Gli autori desiderano ringraziare Ikiel Ptito per il suo continuo supporto tecnico. NSERC concedere a MP.

Parte 1: Pre-trattamento dei tessuti deve essere fatto secondo Burke et al. (2009) 5. <ol><li> In breve, il tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeide, glutaraldeide, o formalina. Questo può essere raggiunto attraverso standard di perfusione transcardial tipicamente usato per raccogliere altri organi. Nel presente studio il soggetto era profondamente sedato con cloridrato di ketamina (10 mg / kg, im), eutanasia con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (25 mg / kg, iv) e perfusi transcardially con 0,1 M PBS fino a completo dissanguato. Questa è seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS per 5 min (~ 1 litro). Tessuto deve essere ben perfusi con paraformaldeyhde, gluteraldehyde, o formalina. Il cervello deve essere stereotaxically bloccato, rimosso dal cranio, pesato, volume determinato, crioprotetti, e congelati 5. </li></ol> Parte 2: campionamento sistematico del tessuto, secondo Burke et al. (2009) 6. <ol><li> In questo esempio ci siamo concentrati sul lobo frontale del cervello vervet. Lo spazio di riferimento è stato definito per includere tessuto corticale dal solco centrale al polo frontale dell&#39;emisfero sinistro. Per i nostri scopi la serie sono stati fissati a 1 / 10 sezioni in tutta la corteccia, sezionati a 50 micron. Una serie completa era macchiata di violetto cresolo (serie # 1). Serie 2 è stata suddivisa in modo che la metà delle sezioni sono state colorate con cloruro d&#39;oro per la rivelazione della mielina e macchiato altra metà per l&#39;acetilcolina esterasi (per la definizione di talune regioni subcorticali). Tutte le altre serie sono state sopraelevate nel preservare l&#39;antigene come parte dei nostri piani a lungo termine della ricerca. </li></ol> Parte 3: stereologia (per maggiori dettagli, vedere Mouton 2002) 4 <ol><li> La stima totale del numero di cellule (N) è calcolato in base alla seguente equazione: N = -1 x ssf asf -1 x -1 x tsf Σ Q - Dove SSF è la frazione di campionamento sezione, asf è la frazione di campionamento dell&#39;area, TSF se la frazione di campionamento spessore (dove lo spessore del tessuto misurato viene diviso per l&#39;altezza dissettore) e Σ Q - è il numero totale di oggetti di interesse contati all&#39;interno del dissettore. Le sezioni successive di questo protocollo mostrano come determinare la SSF, asf, TSF e Σ Q. </li><li> Sezione Frazione di campionamento (non su computer) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Lo spazio intero riferimento devono essere ben definiti da anteriore a posteriore e dorsale a ventrale. In questo esempio siamo stati interessati al lobo frontale e lo hanno definito come la regione dalla punta del polo frontale (anteriore) al solco centrale (posteriore) e il solco laterale (ventrale) ed esclusa l&#39;insula. </li><li> Per il lobo frontale di questo particolare argomento per un totale di 760 sezioni sono stati sistematicamente raccolti con 76 colorati per violetto cresolo. Dal momento che l&#39;obiettivo era di 10 sezioni in tutto lo spazio di riferimento sezioni viola 1 / 6 cresile macchiati sono stati campionati, portando ad una frazione sezione campione di circa 1 / 60. Siamo a caso iniziato con una delle prime 6 sezioni cresile colorate viola e sistematicamente a campionamento 1 / 6 dopo. Un totale di 13 sezioni sono stati campionati per il soggetto selezionato (Figura 2). </li></ol></li><li> Area Frazione del campione (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Uno studio pilota indicherà la dimensione ottimale della griglia, la Frazione di campionamento Zona, per esempio lo spazio di riferimento con circa 100-300 disectors. All&#39;interno del lobo frontale, una dimensione della griglia di 2500 micron 2 prodotto una media di 254 disectors per questo argomento (Figura 2). Le dimensioni del disector dovrebbe portare tra circa 0-5 oggetti contati, in questo caso, i neuroni. </li></ol></li><li> Frazione spessore del campione (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> In ogni posto disector, l&#39;altezza del tessuto viene misurata, e una frazione di questa altezza viene campionato, questo è noto come la frazione di campionamento spessore. Per determinare lo spessore misurato, messa a fuoco attraverso il piano z fino alla prima cellula viene messa a fuoco, poi di nuovo leggermente la parte superiore della sezione, cioè fino a quando l&#39;ultimo oggetto appare solo fuori fuoco. Per determinare la parte inferiore del tessuto, messa a fuoco attraverso il piano z fino a quando le cellule sono appena fuori fuoco. </li><li> Messa a fuoco attraverso il piano z, le cellule devono essere colorate ad ogni profondità, altrimenti questo può indicare una penetrazione incompleta del disidratazione macchia o non uniforme del tessuto, nel qual caso le sezioni devono essere ri-colorati. Questa precauzione è particolarmente importante per il tessuto immunostained che richiede la penetrazione di immunoprobes attraverso sezioni di tessuto relativamente spesso. Per questo motivo, il tessuto immunostained devono essere leggermente di contrasto con una macchia basofile (ad esempio, violetto cresolo, Hematoxylin) al fine di determinare con precisione superiore e inferiore della sezione e per confermare la penetrazione degli anticorpi. In questo studio le sezioni sono state fette in un ambiente microtomo di 50 micron. Dopo tutto era completo di lavorazione dei tessuti, lo spessore del tessuto misurato una media di 17.9μm (Figura 2), con una contrazione media di circa il 65%. Si noti che questi risultati rappresentano contrazione tipica dei tessuti trattati per la preparazione di routine istologica 7. </li><li> L&#39;altezza disector di default per lo studio tipico è 10μm. La differenza tra l&#39;altezza e lo spessore disector sezione è misurata l&#39;altezza di guardia, il volume del tessuto dove si contano non caratteristiche biologiche. L&#39;uso di un altezza guardia evita danni ai tessuti alle superfici di sezionamento (ad esempio, ha perso caps). </li></ol></li><li> Il numero totale di oggetti contati, Σ Q - <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Per evitare distorsioni di errori di riconoscimento, è indispensabile che una definizione standard è seguito per la particolare caratteristica di interesse biologico. In questo caso, eravamo interessati a contare i neuroni. Pertanto, un neurone è stato definito come avere un nucleolo visibile in posizione centrale e un citoplasma chiaramente definito, mentre le cellule gliali genere mancava nucleoli visibili e citoplasma. Per questo tema sono stati contati 457 neuroni. </li></ol></li></ol> Parte 4: Stereologer - Un sistema computerizzato stereologia (stereologia Resource Center, Chester, MD) <ol><li> Il sistema Stereologer richiede all&#39;utente di compilare le informazioni necessarie in un passo-passo della moda. Nella sezione &quot;Informazioni di Studio&quot; sezione dei parametri dello studio sono stabiliti. Dal momento che uno spazio di riferimento deve essere definito per lo studio, il parametro volume dovrebbe essere selezionato (per lo spazio di riferimento lo stimatore Cavalieri dovrebbe essere selezionato). Il volume oggetto può anche essere selezionato qui per stimare il numero ponderata volume per la popolazione di oggetti di interesse. Per il nostro esempio, solo il volume dello spazio di riferimento è stato selezionato. Per ogni oggetto, selezionare il numero e definire la funzione di interesse, in questo caso neuroni. </li><li> Inizializzazione caso: In questa sezione le informazioni di campionamento è stabilito. Inserire l&#39;intervallo lastra di campionamento (se separato lastre di tessuto sono stati affettati tassativamente ed ogni sezione si trova in ordine sequenziale quindi immettere 1 qui). Inserire il numero totale delle sezioni prese attraverso lo spazio di riferimento (in questo caso 760). Quindi, immettere l&#39;intervallo di campionamento sezione (in questo caso 59). Il sistema calcola il numero di sezioni da campionare (in questo caso 13). </li><li> Parametri sonda: Questa sezione definisce la griglia e le dimensioni disector. Per il volume, utilizzare un basso ingrandimento 2,5 x-10x per definire la spaziatura della griglia sotto il menu di modifica. Ingrandimento oggetto deve essere eseguita a 100x (NA 1.3 o 1.4). Zona Frame è la dimensione del disector, in questo caso abbiamo utilizzato il 50% dello schermo. L&#39;altezza del telaio è lo spessore del disector; fissato a 10μm qui. La distanza fra le dimensioni della griglia. Nel nostro studio pilota, abbiamo scoperto che 2500μm rendimenti tra 150-200 fotogrammi distanziati in modo sistematico, uniforme modo attraverso uno spazio di riferimento relativamente grande. Per le aree più piccole, una dimensione della griglia più piccola dovrebbe essere usato. Uno studio pilota di identificare i parametri della sonda ottica per ogni studio particolare. </li><li> Una volta che i parametri di studio sono stati stabiliti, il campionamento attraverso il tessuto può procedere. Il programma chiederà di esempio la prima sezione Fase 1:. Il programma richiede all&#39;utente, in basso ingrandimento, per tracciare lo spazio di riferimento per la sezione. Il sistema sarà poi posto una griglia sopra la sezione in base ai parametri della sonda e l&#39;utente dovrà quindi verificare che i punti cadono all&#39;interno dello spazio di riferimento. Se un punto non è all&#39;interno dello spazio di riferimento è sufficiente fare clic sul punto e non sarà calcolata nel volume. Fase 2: Il sistema posto una nuova griglia nello spazio di riferimento, sulla base di parametri spaziatura telaio. Verificare che le intersezioni cadono all&#39;interno dello spazio di riferimento Fase 3:. Il sistema chiederà all&#39;utente di passare all&#39;obiettivo ingrandimenti e spostare il palco per il dissettore prima Fase 4:. A questo punto il sistema richiede all&#39;utente di definire il superiore e inferiore della sezione allora il sistema imposta lo spazio di campionamento l&#39;asse z Passo 5:. L&#39;utente dovrà quindi fare clic su ogni oggetto che rientra nel disector attraverso il piano z. Gli oggetti che toccano le linee rosse o in fondo alla disector non può essere conteggiato. Una volta che ogni oggetto viene contato, fare clic su Avanti. La tappa si sposta alla prossima disector e passaggi 4 e 5 sarà ripetuto. Una volta che tutti i disectors per la sezione sono stati contati, il sistema chiederà all&#39;utente di inserire la sezione successiva sequenziale per essere sondato. Passi 1-5 si ripeterà fino a quando tutte le sezioni sono sequenzialistato campionato. Il sistema fornirà quindi i calcoli per asf, SSF, TSF, e Σ Q. Sulla base di questi parametri, il sistema genererà una N stimato, il volume di riferimento e CE per entrambi il numero stimato e volume. Si darà anche suggerimenti per diventare più efficienti o per ridurre il marchio CE (Figura 2). </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante: Stereologia Tutti fornisce stime efficiente e affidabile di popolazioni di cellule all&#39;interno di uno spazio di riferimento. Ci sono una serie di sistemi basati su computer stereological disponibili, tutte che si basano su un campionamento sistematico e uno spazio di riferimento definito. Abbiamo usato il sistema BioQuant Life Sciences per stimare la popolazione totale dei neuroni della corteccia cerebrale di 2 anni, cercopitechi a oltre 828 milioni (Figura 3) con una media di 0,042 CE. Abbiamo poi utilizzato il sistema Stereologer di stimare che i conti del lobo frontale per circa la metà del numero di neuroni corticali 8. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1 Computer sistemi basati stereologia. Il set-up di base dei sistemi stereologia è lo stesso, un microscopio con uno stadio motorizzato (xyz), un controller stadio, videocamera, computer e software. Il sistema che è in definitiva scelta dovrebbe essere basata su efficienza, bisogni e analisi dei costi. <div style="border:1px #000000 solid"><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> STUDIO INFORMAZIONI </td></tr><tr><td> Nome studio </td><td> Corteccia frontale </td></tr><tr><td> Principal Investigator </td><td> MB </td></tr><tr><td> Specie </td><td> AG </td></tr><tr><td> Spazio di riferimento frontale </td><td> Corteccia </td></tr><tr><td colspan="2"> Note </td></tr><tr><td colspan="2"> CASE INFORMAZIONI </td></tr><tr><td> Data Collector </td><td> MB </td></tr><tr><td> Data </td><td> Mercoledì 30 Aprile, 2008 </td></tr><tr><td> Gruppo </td><td> Controllo </td></tr><tr><td> Soggetto </td><td> O26 </td></tr><tr><td colspan="2"> Note </td></tr><tr><td colspan="2"> CAMPIONAMENTO CARATTERISTICHE </td></tr><tr><td> Intervallo di campionamento lastra </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Numero totale delle sezioni </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Sezione di campionamento Intervallo </td><td> 59 </td></tr><tr><td> Sezione di partenza </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="2"> FRAZIONI </td></tr><tr><td> ASF </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td> SlabSF </td><td> 1,0000 </td></tr><tr><td> SSF </td><td> 0,0169 </td></tr><tr><td> TSF </td><td> 0,5587 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="6"> RIEPILOGO RISULTATI </td></tr><tr><td> Parametro </td><td> Sonda </td><td> Nome </td><td> Risultato </td><td> CE </td><td> SD </td></tr><tr><td> Spessore </td><td> --- </td><td> --- </td><td> 17,8996 μ </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> Numero </td><td> Disector </td><td> neurone </td><td> 243833769.1473 </td><td> 0,0474 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Volume </td><td> Cavalieri Punto Griglia </td><td> volume </td><td> 1719769397954.1284 μ ^ 3 </td><td> 0,0078 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> RACCOMANDAZIONI </td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Oggetto Number (neuroni) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0474 </td></tr><tr><td> Raccomandazioni </td><td> CE è accettabile. </td></tr></tbody></table&gt; <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Numero di Visto Disectors è troppo alta, aumentare la spaziatura Disector. </td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Regione Volume (volume) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0078 </td></tr><tr><td> Raccomandazioni </td><td> CE è accettabile. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> SEZIONE RISULTATI </td></tr><tr><td> Sezione </td><td> neurone NumObjects NumCorners neurone </td><td> il volume RegPoints </td></tr><tr><td> 1. 40 </td><td> 48 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> 2. 26 </td><td> 52 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 3. 29 </td><td> 56 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> 4. 39 </td><td> 100 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 5. 49 </td><td> 112 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 6. 53 </td><td> 156 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 7. 65 </td><td> 128 </td><td> 106 </td></tr><tr><td> 8. 45 </td><td> 108 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 9. 52 </td><td> 100 </td><td> 77 </td></tr><tr><td> 10. 26 </td><td> 64 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 11. 21 </td><td> 44 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 12. 11 </td><td> 36 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> 13. 1 </td><td> 12 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table></div> Figura 2 I risultati del lobo Fontal ottenuti con il sistema Stereologer. Per il lobo frontale, la parte più lunga del processo stereological era nel campionamento sistematico e sezionamento. Stima topografia, il volume e neuronale sono stati completati in circa un giorno per ogni soggetto. L&#39;emisfero sinistro è stato campionato e il numero è raddoppiato nel testo di una stima approssimativa per entrambi gli emisferi. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3 stima della popolazione neuronale Cortex Ottenuto con BioQuant. BioQuant Il sistema richiede una topografia esatta prima del conteggio delle cellule. Qui una media di 13 sezioni sono state campionate. Topografia corticale e la stima del volume successivo ha preso tra le 15-20 ore per ciascun soggetto. Topografia è stato eseguito in un obiettivo 2,5 x e il conteggio è stato fatto con un obiettivo 100x immersione in olio (NA 1.3). Ogni sezione 100 è stato scelto in tutto l&#39;emisfero sinistro con una media di 180 disectors campionati. Una volta la topografia è stato completato il conteggio neuronale ha richiesto circa un giorno. L&#39;emisfero sinistro è stato campionato e il numero è raddoppiato nel testo di una stima approssimativa per entrambi gli emisferi.

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	<li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li><li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+cut+it:+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods.">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practices of Unbiased Stereology. , (2002).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space.">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+banking:+Making+the+most+of+your+research.">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP/PS1:+Neuroimaging,+Stereology,+And+Biochemistry.">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li><li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure.">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li><li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain.">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li></ol>

Stereologia Tutti in un cervello dei primati è simile a quella di altri campioni biologici. Tuttavia, date le dimensioni del cervello dei primati, un piano di trattamento è raccomandato un attento quanto un singolo emisfero della scimmia cercopiteco produce più di 1200 sezioni al taglio a 50 micron. In primo luogo si consiglia stereotaxically bloccare il cervello in blocchi 1 cm, che fornisce un piano standard di sezione tra blocchi e soggetti, minimizza le sezioni parziali tra i blocchi, e fornisce gestibile blocchi...

<table><tbody><tr><td>Stereologer</td><td>Stereology Resource Center (Chester, MD)</td><td>www.disector.com</td><td></td></tr><tr><td>Stereology Tool-Kit Stereologer system</td><td>BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain

Il primate non umano è una specie importante traslazionale per la comprensione dei processi di normale funzione e malattie del cervello umano. Stereologia imparziali, il metodo accettato come state-of-the-art per la quantificazione di oggetti biologici in sezioni di tessuto<sup&gt; 2</sup&gt;, Genera affidabili dati strutturali per le caratteristiche biologiche del cervello dei mammiferi<sup&gt; 3</sup&gt;. I componenti chiave dell&#39;approccio sono obiettive (sistematico-casuale) il campionamento di strutture anatomicamente definito (spazi di riferimento), combinata con la quantificazione del numero di cellule dimensioni e lunghezze, fibre e capillari, superfici, volumi regionali e distribuzione spaziale degli oggetti biologici all&#39;interno del riferimento spazio<sup&gt; 4</sup&gt;. Tra i vantaggi di questi approcci stereological rispetto ai metodi precedenti è quello di evitare tutte le fonti conosciute di errore sistematico (non casuale) derivanti da assunzioni errate e non verificabili modelli. Questo studio documenta una applicazione biologica di stereologia computerizzati per stimare la popolazione neuronale nella corteccia frontale del cervello della scimmia cercopiteco (<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;), Con l&#39;assistenza di due programmi stereologia disponibili in commercio, Scienze della Vita e BioQuant Stereologer (Figura 1). Oltre a contrasto e il confronto dei risultati sia dal BioQuant e<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistemi, questo studio fornisce un protocollo dettagliato per la<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistema.

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Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

L&#39;organizzazione anatomica del cervello dei primati in grado di fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell&#39;uomo. Tutti stereologia è un metodo per precisione ed efficienza stimare il numero totale dei neuroni (o tipo di cellula) in uno spazio di riferimento dato<sup&gt; 1</sup&gt;.

Conoscere ciò che conta: stereologia Tutti nel settore non umano cervello dei primati

The non-human primate is an important translational species for understanding the normal function and disease processes of the human brain. Unbiased ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.7K Views.  University of Montreal. L'organizzazione anatomica del cervello dei primati in grado di fornire spunti importanti in condizioni normali e patologiche nell'uomo. Tutti stereologia è un metodo per precisione ed efficienza stimare il numero totale dei neuroni (o tipo di cellula) in uno spazio di riferimento dato 1.

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Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In addition, the use of non-human primates has recently afforded the opportunity to naturally model complex psychiatric disorders such as alcohol abuse7. Here we describe a technique for blocking the brain in the coronal plane of the vervet monkey (Chlorocebus aethiops sabeus) in the intact skull in stereotaxic space. The method described here provides a standard plane of section between blocks and subjects and minimizes partial sections between blocks. Sectioning a block of tissue in the coronal plane also facilitates the delineation of an area of interest. This method provides manageable sized blocks since a single hemisphere of the vervet monkey yields more than 1200 sections when slicing at 50&mu;m. Furthermore by blocking the brain into 1cm blocks, it facilitates penetration of sucrose for cyroprotection and allows the block to be sliced on a standard cryostat.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of the normal processing of the brain. The anatomical organization of the primate brain can provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

Dissezione di non-umano cervello dei primati nello spazio Stereotassica

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

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Biologia

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Unbiased stereology is a method for accurately and efficiently estimating the total neuron number (or other cell type) in a given area of interest1. To achieve this goal 6-10 systematic sections should be probed covering the entire structure. Typically this involves processing 1/5 sections which leaves a significant amount of material unprocessed. In order to maximize the material, we propose an inexpensive method for preserving fixed tissue as part of a long-term storage research plan. As tissue is sliced and processed for the desired stain or antibody, alternate sections should be systematically placed in antigen preserve at -20&deg;C for future processing. Using 24-well plates, sections can be placed in order for future retrieval. Using this method, tissue can be stored and processed for immunohistochemistry over the course of years.

Brain banking and systematic sampling of biological material provides the basis for unbiased stereology and maximizes the potential data obtained from each specimen.

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Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

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Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a comprehensive survey of the morphological characteristics observed among a selective neuronal population. Combination of these techniques constitutes a novel approach for the collection and analysis of neuroanatomical data. Together, these techniques enable large-scale, and therefore more comprehensive, sampling of selective neuronal populations and establish unbiased quantitative methods for describing morphologically unique neuronal classes within a population.
The protocol outlines the use of modified rabies virus to selectively label neurons. G-deleted rabies virus acts like a retrograde tracer following stereotaxic injection into a target brain structure of interest and serves as a vehicle for the delivery and expression of EGFP in neurons. Large numbers of neurons are infected using this technique and express GFP throughout their dendrites, producing &#34;Golgi-like&#34; complete fills of individual neurons. Accordingly, the virus-mediated retrograde tracing method improves upon traditional dye-based retrograde tracing techniques by producing complete intracellular fills.
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This protocol describes large-scale reconstructions of selective neuronal populations, labeled following retrograde infection with a modified rabies virus expressing fluorescent markers, and independent, unbiased cluster analyses that enable comprehensive characterization of morphological metrics among distinct neuronal subclasses.

Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni

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Neuroscienze

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells or structures. These methods have been revolutionary for quantitative analysis of the mammalian brain, in which volumetric cell populations are too high to count manually, and stereology is now the technique of choice whenever estimates of three-dimensional quantities need to be extracted from measurements on two-dimensional sections. All stereological methods are in principle unbiased; however, they rely on proper knowledge about the structure of interest and the characteristics of the tissue. Stereology is based on Systematic Uniformly Random Sampling (SURS), with adjustment of sampling to the most efficient level in respect to precision, providing reliable, quantitative information about the whole structure of interest. Here we present the optical fractionator in conjunction with BrdU immunohistochemistry to estimate the production and survival of newly-formed neurons in the granule cell layer (including the sub-granular zone) of the rat hippocampus following electroconvulsive stimulation, which is among the most potent stimulators of neurogenesis. The optical fractionator technique is designed to provide estimates of the total number of cells from thick sections sampled from the full structure. Thick sections provide the opportunity to observe cells in their full 3-D extent and thus, allow for easy and robust cell classification based on morphological criteria. When correctly implemented, the sensitivity and efficiency of the optical fractionator provides accurate estimates with a fixed and predetermined precision.

Here, we present a stereological method, the optical fractionator, used to quantify the formation of new neurons, and their survival, in the rat hippocampus following electroconvulsive stimulation. When correctly implemented, the sensitivity and efficiency of stereological methods ensures accurate estimates with a fixed and predetermined precision.

La tecnica del frazionatore ottico per stimare i numeri di cella in un modello di ratto della terapia elettroconvulsiva

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

Symmetric Bihemispheric Postmortem Brain Cutting to Study Healthy and Pathological Brain Conditions in Humans

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena described in those patients for whom a brain autopsy has been requested. Although the advancements of biomedical sciences and neuroimaging have revolutionized the neuropsychiatric field, they have also generated the misleading idea that brain autopsies have only a confirmatory value. This false idea created a drastic reduction of autopsy rates and, consequently, a reduced possibility to perform more detailed and extensive neuropathological investigations, which are necessary to comprehend numerous normal and pathological aspects yet unknown of the human brain. The traditional inferential method of correlation between observed neuropsychiatric phenomena and corresponding localization/characterization of their possible neurohistological correlates continues to have an undeniable value. In the context of neuropsychiatric diseases, the traditional clinicopathological method is still the best possible methodology (and often the only available) to link unique neuropsychiatric features to their corresponding neuropathological substrates, since it relies specifically upon the direct physical assessment of brain tissues. The assessment of postmortem brains is based on brain cutting procedures that vary across different neuropathology centers. Brain cuttings are performed in a relatively extensive and systematic way based on the various clinical and academic contingencies present in each institution. A more anatomically inclusive and symmetric bi-hemispheric brain cutting methodology should at least be used for research purposes in human neuropathology to coherently investigate, in depth, normal and pathological conditions with the peculiarities of the human brain (i.e., hemispheric specialization and lateralization for specific functions). Such a method would provide a more comprehensive collection of neuropathologically well-characterized brains available for current and future biotechnological and neuroimaging techniques. We describe a symmetric bi-hemispheric brain cutting procedure for the investigation of hemispheric differences in human brain pathologies and for use with current as well as future biomolecular/neuroimaging techniques.

Organized brain cutting procedures are necessary to correlate specific neuropsychiatric phenomena with definitive neuropathologic diagnoses. Brain cuttings are performed differently based on various clinico-academic contingencies. This protocol describes a symmetric bihemispheric brain cutting procedure to investigate hemispheric differences in human brain pathologies and to maximize current and future biomolecular/neuroimaging techniques.

Simmetrica Bihemispheric Postmortem cervello taglio per studiare sano e patologico del cervello Condizioni di esseri umani

Neuropathologists, at times, feel intimidated by the amount of knowledge needed to generate definitive diagnoses for complex neuropsychiatric phenomena ...

Medicina

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the substantia nigra, is essential. To estimate the total dopaminergic neuron number, unbiased stereology using the optical fractionator method is currently considered the gold standard. Because the theory behind the optical fractionator method is complex and because stereology is difficult to achieve without specialized equipment, several commercially available complete stereology systems that include the necessary software do exist, purely for cell counting reasons. Since purchasing a specialized stereology setup is not always feasible, for many reasons, this report describes a method for the stereological estimation of dopaminergic neuronal cell counts using standard microscopy equipment, including a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane) with imaging software, and a computer for analysis. A step-by-step explanation is given on how to perform stereological quantification using the optical fractionator method, and pre-programmed files for the calculation of estimated cell counts are provided. To assess the accuracy of this method, a comparison to data obtained from a commercially available stereology apparatus was performed. Comparable cell numbers were found using this protocol and the stereology device, thus demonstrating the precision of this protocol for unbiased stereology.

This work presents a step-by-step protocol for the unbiased stereological estimation of dopaminergic neuronal cell numbers in the mouse substantia nigra using standard microscopy equipment (i.e., a light microscope, a motorized object table (x, y, z plane), and public domain software for digital image analysis.

Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

A MRI-Based Toolbox for Neurosurgical Planning in Nonhuman Primates

In this paper, we outline a method for surgical preparation that allows for the practical planning of a variety of neurosurgeries in NHPs solely using data extracted from magnetic resonance imaging (MRI). This protocol allows for the generation of 3D printed anatomically accurate physical models of the brain and skull, as well as an agarose gel model of the brain modeling some of the mechanical properties of the brain. These models can be extracted from MRI using brain extraction software for the model of the brain, and custom code for the model of the skull. The preparation protocol takes advantage of state-of-the-art 3D printing technology to make interfacing brains, skulls, and molds for gel brain models. The skull and brain models can be used to visualize brain tissue inside the skull with the addition of a craniotomy in the custom code, allowing for better preparation for surgeries directly involving the brain. The applications of these methods are designed for surgeries involved in neurological stimulation and recording as well as injection, but the versatility of the system allows for future expansion of the protocol, extraction techniques, and models to a wider scope of surgeries.

The method outlined below aims to provide a comprehensive protocol for the preparation of nonhuman primate (NHP) neurosurgery using a novel combination of three-dimensional (3D) printing methods and MRI data extraction.

Una cassetta degli attrezzi basata sulla risonanza testurtica per la pianificazione neurochirurgica in primati non umani

In this paper, we outline a method for surgical preparation that allows for the practical planning of a variety of neurosurgeries in NHPs solely using ...

Bioingegneria

Modellazione 3D automatizzata di cervello e cranio da risonanza magnetica per la pianificazione neurochirurgica NHP

A Neural Implant Design Toolbox for Nonhuman Primates

This paper describes an in-house method of 3D brain and skull modeling from magnetic resonance imaging (MRI) tailored for nonhuman primate (NHP) neurosurgical planning. This automated, computational software-based technique provides an efficient way of extracting brain and skull features from MRI files as opposed to traditional manual extraction techniques using imaging software. Furthermore, the procedure provides a method for visualizing the brain and craniotomized skull together for intuitive, virtual surgical planning. This generates a drastic reduction in time and resources from those required by past work, which relied on iterative 3D printing. The skull modeling process creates a footprint that is exported into modeling software to design custom-fit cranial chambers and headposts for surgical implantation. Custom-fit surgical implants minimize gaps between the implant and the skull that could introduce complications, including infection or decreased stability. By implementing these pre-surgical steps, surgical and experimental complications are reduced. These techniques can be adapted for other surgical processes, facilitating more efficient and effective experimental planning for researchers and, potentially, neurosurgeons.

Autore in primo piano: Modellazione semplificata del cervello e del cranio per una migliore pianificazione neurochirurgica nella ricerca NHP

This paper outlines automated processes for nonhuman primate neurosurgical planning based on magnetic resonance imaging (MRI) scans. These techniques use procedural steps in programming and design platforms to support customized implant design for NHPs. The validity of each component can then be confirmed using three-dimensional (3D) printed life-size anatomical models.

Conoscere ciò che conta: stereologia Tutti nel settore non umano cervello dei primati

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Dissezione di non-umano cervello dei primati nello spazio Stereotassica

Cervello Banking: Utilizzare al meglio il vostro campioni di ricerca

Immunostaining lotto per la grande rivelazione di proteine nel cervello della scimmia Whole

Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni

La tecnica del frazionatore ottico per stimare i numeri di cella in un modello di ratto della terapia elettroconvulsiva

Simmetrica Bihemispheric Postmortem cervello taglio per studiare sano e patologico del cervello Condizioni di esseri umani

Stereologiche stima del numero di neuroni dopaminergici nel Nigra di Substantia del Mouse utilizzando il frazionatore ottica e microscopia Standard attrezzature

Una cassetta degli attrezzi basata sulla risonanza testurtica per la pianificazione neurochirurgica in primati non umani

Una cassetta degli attrezzi per la progettazione di impianti neurali per primati non umani

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