Yazarlar Ikiel Ptito onun devam eden teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. MP NSERC hibe.

Bölüm 1: Ön-işleme doku Burke ve ark göre yapılmalıdır. (2009) 5 <ol><li> Kısaca, doku paraformaldehid, glutaraldehid, ya da formalin ile perfüze olması gerekir. Bu, genellikle diğer organlarda hasat için kullanılan standart transcardial perfüzyon yoluyla elde edilebilir. Bu çalışmada bu konuda derin sodyum pentobarbital (25 mg / kg, iv), aşırı dozda ötenazi ketamin hidroklorür (10 mg / kg, im), sedasyon ve tamamen exsanguinated kadar 0.1 M PBS ile transcardially perfüze. Bu 5 dakika (~ 1 litre) PBS içinde% 4 paraformaldehid çözümü ile takip edilmektedir. Doku paraformaldeyhde, gluteraldehid, ya da formalin ile perfüze edilmelidir. Beyin stereotaxically bloke kafatası çıkarıldı, tartılır olmalıdır, hacmi belirlenir, cryoprotected ve 5 donmuş. </li></ol> Bölüm 2: doku Sistematik Örnekleme, Burke ve ark. (2009) 6. <ol><li> Bu örnekte vervet beynin frontal lob üzerinde duruldu. Referans alan, merkez sulkus sol hemisfer ön direğe kortikal doku içerecek şekilde tanımlanmıştır. Bizim amaçlarımız için seri 50μm az kesitli korteks boyunca 1 / 10 bölümleri kuruldu. Bir tam serisi cresyl menekşe (seri # 1) ile boyandı. Seri 2 bölümden yarısı altın klorür miyelin vahiy ve asetilkolin esteraz için diğer yarısı boyanmış (belirli subkortikal alanları tarif) ile boyandı, böylece ayrıldı. Tüm diğer serileri, bizim uzun vadeli araştırma planlarının parçası olarak antijen muhafaza banked edildi. </li></ol> Bölüm 3: Stereology (ayrıntılı bilgi için bakınız, Mouton 2002) 4 <ol><li> Hücre sayıları toplam tahmini (N) aşağıdaki denklemle hesaplanır: N = ssf -1 x asf -1 x tsf -1 x Σ Q - Sayılır ilgi nesnelerin toplam sayısı kalınlık örnekleme fraksiyonu (doku ölçülen kalınlığı disektör yüksekliği bölünmüş olduğu), ve Σ Q ssf bölümde örnekleme fraksiyonu, ASF alanında örnekleme fraksiyonu, tsf. disektör içinde. Bu protokolün sonraki bölüm ssf, asf, tsf ve Σ S nasıl belirleneceği göstermektedir. </li><li> Bölüm Örnekleme Kesir (bilgisayar tabanlı) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Tüm referans alan, ventral posterior ve dorsal anterior tanımlanmış olmalıdır. Bu örnekte, frontal lob ilgilenmişlerdir ve merkezi sulkus (posterior) ve lateral sulcus (ventral), frontal kutup (ön) ucundan bölge olarak tanımlanmış ve insula hariç. </li><li> Frontal lob bu konu için toplam 760 bölümden sistematik cresyl menekşe 76 boyandı toplanmıştır. Hedef referans alan boyunca 10 bölüm olduğu için 1 / 6 cresyl mor boyanan kesitler 1 / 60 ile ilgili bir bölüm Örnek Kesir önde gelen örneklenerek elde edilmiştir. Biz rastgele bir ilk 6 cresyl mor boyanan kesitler ile başlayan ve sistematik olarak bundan sonra 1 / 6 örneklenmiş. Seçilen konu (Şekil 2) toplam 13 bölümden örneklendi. </li></ol></li><li> Alan Örnek Kesir (bilgisayar tabanlı) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Bir pilot çalışma, yaklaşık 100-300 disectors referans alan örnek, optimum ızgara boyutu, Alan Örnekleme Kesir gösterecektir. Frontal lob içinde, 2500 mm 2 ızgara boyutu 254 disectors (Şekil 2) bu konu için ortalama vermiştir. Bu durumda 0-5 sayılır nesneleri, nöronlar hakkında disektör boyutu arasında boyun eğmek zorundadır. </li></ol></li><li> Kalınlığı Örnek Kesir (bilgisayar tabanlı) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Her disektör yerde, doku yüksekliği ölçülür ve bu yükseklikte bir kısmını örneklenir, bu kalınlık örnekleme fraksiyonu olarak bilinir. Ölçülen kalınlığını belirlemek için, ilk hücrenin, son nesne, odak sadece görünene kadar yedekleme bölümüne, yani üst biraz sonra, odak noktası haline gelene kadar z-düzlemi ile odak. Hücrelerin zar zor dışarı odak kadar dokusunun alt belirlemek için, z-düzlemi ile odaklanır. </li><li> Z-düzlemi ile yoğunlaşırken, hücreler her derinlikte boyanmış olmalıdır; yoksa, bu bölümleri yeniden boyanmış olmalıdır, bu durumda, doku, leke ya da düzgün olmayan dehidratasyon tamamlanmamış bir penetrasyon gösterebilir. Bu önlem, nispeten kalın bir doku bölümleri ile immunoprobes penetrasyonu gerektirir ile immunohistokimyasal doku için özellikle önemlidir. Bu nedenle, immunohistokimyasal boyanan doku hafifçe bazofilik bir leke (örneğin, cresyl menekşe, hema zıt olmalıdırtoxylin) bölümün üst ve alt sırasına göre doğru belirlemek ve antikor penetrasyon onaylamak için. Bu çalışmada bölümleri 50μm bir mikrotom ayarda dilimlenmiş. Tüm doku işlemleri tamamlandıktan sonra, ölçülen doku kalınlığı, yaklaşık% 65 ortalama daralma ile, 17.9μm (Şekil 2) ortalama. Bu sonuçlar, rutin histolojik hazırlık 7 için işlenmiş doku için tipik büzülme temsil ettiğini unutmayın . </li><li> Tipik bir çalışma için varsayılan disektör yüksekliği 10μm. Disektör yüksekliği ve ölçülen kesit kalınlığı arasındaki fark, koruma yüksekliği, biyolojik özellikleri yok sayılır doku hacmi. Bir bekçi yüksekliği kullanımı (örneğin, kaybolan kapakları) kesit yüzeyleri, doku hasarı önler. </li></ol></li><li> Nesnelerin toplam sayısı, Σ Q - <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Önyargı tanıma hataları önlemek için, standart bir tanım ilgi özellikle biyolojik özelliği olduğunu zorunludur. Bu durumda, biz nöronlar sayma ilgilenmişlerdir. Bu nedenle, bir nöron, glial hücreleri genellikle görünür nükleol ve sitoplazma yoksun ise, görünür bir merkezi bir konuma nükleolus ve açıkça tanımlanmış sitoplazma olarak tanımlandı. Bu konu 457 nöronlar sayıldı. </li></ol></li></ol> Bölüm 4: Stereologer - Bilgisayarlı Stereology Sistemi (Stereology Kaynak Merkezi, Chester, MD) <ol><li> Stereologer Sistemi kullanıcı bir adım-adım moda, gerekli bilgileri doldurmak ister . &quot;Çalışma Bilgileri&quot; bölümünde çalışmanın parametreleri oluşturulmuştur. Bir referans alan çalışma için tanımlanmış olmalıdır, ses parametre (referans alanı Cavalieri tahmincisi seçili olmalıdır) seçili olmalıdır. Nesne hacmi de ilgi nesnelerin nüfus sayısı ağırlıklı hacmini tahmin etmek için seçilmiş olabilir. Örneğin, sadece referans alan hacmi seçildi. Her nesne için, numarayı seçin ve bu durumda Nöronlar, faiz özelliğini tanımlamak. </li><li> Vaka Başlatma: Bu bölümde örnekleme bilgi kurulmuştur. Slab örnekleme aralığı (doku ayrı plaka ince ayrıntısına kadar dilimlenmiş ve her bölümde sırayla yerleştirilir, daha sonra burada 1 girin) girin. Referans alan (bu durumda 760) üzerinden alınan bölümlerin toplam sayısını girin. Sonra bölümde örnekleme aralığı (Bu durumda 59) girin. Sistem daha sonra numune alınacak (bu durumda 13) bölümlerinin sayısını hesaplar. </li><li> Probe Parametreler: Bu bölümde, ızgara ve disektör boyutunu tanımlar. Hacmi için düzenleme menüsü altında, ızgara aralığı tanımlamak için 2.5x-10x düşük bir büyütme kullanabilirsiniz. Nesne büyütme 100x (NA 1.3 veya 1.4) yapılmalıdır. Çerçeve alanı, disektör boyutunu Bu durumda biz% 50 Ekran kullandı. Çerçeve yüksekliği disektör kalınlığı; burada 10μm olarak belirlenmiştir. Çerçeve aralığı, ızgara boyutu. Pilot çalışmada 150-200 kare arasında 2500μm verim göreceli olarak büyük bir referans alanı üzerinden sistematik bir düzgün bir şekilde yerleştirilen bulundu. Daha küçük alanlar için, küçük bir ızgara boyutu kullanılmalıdır. Bir pilot çalışma, her bir çalışma için optik prob parametreleri belirleyecektir. </li><li> Çalışma parametreleri kurulmuş olup, örnekleme yoluyla doku geçebilirsiniz. Programı ilk bölümünde örnek isteyecektir Adım 1: program bölümünde referans uzayı izlemek için düşük büyütme altında, kullanıcı isteyecektir. Sistem daha sonra daha sonra bu noktaları referans alanı içinde kalan doğrular prob parametreleri ve kullanıcı dayalı bölümü üzerinde bir tablo koyacaktır. Bir nokta referans alanı içinde değilse sadece noktaya tıklayın ve hacmin içine hesaplanır olmayacaktır Adım 2: sistemi çerçevesinde aralığı parametreleri dayalı referans alan üzerine yeni bir ızgara koyacaktır. Doğrulayın kavşakları referans alanı içinde yer almaktadır Adım 3: Ardından sistem, kullanıcının yüksek büyütme amacı geçmek ve ilk disektör üzere sahneye taşımak isteyecektir Adım 4: Bu noktada sistemin kullanıcı tanımlamak için ister bölümün üst ve alt sisteminin z ekseni Adım 5 örnekleme alanı ayarlar: Kullanıcı daha sonra z-düzlemi ile disektör içinde düşen her nesne üzerine tıklayın. Kırmızı çizgiler veya disektör alt dokunmatik Nesneler sayılmayacaktır. Her nesne sayılır sonra, bir sonraki tıklatın. Aşama bir sonraki disektör ve 4 ve 5 tekrarlanacaktır adımları hareket edecektir. Disectors bölüm için tüm sistem bir sonraki probed sıralı bölümü eklemek için kullanıcı istemi, sayılmıştır. Sıralı tüm bölümleri kadar 1-5 adımlarını tekrar olacakörneklenmiş oldu. Sistem daha sonra, asf, ssf, tsf ve Σ Q hesaplamaları sağlayacaktır . Bu parametreler göre, sistemi, referans hacmi tahmini K oluşturmak ve CE tahmini sayısı ve hacim olacak. Aynı zamanda daha verimli hale öneriler verecektir ya da azaltmak için CE (Şekil 2). </li></ol> Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları: Hakkında tarafsız stereology bir referans alanı içinde hücre popülasyonlarının verimli ve güvenilir tahminler sağlar. Her biri sistematik örnekleme ve tanımlanmış bir referans alanı güveniyor stereolojik sistemleri, bilgisayar tabanlı bir dizi vardır. 2 yaşındaki vervets serebral korteks toplam nöronal nüfusu 0,042 ortalama CE ile 828 milyon (Şekil 3) üzerinde olduğu tahmin etmek BioQuant Yaşam Bilimleri sistemi kullandık. Biz sonradan tahmin Stereologer sistemi kullanılmaktadır kortikal nöronların yaklaşık yarısı sayısı 8 frontal lob hesapları. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 Bilgisayar tabanlı Stereology Sistemleri. Stereology sistemlerinin temel set-up (xyz) motorlu bir sahne ile aynı, bir mikroskop, bir sahne denetleyicisi, video kamera, bilgisayar ve yazılım. Sonuçta seçilen sistemin verimliliği, ihtiyaç ve maliyet analizi dayalı olmalıdır. <div style="border:1px #000000 solid"><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> ÇALIŞMA BİLGİLER </td></tr><tr><td> Çalışma Adı </td><td> Frontal Korteks </td></tr><tr><td> Baş Araştırmacı </td><td> MB </td></tr><tr><td> Tür </td><td> AG </td></tr><tr><td> Referans Uzay Frontal </td><td> Cortex </td></tr><tr><td colspan="2"> Notlar </td></tr><tr><td colspan="2"> VAKA BİLGİ </td></tr><tr><td> Veri Toplayıcı </td><td> MB </td></tr><tr><td> Tarih </td><td> Çarşamba, 30 Nisan 2008 </td></tr><tr><td> Grup </td><td> Kontrol </td></tr><tr><td> Konu </td><td> Ø26 </td></tr><tr><td colspan="2"> Notlar </td></tr><tr><td colspan="2"> ÖRNEKLEME ÖZELLİKLERİ </td></tr><tr><td> Döşeme Örnekleme Aralığı </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Bölümler Sayısı </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Bölüm Örnekleme Aralığı </td><td> 59 </td></tr><tr><td> Başlangıç ​​Bölüm </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="2"> FRAKSIYONLARI </td></tr><tr><td> ASF </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td> SlabSF </td><td> 1,0000 </td></tr><tr><td> SSF </td><td> 0,0169 </td></tr><tr><td> TSF </td><td> 0,5587 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="6"> SONUÇLAR ÖZET </td></tr><tr><td> Parametre </td><td> Sonda </td><td> Isim </td><td> Sonuç </td><td> CE </td><td> SD </td></tr><tr><td> Kalınlık </td><td> --- </td><td> --- </td><td> 17,8996 μ </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> Numara </td><td> Disektör </td><td> nöron </td><td> 243833769.1473 </td><td> 0,0474 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Hacim </td><td> Cavalieri Noktası Grid </td><td> hacim </td><td> 1719769397954.1284 μ ^ 3 </td><td> 0,0078 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> ÖNERİLER </td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Nesne sayısı (nöron) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0474 </td></tr><tr><td> Öneriler </td><td> CE kabul edilebilir. </td></tr></tbody></table&gt; <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> İzlenen Disectors Sayısı Çok Yüksek, disektör Aralığı artırın. </td></tr><tr><td> Sonda </td><td> Bölge Hacmi (hacmi) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0078 </td></tr><tr><td> Öneriler </td><td> CE kabul edilebilir. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> BÖLÜM SONUÇLAR </td></tr><tr><td> Bölüm </td><td> nöron nöron NumCorners NumObjects </td><td> hacmi RegPoints </td></tr><tr><td> 1. 40 </td><td> 48 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> 2. 26 </td><td> 52 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 3. 29 </td><td> 56 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> 4. 39 </td><td> 100 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 5. 49 </td><td> 112 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 6. 53 </td><td> 156 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 7. 65 </td><td> 128 </td><td> 106 </td></tr><tr><td> 8. 45 </td><td> 108 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 9 - 52 </td><td> 100 </td><td> 77 </td></tr><tr><td> 10 26 </td><td> 64 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 11. 21 </td><td> 44 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 12. 11 </td><td> 36 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> 13. 1 </td><td> 12 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table></div> Şekil 2 Stereologer Sistemi ile Elde Edilen Fontal Lob Sonuçları frontal lob, stereolojik sürecinin uzun parçası sistematik örnekleme ve kesit. Topoğrafya, hacim ve nöronal satışta her konu hakkında bir gün içinde tamamlanmıştır. Sol hemisfer örnekleri alındı ​​ve bu sayı her iki yarımkürede için yaklaşık bir tahmin metin iki katına çıkar. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 Cortex Nöronal Nüfus Tahmini BioQuant ile elde edildi. BioQuant sistemi, hücre sayımı öncesinde tam bir topografya gerektirir . İşte 13 bölümden ortalama örneklendi. Kortikal topografya ve sonraki hacmi tahmini, her konu için 15-20 saat arasında sürmüştür. Topoğrafya 2.5x objektif altında yapıldı ve sayım 100x immersiyon yağı hedefi (NA 1.3) kullanılarak yapıldı. 100. Her bölümde ortalama 180 disectors örneklenmiş ile sol hemisfer boyunca seçildi. Nöronal sayma topografyası tamamlandıktan sonra yaklaşık bir gün sürmüştür. Sol hemisfer örnekleri alındı ​​ve bu sayı her iki yarımkürede için yaklaşık bir tahmin metin iki katına çıkar.

<ol>
	<li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li><li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+cut+it:+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods.">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practices of Unbiased Stereology. , (2002).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space.">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+banking:+Making+the+most+of+your+research.">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP/PS1:+Neuroimaging,+Stereology,+And+Biochemistry.">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li><li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure.">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li><li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain.">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li></ol>

Primat beyin hakkında tarafsız stereology diğer biyolojik örneklerin benzer. Bununla birlikte, 50μm az dilimlenmiş vervet maymun tek bir yarımkürede 1200&#39;den fazla bölüm verir primat beynin büyüklüğü göz önüne alındığında, dikkatli bir işleme planı önerilir. Öncelikle stereotaxically 1cm blokları, blok ve konular arasındaki bölümün standart bir düzlemde sağlar bloklar arasında kısmi bölümleri en aza indirir ve yönetilebilir büyüklükte bloklar 5 sağlar beynin engel...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereologer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stereology Resource Center (Chester, MD)</td>
<td>www.disector.com</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereology Tool-Kit Stereologer system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>StereoInvestigator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroBright Field (Willston, VT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain

Insan dışı primat normal insan beyninin fonksiyonu ve hastalık süreçleri anlamak için önemli bir translasyonel türüdür. Hakkında tarafsız stereology, doku bölümlerde biyolojik nesnelerin ölçümü için state-of-the-art olarak kabul edilen yöntem<sup&gt; 2</sup&gt; Memeli beyindeki biyolojik özellikleri için güvenilir yapısal veri oluşturur<sup&gt; 3</sup&gt;. Bu yaklaşımın anahtar bileşenleri tarafsız içinde hücre sayıları ve boyutu, lif ve kılcal uzunlukları, yüzey alanları, bölgesel hacimleri ve mekansal dağılımları, biyolojik nesnelerin ölçümü ile birlikte anatomik olarak tanımlanmış yapılar (referans alanlarda), (sistematik-random) örnekleme referans alan<sup&gt; 4</sup&gt;. Önceki yöntemlerine göre bu stereolojik yaklaşımlar avantajları arasında hatalı varsayımlar ve doğrulanabilir olmayan modeller kaynaklanan sistematik (non-random) hata bilinen tüm kaynakları kaçınma. Bu çalışmada, bilgisayarlı stereology (vervet maymun beynin frontal korteks nöronal toplam nüfusun tahmin etmek için biyolojik bir başvuru belgeleri<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;), Iki piyasada bulunan stereology programları, BioQuant Yaşam Bilimleri ve Stereologer (Şekil 1) yardımı ile. Kontrast ve hem de BioQuant sonuçların karşılaştırılması ve ek olarak<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistemleri, bu çalışma için ayrıntılı bir protokol sağlar<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistem.

Watch this Scientific Journal Video about Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain at JoVE.com

Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

Primat beynin anatomik organizasyonu, insanlarda normal ve patolojik durumları önemli bilgiler sağlayabilir. Hakkında tarafsız stereology, doğru ve etkin bir biçimde, belirli bir referans alanı toplam nöron numarası (veya başka bir hücre tipi) tahmin etmek için bir yöntemdir<sup&gt; 1</sup&gt;.

Sigara insan Primate Beyin | Stereology: sayar ne bilmek

The non-human primate is an important translational species for understanding the normal function and disease processes of the human brain. Unbiased ...

knowing-what-counts-unbiased-stereology-in-the-non-human-primate-brain

Research

JoVE Journal

Biology

13.7K Görüntüleme.  University of Montreal. Primat beynin anatomik organizasyonu, insanlarda normal ve patolojik durumları önemli bilgiler sağlayabilir. Hakkında tarafsız stereology, doğru ve etkin bir biçimde, belirli bir referans alanı toplam nöron numarası (veya başka bir hücre tipi) tahmin etmek için bir yöntemdir 1.

Video: Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Kronik Deneyleri Montaj Elektrotlar veya mikrodiyaliz Problar Işık tedavi Diş Yapıştırıcı Reçine Uygulama

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Biyoloji

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

RNA veya Protein Ekstraksiyonu Özgül Beyin Bölgesi&#39;nden Rat Beyin Mikro-disseksiyon

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Tek Hücre Elektroporasyon bozulmamış Gelişmekte olan beyin içindeki in vivo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In addition, the use of non-human primates has recently afforded the opportunity to naturally model complex psychiatric disorders such as alcohol abuse7. Here we describe a technique for blocking the brain in the coronal plane of the vervet monkey (Chlorocebus aethiops sabeus) in the intact skull in stereotaxic space. The method described here provides a standard plane of section between blocks and subjects and minimizes partial sections between blocks. Sectioning a block of tissue in the coronal plane also facilitates the delineation of an area of interest. This method provides manageable sized blocks since a single hemisphere of the vervet monkey yields more than 1200 sections when slicing at 50&mu;m. Furthermore by blocking the brain into 1cm blocks, it facilitates penetration of sucrose for cyroprotection and allows the block to be sliced on a standard cryostat.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of the normal processing of the brain. The anatomical organization of the primate brain can provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

Sigara insan Stereotaksik Uzay Primate Beyin Diseksiyon

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

The visual system in humans is considered the gateway to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive processes. It is therefore not surprising that quality of vision is tied to quality of life . Despite widespread clinical and basic research surrounding the causes of visual disorders, many forms of visual impairments, such as retinitis pigmentosa and macular degeneration, lack effective treatments. Non-human primates have the closest general features of eye development to that of humans. Not only do they have a similar vascular anatomy, but amongst other mammals, primates have the unique characteristic of having a region in the temporal retina specialized for high visual acuity, the fovea1. Here we describe a general technique for dissecting the primate retina to provide tissue for retinal histology, immunohistochemistry, laser capture microdissection, as well as light and electron microscopy. With the extended use of the non-human primate as a translational model, our hope is that improved understanding of the retina will provide insights into effective approaches towards attenuating or reversing the negative impact of visual disorders on the quality of life of affected individuals.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of development and aging. The anatomical organization of the primate retina may provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

Beyin Ağ Geçidi: Primate Göz Diseksiyon

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Moxi Z Mini Otomatik Hücre Sayacı Kullanımı Memeli Hücre Sayımı, Hücre Boyutu ve Hücre Sağlık Belirlenmesi

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

Theta sonrası etkileri Haritalama Fonksiyonel Görüntüleme ile İnsan İşitsel korteks üzerine Stimülasyon Burst

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Fizyoloji Laboratuvarı Gösteri: Bir Sıçan Glomerüler Filtrasyon Hızı

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Rat Yanal Kuyruk Ven gelen Kan Örnekleme

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...