Los autores desean agradecer a Ikiel Ptito por su apoyo técnico continuo. NSERC otorgar a MP.

Parte 1: Pre-procesamiento de los tejidos se debe hacer de acuerdo con Burke et al. (2009) 5. <ol><li> En pocas palabras, el tejido debe estar bien perfundidos con paraformaldehido, glutaraldehido, o formalina. Esto se puede lograr a través de la perfusión estándar transcardial normalmente se utiliza para la cosecha de otros órganos. En el presente estudio el tema fue profundamente sedado con clorhidrato de ketamina (10 mg / kg, im), sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) y perfundidos transcardially con PBS 0,1 M hasta que esté completamente desangrado. Esto es seguido por una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 5 minutos (aproximadamente 1 litro). El tejido debe estar bien perfundidos con paraformaldeyhde, glutaraldehído, o formalina. El cerebro debe ser stereotaxically bloqueado, removido del cráneo, se pesa, volumen determinado, crioprotegieron y congelado 5. </li></ol> Parte 2: Muestreo sistemático de tejido, de acuerdo con Burke et al. (2009) 6. <ol><li> En este ejemplo nos hemos centrado en el lóbulo frontal del cerebro, los monos verdes. El espacio de referencia se ha definido para incluir tejido cortical del surco central en el polo frontal del hemisferio izquierdo. Para nuestros propósitos, la serie se fija en 1 / 10 secciones a lo largo de la corteza, en secciones de 50 micras. Una serie completa se tiñó con violeta de cresilo (serie n º 1). Serie 2 se dividió de manera que la mitad de las secciones fueron teñidas con cloruro de oro para la revelación de la mielina y la otra mitad para el teñido de la acetilcolinesterasa (por la delimitación de ciertas áreas subcorticales). Todas las otras series fueron donados al banco de antígenos preservar como parte de nuestros planes de investigación a largo plazo. </li></ol> Parte 3: Estereología (para más detalles, consulte Mouton 2002) 4 <ol><li> La estimación total de número de células (N) se calcula con base en la siguiente ecuación: N = ssf -1 x -1 x asf tsf -1 x Σ Q - Ssf donde es la fracción de muestreo sección, asf es la fracción de muestreo por áreas, TSF, si la fracción de muestreo de espesor (en el que se mida su espesor del tejido se divide por la altura disector), y Q Σ - es el número total de objetos de interés contar en el disector. Las siguientes secciones de este protocolo se muestra cómo determinar el ssf, asf, TSF y Q Σ. </li><li> Sección fracción de muestreo (sin computadora) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> El espacio de referencia en su totalidad debe estar bien definido de anterior a posterior y dorsal a ventral. En este ejemplo estamos interesados ​​en el lóbulo frontal y lo han definido como la región de la punta del polo frontal (anterior) con el surco (posterior) y el surco lateral (ventral) y se excluyó la ínsula. </li><li> Para el lóbulo frontal de este tema en particular un total de 760 secciones se recogieron de forma sistemática con 76 teñidas con violeta de cresilo. Puesto que el objetivo era de 10 secciones en todo el espacio de referencia en las secciones 6.1 cresil violeta manchado en la muestra, dando lugar a una fracción de la muestra la sección de alrededor de 1 / 60. Aleatoriamente se inició con uno de los primeros seis secciones cresil violeta manchado y muestreos sistemáticos 01.06 en adelante. Un total de 13 secciones se tomaron muestras para el motivo seleccionado (Figura 2). </li></ol></li><li> Área de fracción de la muestra (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Un estudio piloto indica el tamaño de la malla óptima, la fracción de muestreo de Área, a la muestra el espacio de referencia con alrededor de 100-300 disectors. En el lóbulo frontal, una malla de 2500 m 2 se obtuvo un promedio de 254 disectors para este tema (Figura 2). El tamaño del disector debe producir entre alrededor de 0-5 objetos contados, en este caso, las neuronas. </li></ol></li><li> Espesor fracción de la muestra (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> En cada lugar disector, la altura de los tejidos se mide, y una fracción de esta muestra es la altura, lo que se conoce como la fracción de muestreo de espesor. Para determinar el espesor medido, el enfoque a través del plano z hasta la primera celda se enfoca, de nuevo hacia arriba un poco a la parte superior de la sección, es decir, hasta el último objeto que aparece justo fuera de foco. Para determinar la parte inferior del tejido, el enfoque a través del plano z hasta que las células son poco fuera de foco. </li><li> Centrándose por el plano z, las células deben teñirse en todas las profundidades, si no, esto puede indicar una penetración incompleta de la deshidratación mancha o no uniforme de los tejidos, en cuyo caso las secciones deben ser re-manchado. Esta precaución es especialmente importante para el tejido immunostained que requiere la penetración de immunoprobes a través de secciones de tejido relativamente grueso. Por esta razón, el tejido immunostained debe ser ligeramente counterstained con una mancha de basófilos (violeta, por ejemplo, cresilo, hematoxylin) con el fin de determinar con precisión la parte superior e inferior de la sección y para confirmar la penetración de los anticuerpos. En este estudio, las secciones fueron cortadas con un ajuste de microtomo de 50 micras. Después de todo el procesamiento del tejido se completa, el grosor del tejido mide un promedio de 17.9μm (Figura 2), con una contracción promedio de alrededor del 65%. Tenga en cuenta que estos resultados representan la contracción típica de los tejidos procesados ​​para la preparación histológica de rutina 7. </li><li> La altura del disector por defecto para el estudio típico es 10μm. La diferencia entre la altura del disector y el espesor de corte se mide la altura de guardia, el volumen de tejido en las características biológicas no son contados. El uso de una altura de guardia evita daños en los tejidos en las superficies de corte (por ejemplo, pérdida de tapas). </li></ol></li><li> El número total de objetos contados, Σ Q - <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Para evitar el sesgo de los errores de reconocimiento, es imperativo que una definición estándar es seguido por la particularidad biológica de interés. En este caso, estamos interesados ​​en contar las neuronas. Por lo tanto, una neurona se define como tener un nucléolo visible situado en el centro y un citoplasma bien definido, mientras que las células gliales en general carecían de nucléolos visibles y el citoplasma. Para este tema 457 neuronas fueron contados. </li></ol></li></ol> Parte 4: Stereologer - Un sistema computarizado Estereología (Estereología Centro de Recursos, Chester, MD) <ol><li> El Sistema de Stereologer pide al usuario que rellene la información necesaria en una manera paso a paso. En el &quot;Estudio de la información&quot; sección de los parámetros del estudio se han establecido. Desde un espacio de referencia debe estar definido para el estudio, el parámetro de volumen deben ser seleccionados (para el espacio de referencia en el estimador de Cavalieri debe estar seleccionado). El volumen de objetos también pueden ser seleccionados desde aquí para calcular el número ponderado por el volumen de la población de objetos de interés. Para nuestro ejemplo, sólo el volumen del espacio de referencia seleccionado. Para cada objeto, seleccionar el número y definir la característica de interés, en este caso las neuronas. </li><li> Inicialización caso: En esta sección la información de muestreo se ha establecido. Introduzca el intervalo de muestreo de la losa (si las losas separadas de tejido fueron cortadas de manera exhaustiva y cada sección se coloca en orden secuencial a continuación, introduzca una aquí). Escriba el número total de secciones tomadas a través del espacio de referencia (en este caso 760). A continuación, introduzca el intervalo de muestreo sección (en este caso 59). El sistema calcula el número de secciones que se muestra (en este caso 13). </li><li> Los parámetros de la sonda: En esta sección se define la red y el tamaño del disector. Para el volumen, utilice un bajo aumento de 2.5x-10x para definir el espaciado de cuadrícula en el menú de edición. Ampliación del objeto debe realizarse a 100x (NA 1.3 o 1.4). Área de marco es el tamaño de la disector, en este caso se utilizó el 50% de la pantalla. La altura del marco es el espesor de la disector, fijado en 10μm aquí. La clara de cuadernas es el tamaño de la cuadrícula. En nuestro estudio piloto se encontró que los rendimientos de entre 150-200 2500μm marcos separados de una manera sistemática, uniforme a través de un espacio de referencia relativamente grande. Para áreas más pequeñas, un tamaño de malla más pequeña debe ser utilizado. Un estudio piloto identificará los parámetros de la sonda óptica para cada estudio en particular. </li><li> Una vez que los parámetros del estudio se han establecido, a través de la toma de muestras de tejidos puede continuar. El programa le pedirá que muestra la primera sección. Paso 1: El programa le pedirá al usuario, con bajo aumento, para rastrear el espacio de referencia en la sección. Entonces, el sistema colocará una malla en la sección sobre la base de los parámetros de la sonda y el usuario se va a verificar que los puntos comprendidos en el espacio de referencia. Si un punto no se encuentra dentro del espacio de referencia, simplemente haga clic en el punto y no aparecen calculados en el volumen. Paso 2: El sistema coloca una nueva red en el espacio de referencia, en base a los parámetros de marco espacio. Verifique que las intersecciones están comprendidas en el espacio de referencia. Paso 3: El sistema le pedirá al usuario que cambie con el objetivo de aumento más alto y mover el escenario para el disector primero. Paso 4: En este punto, el sistema solicita al usuario definir el superior e inferior de la sección, entonces el sistema establece el espacio de muestreo en el Paso del eje z 5:. El usuario hará clic en cada objeto que cae en el disector por el plano z. Los objetos que tocan las líneas rojas o la parte inferior de la disector no podrán ser contados. Una vez que cada objeto se cuenta, haga clic en siguiente. El escenario se moverá a la siguiente disector y los pasos 4 y 5 se repetirá. Una vez que todos los disectors de la sección han sido contadas, el sistema le pedirá al usuario que inserte la sección siguiente secuencia que se probaron. Los pasos 1-5 se repite hasta que todas las secciones secuenciales tienenhan tomado muestras. Entonces, el sistema proporcionará a los cálculos de la ASF, SSF, TSF, y Q Σ. En base a estos parámetros, el sistema generará un estimado de N, el volumen de referencia y la CE, tanto para el número estimado y el volumen. También se dan recomendaciones para ser más eficientes o para reducir la CE (Figura 2). </li></ol> Parte 5: Resultados del representante: Estereología imparcial proporciona estimaciones eficientes y fiables de las poblaciones de células dentro de un espacio de referencia. Hay una serie de sistemas basados ​​en computadoras estereológica disponibles, todos los cuales se basan en un muestreo sistemático y un espacio de referencia definidos. Hemos utilizado el sistema de vida Bioquant Ciencias para estimar el total de la población neuronal de la corteza cerebral de 2 años de edad, los monos verdes a más de 828 millones (Figura 3) con un promedio de 0,042 CE. Posteriormente hemos utilizado el sistema Stereologer para estimar que las cuentas del lóbulo frontal cerca de la mitad el número de neuronas corticales 8. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1 Los sistemas computarizados de Estereología. La configuración básica de los sistemas de estereología es lo mismo, un microscopio con una platina motorizada (xyz), un controlador de fase, una cámara de vídeo, ordenador y software. El sistema que finalmente se escogerán en función de la eficiencia, las necesidades y análisis de costos. <div style="border:1px #000000 solid"><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> ESTUDIO DE LA INFORMACIÓN </td></tr><tr><td> Nombre del estudio </td><td> La corteza frontal </td></tr><tr><td> Investigador Principal </td><td> MB </td></tr><tr><td> Especies </td><td> AG </td></tr><tr><td> Referencia del espacio frontal </td><td> Corteza </td></tr><tr><td colspan="2"> Notas </td></tr><tr><td colspan="2"> CASO DE INFORMACIÓN </td></tr><tr><td> Recopiladores de datos </td><td> MB </td></tr><tr><td> Fecha </td><td> Miércoles, 30 de abril 2008 </td></tr><tr><td> Grupo </td><td> Control </td></tr><tr><td> Tema </td><td> O26 </td></tr><tr><td colspan="2"> Notas </td></tr><tr><td colspan="2"> CARACTERÍSTICAS DE MUESTREO </td></tr><tr><td> Intervalo de muestreo de la losa </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Número total de las secciones </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Sección Intervalo de Muestreo </td><td> 59 </td></tr><tr><td> Sección de partida </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="2"> FRACCIONES </td></tr><tr><td> ASF </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td> SlabSF </td><td> 1,0000 </td></tr><tr><td> SSF </td><td> 0,0169 </td></tr><tr><td> TSF </td><td> 0,5587 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="6"> RESUMEN DE LOS RESULTADOS </td></tr><tr><td> Parámetro </td><td> Sonda </td><td> Nombre </td><td> Resultado </td><td> CE </td><td> SD </td></tr><tr><td> Espesor </td><td> --- </td><td> --- </td><td> 17.8996 μ </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> Número </td><td> Disector </td><td> neurona </td><td> 243833769.1473 </td><td> 0,0474 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Volumen </td><td> Cavalieri punto de la cuadrícula </td><td> volumen </td><td> 1719769397954.1284 μ ^ 3 </td><td> 0,0078 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> RECOMENDACIONES </td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Número de objetos (las neuronas) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0474 </td></tr><tr><td> Recomendaciones </td><td> CE es aceptable. </td></tr></tbody></table&gt; <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Número de Disectors visto es muy alto, aumentar el espaciado Disector. </td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Región de volumen (volumen) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0078 </td></tr><tr><td> Recomendaciones </td><td> CE es aceptable. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> RESULTADOS SECCIÓN </td></tr><tr><td> Sección </td><td> neurona NumObjects NumCorners neurona </td><td> RegPoints volumen </td></tr><tr><td> 1. 40 </td><td> 48 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> 2. 26 </td><td> 52 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 3. 29 </td><td> 56 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> 4. 39 </td><td> 100 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 5. 49 </td><td> 112 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 6. 53 </td><td> 156 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 7. 65 </td><td> 128 </td><td> 106 </td></tr><tr><td> 8. 45 </td><td> 108 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 9. 52 </td><td> 100 </td><td> 77 </td></tr><tr><td> 10. 26 </td><td> 64 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 11. 21 </td><td> 44 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 12. 11 </td><td> 36 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> 13. 1 </td><td> 12 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table></div> Figura 2 Resultados de la Lobe Fontal obtenidos con el sistema Stereologer. Para el lóbulo frontal, la parte más larga del proceso estereológica estaba en el muestreo sistemático y el corte. Estimación de la topografía, el volumen y neuronal se completa en aproximadamente un día por cada tema. El hemisferio izquierdo se muestra y el número se duplica en el texto de una estimación aproximada de los dos hemisferios. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="la figura 3" /> Figura 3 Estimación de la corteza de la población neuronal obtenidos con Bioquant. El sistema Bioquant requiere una topografía exacta antes de que el recuento de células. Aquí un promedio de 13 secciones se tomaron muestras. Topografía cortical y la estimación del volumen posterior se entre 15-20 horas para cada tema. La topografía se realizó bajo un objetivo 2,5 x y el recuento se realizó con un objetivo de inmersión 100x (NA 1.3). Cada sección 100a fue elegido en todo el hemisferio izquierdo, con un promedio de 180 disectors la muestra. Una vez que la topografía se terminó de contar neuronal tomó cerca de un día. El hemisferio izquierdo se muestra y el número se duplica en el texto de una estimación aproximada de los dos hemisferios.

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	<li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li><li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+cut+it:+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods.">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practices of Unbiased Stereology. , (2002).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space.">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+banking:+Making+the+most+of+your+research.">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP/PS1:+Neuroimaging,+Stereology,+And+Biochemistry.">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li><li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure.">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li><li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain.">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li></ol>

Estereología imparcial en un cerebro de los primates es similar a la de otras muestras biológicas. Sin embargo, dado el tamaño del cerebro de los primates, un plan de tratamiento cuidadoso, se recomienda desde un solo hemisferio de los monos verdes se obtienen más de 1200 secciones en rodajas a 50 micras. En primer lugar se recomienda stereotaxically bloqueando el cerebro en bloques de 1 cm, que proporciona un avión estándar de la sección entre los bloques y temas, minimiza las secciones parciales entre los bloqu...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereologer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stereology Resource Center (Chester, MD)</td>
<td>www.disector.com</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereology Tool-Kit Stereologer system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>StereoInvestigator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroBright Field (Willston, VT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain

Los primates no humanos es una importante especie de traslación para entender los procesos normales de funcionamiento y las enfermedades del cerebro humano. Estereología imparcial, el método aceptado como estado de la técnica para la cuantificación de los objetos biológicos en secciones de tejido<sup&gt; 2</sup&gt;, Genera datos fiables sobre la estructura de las características biológicas en el cerebro de los mamíferos<sup&gt; 3</sup&gt;. Los componentes clave del enfoque son imparciales (sistemática aleatoria) de muestreo de las estructuras anatómicas definidas (los espacios de referencia), en combinación con la cuantificación del número de células y las longitudes de tamaño, la fibra capilar y, superficies, volúmenes regionales y la distribución espacial de los objetos biológicos en el espacio de referencia<sup&gt; 4</sup&gt;. Entre las ventajas de estos métodos estereológicos sobre los métodos anteriores es la prevención de todas las fuentes conocidas de error sistemático (no aleatorio) que surgen de suposiciones incorrectas y modelos que no son verificables. Este estudio documenta una aplicación biológica de estereología computarizado para estimar la población total de neuronas en la corteza frontal del cerebro, los monos verdes (<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;), Con la ayuda de dos programas estereología disponibles en el mercado, Ciencias de la Vida y Bioquant Stereologer (Figura 1). Además de contraste y la comparación de los resultados tanto de la Bioquant y<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistemas, este estudio proporciona un protocolo detallado para la<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistema.

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Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

La organización anatómica del cerebro de los primates puede proporcionar información importante sobre las condiciones normales y patológicas en los seres humanos. Estereología imparcial es un método de forma precisa y eficiente la estimación del número de neuronas total (o otro tipo de células) en un espacio de referencia dado<sup&gt; 1</sup&gt;.

Sabiendo lo que cuenta: Estereología imparcial en el cerebro de los primates no humanos

The non-human primate is an important translational species for understanding the normal function and disease processes of the human brain. Unbiased ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.6K vistas.  University of Montreal. La organización anatómica del cerebro de los primates puede proporcionar información importante sobre las condiciones normales y patológicas en los seres humanos. Estereología imparcial es un método de forma precisa y eficiente la estimación del número de neuronas total (o otro tipo de células) en un espacio de referencia dado 1.

Video: Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Aplicación de curado con luz Resina Adhesivo Dental para los electrodos de montaje o sondas de microdiálisis en experimentos crónica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Investigación

Biología

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

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Micro-disección de cerebro de rata para el ARN o la extracción de proteínas a partir de región específica del cerebro

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Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

La electroporación in vivo sola célula en el cerebro intacto desarrollo

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Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In addition, the use of non-human primates has recently afforded the opportunity to naturally model complex psychiatric disorders such as alcohol abuse7. Here we describe a technique for blocking the brain in the coronal plane of the vervet monkey (Chlorocebus aethiops sabeus) in the intact skull in stereotaxic space. The method described here provides a standard plane of section between blocks and subjects and minimizes partial sections between blocks. Sectioning a block of tissue in the coronal plane also facilitates the delineation of an area of interest. This method provides manageable sized blocks since a single hemisphere of the vervet monkey yields more than 1200 sections when slicing at 50&mu;m. Furthermore by blocking the brain into 1cm blocks, it facilitates penetration of sucrose for cyroprotection and allows the block to be sliced on a standard cryostat.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of the normal processing of the brain. The anatomical organization of the primate brain can provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

La disección de cerebro de los primates no humanos en el espacio estereotáxica

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

The visual system in humans is considered the gateway to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive processes. It is therefore not surprising that quality of vision is tied to quality of life . Despite widespread clinical and basic research surrounding the causes of visual disorders, many forms of visual impairments, such as retinitis pigmentosa and macular degeneration, lack effective treatments. Non-human primates have the closest general features of eye development to that of humans. Not only do they have a similar vascular anatomy, but amongst other mammals, primates have the unique characteristic of having a region in the temporal retina specialized for high visual acuity, the fovea1. Here we describe a general technique for dissecting the primate retina to provide tissue for retinal histology, immunohistochemistry, laser capture microdissection, as well as light and electron microscopy. With the extended use of the non-human primate as a translational model, our hope is that improved understanding of the retina will provide insights into effective approaches towards attenuating or reversing the negative impact of visual disorders on the quality of life of affected individuals.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of development and aging. The anatomical organization of the primate retina may provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

La puerta de enlace para el cerebro: la disección de los ojos de Primates

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Determinación del recuento de células de mamíferos, el tamaño celular y la salud de la célula mediante el Moxi Z Mini contador automatizado de células

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Demostración Laboratorio Fisiología: tasa de filtración glomerular en una rata

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Toma de muestras de sangre de la vena lateral de la cola de la rata

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-claro: Un tejido claro método de proyección de imagen tridimensional del tejido adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Reverse Dissection and DiceCT Reveal Otherwise Hidden Data in the Evolution of the Primate Face

Facial expressions, or facial displays, of social or emotional intent are produced by many mammalian taxa as a means of visually communicating with conspecifics at a close range. These displays are achieved by contraction of the mimetic muscles, which are skeletal muscle attached to the dermis of the face. Reverse dissection, removing the full facial mask from the skull and approaching mimetic muscles in reverse, is an effective but destructive way of revealing the morphology of mimetic muscles but it is destructive. DiceCT is a novel mechanism for visualizing skeletal muscles, including mimetic muscles, and isolating individual muscle fascicles for quantitative measurement. Additionally, DiceCT provides a non-destructive mechanism for visualizing muscles. The combined techniques of reverse dissection and DiceCT can be used to assess the evolutionary morphology of mimetic musculature as well as potential contraction strength and velocity in these muscles. This study further demonstrates that DiceCT can be used to accurately and reliably visualize mimetic muscles as well as reverse dissection and provide a non-destructive method for sampling mimetic muscles.

Facial expressions are a mode of visual communication produced by mimetic muscles. Here, we present protocols for the novel techniques of reverse dissection and DiceCT to fully visualize and assess mimetic muscles. These combined techniques can examine both morphological and physiological aspects of mimetic musculature to determine functional aspects.

Inversa, disección y DiceCT revelan lo contrario oculta datos en la evolución de la cara de Primate

Facial expressions, or facial displays, of social or emotional intent are produced by many mammalian taxa as a means of visually communicating with ...