sezioni in tutto lo spazio di riferimento sezioni viola 1 / 6 cresile macchiati sono stati campionati, portando ad una frazione sezione campione di circa 1 / 60. Siamo a caso iniziato con una delle prime 6 sezioni cresile colorate viola e sistematicamente a campionamento 1 / 6 dopo. Un totale di 13 sezioni sono stati campionati per il soggetto selezionato (Figura 2). </li></ol></li><li> Area Frazione del campione (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Uno studio pilota indicherà la dimensione ottimale della griglia, la Frazione di campionamento Zona, per esempio lo spazio di riferimento con circa 100-300 disectors. All&#39;interno del lobo frontale, una dimensione della griglia di 2500 micron 2 prodotto una media di 254 disectors per questo argomento (Figura 2). Le dimensioni del disector dovrebbe portare tra circa 0-5 oggetti contati, in questo caso, i neuroni. </li></ol></li><li> Frazione spessore del campione (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> In ogni posto disector, l&#39;altezza del tessuto viene misurata, e una frazione di questa altezza viene campionato, questo è noto come la frazione di campionamento spessore. Per determinare lo spessore misurato, messa a fuoco attraverso il piano z fino alla prima cellula viene messa a fuoco, poi di nuovo leggermente la parte superiore della sezione, cioè fino a quando l&#39;ultimo oggetto appare solo fuori fuoco. Per determinare la parte inferiore del tessuto, messa a fuoco attraverso il piano z fino a quando le cellule sono appena fuori fuoco. </li><li> Messa a fuoco attraverso il piano z, le cellule devono essere colorate ad ogni profondità, altrimenti questo può indicare una penetrazione incompleta del disidratazione macchia o non uniforme del tessuto, nel qual caso le sezioni devono essere ri-colorati. Questa precauzione è particolarmente importante per il tessuto immunostained che richiede la penetrazione di immunoprobes attraverso sezioni di tessuto relativamente spesso. Per questo motivo, il tessuto immunostained devono essere leggermente di contrasto con una macchia basofile (ad esempio, violetto cresolo, Hematoxylin) al fine di determinare con precisione superiore e inferiore della sezione e per confermare la penetrazione degli anticorpi. In questo studio le sezioni sono state fette in un ambiente microtomo di 50 micron. Dopo tutto era completo di lavorazione dei tessuti, lo spessore del tessuto misurato una media di 17.9μm (Figura 2), con una contrazione media di circa il 65%. Si noti che questi risultati rappresentano contrazione tipica dei tessuti trattati per la preparazione di routine istologica 7. </li><li> L&#39;altezza disector di default per lo studio tipico è 10μm. La differenza tra l&#39;altezza e lo spessore disector sezione è misurata l&#39;altezza di guardia, il volume del tessuto dove si contano non caratteristiche biologiche. L&#39;uso di un altezza guardia evita danni ai tessuti alle superfici di sezionamento (ad esempio, ha perso caps). </li></ol></li><li> Il numero totale di oggetti contati, Σ Q - <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Per evitare distorsioni di errori di riconoscimento, è indispensabile che una definizione standard è seguito per la particolare caratteristica di interesse biologico. In questo caso, eravamo interessati a contare i neuroni. Pertanto, un neurone è stato definito come avere un nucleolo visibile in posizione centrale e un citoplasma chiaramente definito, mentre le cellule gliali genere mancava nucleoli visibili e citoplasma. Per questo tema sono stati contati 457 neuroni. </li></ol></li></ol> Parte 4: Stereologer - Un sistema computerizzato stereologia (stereologia Resource Center, Chester, MD) <ol><li> Il sistema Stereologer richiede all&#39;utente di compilare le informazioni necessarie in un passo-passo della moda. Nella sezione &quot;Informazioni di Studio&quot; sezione dei parametri dello studio sono stabiliti. Dal momento che uno spazio di riferimento deve essere definito per lo studio, il parametro volume dovrebbe essere selezionato (per lo spazio di riferimento lo stimatore Cavalieri dovrebbe essere selezionato). Il volume oggetto può anche essere selezionato qui per stimare il numero ponderata volume per la popolazione di oggetti di interesse. Per il nostro esempio, solo il volume dello spazio di riferimento è stato selezionato. Per ogni oggetto, selezionare il numero e definire la funzione di interesse, in questo caso neuroni. </li><li> Inizializzazione caso: In questa sezione le informazioni di campionamento è stabilito. Inserire l&#39;intervallo lastra di campionamento (se separato lastre di tessuto sono stati affettati tassativamente ed ogni sezione si trova in ordine sequenziale quindi immettere 1 qui). Inserire il numero totale delle sezioni prese attraverso lo spazio di riferimento (in questo caso 760). Quindi, immettere l&#39;intervallo di campionamento sezione (in questo caso 59). Il sistema calcola il numero di sezioni da campionare (in questo caso 13). </li><li> Parametri sonda: Questa sezione definisce la griglia e le dimensioni disector. Per il volume, utilizzare un basso ingrandimento 2,5 x-10x per definire la spaziatura della griglia sotto il menu di modifica. Ingrandimento oggetto deve essere eseguita a 100x (NA 1.3 o 1.4). Zona Frame è la dimensione del disector, in questo caso abbiamo utilizzato il 50% dello schermo. L&#39;altezza del telaio è lo spessore del disector; fissato a 10μm qui. La distanza fra le dimensioni della griglia. Nel nostro studio pilota, abbiamo scoperto che 2500μm rendimenti tra 150-200 fotogrammi distanziati in modo sistematico, uniforme modo attraverso uno spazio di riferimento relativamente grande. Per le aree più piccole, una dimensione della griglia più piccola dovrebbe essere usato. Uno studio pilota di identificare i parametri della sonda ottica per ogni studio particolare. </li><li> Una volta che i parametri di studio sono stati stabiliti, il campionamento attraverso il tessuto può procedere. Il programma chiederà di esempio la prima sezione Fase 1:. Il programma richiede all&#39;utente, in basso ingrandimento, per tracciare lo spazio di riferimento per la sezione. Il sistema sarà poi posto una griglia sopra la sezione in base ai parametri della sonda e l&#39;utente dovrà quindi verificare che i punti cadono all&#39;interno dello spazio di riferimento. Se un punto non è all&#39;interno dello spazio di riferimento è sufficiente fare clic sul punto e non sarà calcolata nel volume. Fase 2: Il sistema posto una nuova griglia nello spazio di riferimento, sulla base di parametri spaziatura telaio. Verificare che le intersezioni cadono all&#39;interno dello spazio di riferimento Fase 3:. Il sistema chiederà all&#39;utente di passare all&#39;obiettivo ingrandimenti e spostare il palco per il dissettore prima Fase 4:. A questo punto il sistema richiede all&#39;utente di definire il superiore e inferiore della sezione allora il sistema imposta lo spazio di campionamento l&#39;asse z Passo 5:. L&#39;utente dovrà quindi fare clic su ogni oggetto che rientra nel disector attraverso il piano z. Gli oggetti che toccano le linee rosse o in fondo alla disector non può essere conteggiato. Una volta che ogni oggetto viene contato, fare clic su Avanti. La tappa si sposta alla prossima disector e passaggi 4 e 5 sarà ripetuto. Una volta che tutti i disectors per la sezione sono stati contati, il sistema chiederà all&#39;utente di inserire la sezione successiva sequenziale per essere sondato. Passi 1-5 si ripeterà fino a quando tutte le sezioni sono sequenzialistato campionato. Il sistema fornirà quindi i calcoli per asf, SSF, TSF, e Σ Q. Sulla base di questi parametri, il sistema genererà una N stimato, il volume di riferimento e CE per entrambi il numero stimato e volume. Si darà anche suggerimenti per diventare più efficienti o per ridurre il marchio CE (Figura 2). </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante: Stereologia Tutti fornisce stime efficiente e affidabile di popolazioni di cellule all&#39;interno di uno spazio di riferimento. Ci sono una serie di sistemi basati su computer stereological disponibili, tutte che si basano su un campionamento sistematico e uno spazio di riferimento definito. Abbiamo usato il sistema BioQuant Life Sciences per stimare la popolazione totale dei neuroni della corteccia cerebrale di 2 anni, cercopitechi a oltre 828 milioni (Figura 3) con una media di 0,042 CE. Abbiamo poi utilizzato il sistema Stereologer di stimare che i conti del lobo frontale per circa la metà del numero di neuroni corticali 8. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1 Computer sistemi basati stereologia. Il set-up di base dei sistemi stereologia è lo stesso, un microscopio con uno stadio motorizzato (xyz), un controller stadio, videocamera, computer e software. Il sistema che è in definitiva scelta dovrebbe essere basata su efficienza, bisogni e analisi dei costi. <div style="border:1px #000000 solid"><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> STUDIO INFORMAZIONI </td></tr><tr><td> Nome studio </td><td> Corteccia frontale </td></tr><tr><td> Principal Investigator </td><td> MB </td></tr><tr><td> Specie </td><td> AG </td></tr><tr><td> Spazio di riferimento frontale </td><td> Corteccia </td></tr><tr><td colspan="2"> Note </td></tr><tr><td colspan="2"> CASE INFORMAZIONI </td></tr><tr><td> Data Collector </td><td> MB </td></tr><tr><td> Data </td><td> Mercoledì 30 Aprile, 2008 </td></tr><tr><td> Gruppo </td><td> Controllo </td></tr><tr><td> Soggetto </td><td> O26 </td></tr><tr><td colspan="2"> Note </td></tr><tr><td colspan="2"> CAMPIONAMENTO CARATTERISTICHE </td></tr><tr><td> Intervallo di campionamento lastra </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Numero totale delle sezioni </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Sezione di campionamento Intervallo </td><td> 59 </td></tr><tr><td> Sezione di partenza </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="2"> FRAZIONI </td></tr><tr><td> ASF </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td> SlabSF </td><td> 1,0000 </td></tr><tr><td> SSF </td><td> 0,0169 </td></tr><tr><td> TSF </td><td> 0,5587 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="6"> RIEPILOGO RISULTATI </td></tr><tr><td> Parametro </td><td> Sonda </td><td> Nome </td><td> Risultato </td><td> CE </td><td> SD </td></tr><tr><td> Spessore </td><td> --- </td><td> --- </td><td> 17,8996 μ </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> Numero </td><td> Disector </td><td> neurone </td><td> 243833769.1473 </td><td> 0,0474 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Volume </td><td> Cavalieri Punto Griglia </td><td> volume </td><td> 1719769397954.1284 μ ^ 3 </td><td> 0,0078 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> RACCOMANDAZIONI </td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Oggetto Number (neuroni) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0474 </td></tr><tr><td> Raccomandazioni </td><td> CE è accettabile. </td></tr></tbody></table&gt; <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Numero di Visto Disectors è troppo alta, aumentare la spaziatura Disector. </td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Regione Volume (volume) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0078 </td></tr><tr><td> Raccomandazioni </td><td> CE è accettabile. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> SEZIONE RISULTATI </td></tr><tr><td> Sezione </td><td> neurone NumObjects NumCorners neurone </td><td> il volume RegPoints </td></tr><tr><td> 1. 40 </td><td> 48 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> 2. 26 </td><td> 52 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 3. 29 </td><td> 56 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> 4. 39 </td><td> 100 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 5. 49 </td><td> 112 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 6. 53 </td><td> 156 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 7. 65 </td><td> 128 </td><td> 106 </td></tr><tr><td> 8. 45 </td><td> 108 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 9. 52 </td><td> 100 </td><td> 77 </td></tr><tr><td> 10. 26 </td><td> 64 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 11. 21 </td><td> 44 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 12. 11 </td><td> 36 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> 13. 1 </td><td> 12 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table></div> Figura 2 I risultati del lobo Fontal ottenuti con il sistema Stereologer. Per il lobo frontale, la parte più lunga del processo stereological era nel campionamento sistematico e sezionamento. Stima topografia, il volume e neuronale sono stati completati in circa un giorno per ogni soggetto. L&#39;emisfero sinistro è stato campionato e il numero è raddoppiato nel testo di una stima approssimativa per entrambi gli emisferi. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3 stima della popolazione neuronale Cortex Ottenuto con BioQuant. BioQuant Il sistema richiede una topografia esatta prima del conteggio delle cellule. Qui una media di 13 sezioni sono state campionate. Topografia corticale e la stima del volume successivo ha preso tra le 15-20 ore per ciascun soggetto. Topografia è stato eseguito in un obiettivo 2,5 x e il conteggio è stato fatto con un obiettivo 100x immersione in olio (NA 1.3). Ogni sezione 100 è stato scelto in tutto l&#39;emisfero sinistro con una media di 180 disectors campionati. Una volta la topografia è stato completato il conteggio neuronale ha richiesto circa un giorno. L&#39;emisfero sinistro è stato campionato e il numero è raddoppiato nel testo di una stima approssimativa per entrambi gli emisferi.

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	<li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li><li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+cut+it:+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods.">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practices of Unbiased Stereology. , (2002).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space.">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+banking:+Making+the+most+of+your+research.">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP/PS1:+Neuroimaging,+Stereology,+And+Biochemistry.">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li><li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure.">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li><li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain.">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li></ol>

Stereologia Tutti in un cervello dei primati è simile a quella di altri campioni biologici. Tuttavia, date le dimensioni del cervello dei primati, un piano di trattamento è raccomandato un attento quanto un singolo emisfero della scimmia cercopiteco produce più di 1200 sezioni al taglio a 50 micron. In primo luogo si consiglia stereotaxically bloccare il cervello in blocchi 1 cm, che fornisce un piano standard di sezione tra blocchi e soggetti, minimizza le sezioni parziali tra i blocchi, e fornisce gestibile blocchi...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereologer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stereology Resource Center (Chester, MD)</td>
<td>www.disector.com</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereology Tool-Kit Stereologer system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>StereoInvestigator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroBright Field (Willston, VT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain

Il primate non umano è una specie importante traslazionale per la comprensione dei processi di normale funzione e malattie del cervello umano. Stereologia imparziali, il metodo accettato come state-of-the-art per la quantificazione di oggetti biologici in sezioni di tessuto<sup&gt; 2</sup&gt;, Genera affidabili dati strutturali per le caratteristiche biologiche del cervello dei mammiferi<sup&gt; 3</sup&gt;. I componenti chiave dell&#39;approccio sono obiettive (sistematico-casuale) il campionamento di strutture anatomicamente definito (spazi di riferimento), combinata con la quantificazione del numero di cellule dimensioni e lunghezze, fibre e capillari, superfici, volumi regionali e distribuzione spaziale degli oggetti biologici all&#39;interno del riferimento spazio<sup&gt; 4</sup&gt;. Tra i vantaggi di questi approcci stereological rispetto ai metodi precedenti è quello di evitare tutte le fonti conosciute di errore sistematico (non casuale) derivanti da assunzioni errate e non verificabili modelli. Questo studio documenta una applicazione biologica di stereologia computerizzati per stimare la popolazione neuronale nella corteccia frontale del cervello della scimmia cercopiteco (<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;), Con l&#39;assistenza di due programmi stereologia disponibili in commercio, Scienze della Vita e BioQuant Stereologer (Figura 1). Oltre a contrasto e il confronto dei risultati sia dal BioQuant e<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistemi, questo studio fornisce un protocollo dettagliato per la<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistema.

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Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

L&#39;organizzazione anatomica del cervello dei primati in grado di fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell&#39;uomo. Tutti stereologia è un metodo per precisione ed efficienza stimare il numero totale dei neuroni (o tipo di cellula) in uno spazio di riferimento dato<sup&gt; 1</sup&gt;.

Conoscere ciò che conta: stereologia Tutti nel settore non umano cervello dei primati

The non-human primate is an important translational species for understanding the normal function and disease processes of the human brain. Unbiased ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.7K Views.  University of Montreal. L'organizzazione anatomica del cervello dei primati in grado di fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell'uomo. Tutti stereologia è un metodo per precisione ed efficienza stimare il numero totale dei neuroni (o tipo di cellula) in uno spazio di riferimento dato 1.

Video: Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Applicazione della Luce cured resina adesiva dentale per montaggio elettrodi o sonde Microdialisi negli esperimenti cronica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Ricerca

Biologia

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

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Micro-dissezione del cervello di ratto per estrazione RNA o proteine ​​da Regione specifiche del cervello

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Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Cella singola elettroporazione in vivo all&#39;interno del cervello intatto in via di sviluppo

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Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In addition, the use of non-human primates has recently afforded the opportunity to naturally model complex psychiatric disorders such as alcohol abuse7. Here we describe a technique for blocking the brain in the coronal plane of the vervet monkey (Chlorocebus aethiops sabeus) in the intact skull in stereotaxic space. The method described here provides a standard plane of section between blocks and subjects and minimizes partial sections between blocks. Sectioning a block of tissue in the coronal plane also facilitates the delineation of an area of interest. This method provides manageable sized blocks since a single hemisphere of the vervet monkey yields more than 1200 sections when slicing at 50&mu;m. Furthermore by blocking the brain into 1cm blocks, it facilitates penetration of sucrose for cyroprotection and allows the block to be sliced on a standard cryostat.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of the normal processing of the brain. The anatomical organization of the primate brain can provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

Dissezione di non-umano cervello dei primati nello spazio Stereotassica

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

The visual system in humans is considered the gateway to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive processes. It is therefore not surprising that quality of vision is tied to quality of life . Despite widespread clinical and basic research surrounding the causes of visual disorders, many forms of visual impairments, such as retinitis pigmentosa and macular degeneration, lack effective treatments. Non-human primates have the closest general features of eye development to that of humans. Not only do they have a similar vascular anatomy, but amongst other mammals, primates have the unique characteristic of having a region in the temporal retina specialized for high visual acuity, the fovea1. Here we describe a general technique for dissecting the primate retina to provide tissue for retinal histology, immunohistochemistry, laser capture microdissection, as well as light and electron microscopy. With the extended use of the non-human primate as a translational model, our hope is that improved understanding of the retina will provide insights into effective approaches towards attenuating or reversing the negative impact of visual disorders on the quality of life of affected individuals.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of development and aging. The anatomical organization of the primate retina may provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

La Porta del Cervello: Dissezione l&#39;Occhio Primate

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Determinazione del conteggio delle cellule dei mammiferi, le dimensioni delle cellule e la salute delle cellule utilizzando il Moxi Z Mini contaglobuli automatizzato

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Fisiologia Lab Dimostrazione: filtrazione glomerulare in un ratto

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Prelievo di sangue dalla vena della coda laterale del Topo

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Reverse Dissection and DiceCT Reveal Otherwise Hidden Data in the Evolution of the Primate Face

Facial expressions, or facial displays, of social or emotional intent are produced by many mammalian taxa as a means of visually communicating with conspecifics at a close range. These displays are achieved by contraction of the mimetic muscles, which are skeletal muscle attached to the dermis of the face. Reverse dissection, removing the full facial mask from the skull and approaching mimetic muscles in reverse, is an effective but destructive way of revealing the morphology of mimetic muscles but it is destructive. DiceCT is a novel mechanism for visualizing skeletal muscles, including mimetic muscles, and isolating individual muscle fascicles for quantitative measurement. Additionally, DiceCT provides a non-destructive mechanism for visualizing muscles. The combined techniques of reverse dissection and DiceCT can be used to assess the evolutionary morphology of mimetic musculature as well as potential contraction strength and velocity in these muscles. This study further demonstrates that DiceCT can be used to accurately and reliably visualize mimetic muscles as well as reverse dissection and provide a non-destructive method for sampling mimetic muscles.

Facial expressions are a mode of visual communication produced by mimetic muscles. Here, we present protocols for the novel techniques of reverse dissection and DiceCT to fully visualize and assess mimetic muscles. These combined techniques can examine both morphological and physiological aspects of mimetic musculature to determine functional aspects.

Invertire la dissezione e dati DiceCT Reveal altrimenti nascosti nell'evoluzione del Primate viso

Facial expressions, or facial displays, of social or emotional intent are produced by many mammalian taxa as a means of visually communicating with ...