Die Autoren bedanken sich bei Ikiel Ptito für seine weitere fachliche Unterstützung danken. NSERC Zuschuss zu MP.

Teil 1: Pre-Processing von Gewebe sollte nach Burke et al durchgeführt werden. (2009) 5. <ol><li> Kurz gesagt, sollten Gewebe gut mit Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder Formalin perfundiert werden. Dies kann durch Standard-transcardial Perfusion in der Regel verwendet, um andere Organe Ernte erreicht werden. In der vorliegenden Studie das Thema war tief mit Ketaminhydrochlorid (10 mg / kg, im), mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (25 mg / kg, iv) eingeschläfert sediert und perfundierten transkardial mit 0,1 M PBS, bis sie vollständig ausgeblutet. Dies wird durch eine 4% Paraformaldehyd-Lösung in PBS für 5 min (~ 1 Liter) folgten. Tissue sollte gut mit paraformaldeyhde, Glutaraldehyd oder Formalin perfundiert werden. Das Gehirn soll stereotaxically blockiert, entfernt aus dem Schädel, gewogen, Volumen bestimmt, cryoprotected und gefrorenen 5. </li></ol> Teil 2: Systematische Sampling von Gewebe nach Burke et al. (2009) 6. <ol><li> In diesem Beispiel haben wir uns auf den Stirnlappen des Gehirns vervet. Der Verweis Raum wurde definiert, um kortikale Gewebe aus dem zentralen Sulcus der frontalen Pol der linken Hemisphäre gehören. Für unsere Zwecke der Folge wurden in 1 / 10 Sektionen in der gesamten Hirnrinde, im Schnitt bei 50 um gesetzt. Eine komplette Serie wurde mit Kresylviolett (Serie # 1) gefärbt. Serie 2 wurde aufgeteilt, so dass die Hälfte der Schnitte wurden mit Goldchlorid für Myelin Offenbarung und die andere Hälfte gefärbt Acetylcholinesterase (zur Abgrenzung von bestimmten subkortikalen Bereichen) gefärbt. Alle anderen Serien wurden in Antigen erhalten im Rahmen unserer langfristigen Forschungs-Pläne überhöht. </li></ol> Teil 3: Stereology (weitere Einzelheiten siehe Mouton 2002) 4 <ol><li> Die Gesamtschätzung der Zellzahlen (N) wird auf der Grundlage der folgenden Gleichung berechnet: N = ssf -1 x asf -1 x tsf -1 x Σ Q - Wo ssf Abschnitt Auswahlsatz ist, asf Bereich Sampling-Fraktion, TSF, wenn die Dicke Auswahlsatz (wo der gemessenen Dicke des Gewebes wird durch die Dissektor Höhe geteilt), und Σ Q - ist die Gesamtzahl der Objekte von Interesse gezählt innerhalb der Dissektor. Die nächsten Abschnitte dieses Protokoll zeigen, wie die SSF, asf, TSF und Σ Q zu bestimmen. </li><li> Section Sampling Fraction (non-computer based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Die gesamte Referenzraum müssen auch von vorne nach hinten und dorsal werden, um ventral definiert. In diesem Beispiel waren wir daran interessiert, den Frontallappen und definiert sie als die Region von der Spitze des frontalen Pol (anterior) an den zentralen Sulcus (posterior) und der lateralen Sulcus (ventral) und die Insula ausgeschlossen. </li><li> Für den Frontallappen von diesem speziellen Thema insgesamt 760 Schnitte wurden systematisch mit 76 gefärbt Kresylviolett gesammelt. Da das Ziel 10 Abschnitte wurde während der Referenz-Raum 1 / 6 Kresylviolett gefärbten Schnitte wurden Proben entnommen, was zu einer Section Probe Anteil von etwa 1 / 60. Wir zufällig begann mit einer der ersten 6 Kresylviolett gefärbten Schnitten und systematisch abgetastet 1 / 6 danach. Insgesamt 13 Abschnitte wurden für das ausgewählte Motiv (Abbildung 2) abgetastet. </li></ol></li><li> Bereich Probenfraktion (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Eine Pilotstudie zeigt die optimale Rasterweite, der Area Sampling Fraction, die Referenz-Raum mit ca. 100-300 disectors Probe. Innerhalb der Frontallappen, ergab eine Maschenweite von 2500 um 2 einen Schnitt von 254 disectors für dieses Thema (Abbildung 2). Die Größe der disector sollte zwischen etwa 0-5 gezählt Objekte, in diesem Fall Neuronen ergeben. </li></ol></li><li> Dicke Probenfraktion (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> An jedem disector Lage, ist die Höhe des Gewebes gemessen, und ein Bruchteil dieser Höhe wird abgetastet, das ist wie die Dicke Sampling Fraktion bekannt. Zur Bestimmung der gemessenen Dicke über der z-Ebene zu konzentrieren, bis die erste Zelle rückt in den Fokus, dann wieder leicht nach oben an die Spitze des Abschnitts, dh bis das letzte Objekt erscheint nur unscharf. Zur Bestimmung der Unterseite des Gewebes durch die z-Ebene zu konzentrieren, bis die Zellen kaum sind unscharf. </li><li> Fokussierung durch die z-Ebene sollten die Zellen in jeder Tiefe gefärbt werden, falls nicht, kann dies ein unvollständiges Eindringen der Flecken oder ungleichmäßige Austrocknung des Gewebes zeigen, in welchem ​​Fall die Abschnitte sollten re-gefärbt werden. Diese Vorsichtsmaßnahme ist besonders wichtig für immungefärbt Gewebe, das Eindringen von immunoprobes erfordert durch relativ dicke Gewebeschnitte. Aus diesem Grund sollte immungefärbt Gewebe leicht mit einem basophile Färbung (zB Kresylviolett, hema gegengefärbt werdentoxylin), um genau zu bestimmen, Ober-und Unterseite des Profils und das Eindringen des Antikörpers zu bestätigen. In dieser Studie wurden die Schnitte auf einem Mikrotom Einstellung von 50 um in Scheiben geschnitten. Nachdem alle Gewebe Verarbeitung abgeschlossen war, lag der gemessene Gewebedicke 17.9μm (Abbildung 2), mit einer mittleren Schrumpfung von etwa 65%. Beachten Sie, dass diese Ergebnisse typische Schrumpfung stellen für die Gewebe für die Routine histologischen Präparat 7 verarbeitet. </li><li> Der Standardwert disector Höhe für den typischen Studie ist 10 um. Der Unterschied zwischen den disector Höhe und die gemessene Schichtdicke ist die Dachhöhe, das Volumen des Gewebes, wo keine biologischen Funktionen sind gezählt. Die Verwendung einer Dachhöhe vermeidet Gewebeschäden an der Schneide Oberflächen (zB verloren Caps). </li></ol></li><li> Die Gesamtzahl der Objekte gezählt, Σ Q - <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Zur Vermeidung von Verzerrungen aus Erkennungsfehler, ist es unerlässlich, dass eine einheitliche Definition für die jeweilige biologische Funktion von Interesse verfolgt wird. In diesem Fall waren wir daran interessiert, das Zählen Neuronen. Daher wurde ein Neuron als mit einer sichtbaren zentral gelegenen Nucleolus und ein klar definiertes Zytoplasma, während Gliazellen in der Regel fehlten sichtbare Nukleolen und Zytoplasma definiert. Zu diesem Thema 457 Neuronen wurden gezählt. </li></ol></li></ol> Teil 4: Stereologer - A Computerized Stereology System (Stereology Resource Center, Chester, MD) <ol><li> Die Stereologer-System fordert den Benutzer beim Ausfüllen der notwendigen Informationen in einer Schritt-für-Schritt-Mode. In der &quot;Study Information&quot; die Parameter der Studie sind etabliert. Da ein Verweis Platz für die Studie definiert werden müssen, sollten Sie die Lautstärke-Parameter ausgewählt (für den Bezugsraum der Cavalieri Schätzer sollte so gewählt werden). Object Lautstärke kann auch hier gewählt werden, um die Anzahl-gewichteten Volumen für die Bevölkerung der Objekte von Interesse zu schätzen. Für unser Beispiel wurde nur das Volumen des Referenz-Raum gewählt. Für jedes Objekt, wählen Sie die Anzahl und die Definition der Funktion von Interesse, in diesem Fall Neurons. </li><li> Fall Initialisierung: In diesem Abschnitt werden die Probenahme Informationen nachgewiesen wird. Geben Sie die Platte Abtastintervall (wenn getrennte Platten des Gewebes wurden vollständig und in Scheiben geschnitten auf jeder Seite in Reihenfolge platziert und geben Sie dann 1 hier). Geben Sie die Gesamtzahl der Schnitte durch den Verweis Raum (in diesem Fall 760) übernommen. Geben Sie dann den Abschnitt Abtastintervall (in diesem Fall 59). Das System berechnet dann die Zahl der Sektionen zu beproben (in diesem Fall 13). </li><li> Probe-Parameter: Dieser Abschnitt definiert das Raster und disector Größe. Für das Volumen, verwenden Sie eine geringe Vergrößerung 2.5x-10x auf die Raster unter dem Edit-Menü zu definieren. Object Vergrößerung sollte auf 100x (NA 1,3 oder 1,4) durchgeführt werden. Frame-Bereich ist die Größe des disector, in diesem Fall haben wir 50% Bildschirm. Die Rahmenhöhe beträgt die Dicke der disector; gesetzt bei 10 um hier. Die Spantabstand ist die Größe des Rasters. In unserer Pilotstudie haben wir festgestellt, dass 2500μm Erträge zwischen 150-200 Bilder in einem systematisch-einheitlicher Weise durch eine relativ große Referenz-Raum verteilt. Für kleinere Flächen sollte ein kleineres Rastermaß verwendet werden. Eine Pilotstudie identifiziert die optische Sonde Parameter für jeden einzelnen zu studieren. </li><li> Nach dem Studium Parameter festgelegt wurden, kann die Probenahme durch das Gewebe vor. Das Programm wird Sie auffordern, den ersten Abschnitt Probe. Schritt 1: Das Programm wird der Benutzer aufgefordert, bei schwacher Vergrößerung, um die Referenz-Platz auf dem Abschnitt zu verfolgen. Das System wird dann einen Raster über den Abschnitt über die Sonde Parameter und der Benutzer basieren, werden dann sicher, dass Punkte fallen in den Referenz-Raum. Wenn ein Punkt nicht innerhalb der Referenz-Raum einfach auf den Punkt klicken und werden nicht in das Volumen berechnet werden. Schritt 2: Das System wird ein neues Raster über die Referenz-Raum zu platzieren, basierend auf dem Spantabstand Parameter. Überprüfen Sie, ob die Schnittpunkte fallen in den Referenz-Raum. Schritt 3: Das System wird dann den Benutzer auffordern, auf die höhere Vergrößerung Ziel wechseln und die Bühne zum ersten Dissektor. Schritt 4: An diesem Punkt das System fordert den Benutzer auf die Definition Ober-und Unterseite des Abschnitts dann setzt das System die Probenahme Platz in der z-Achse. Schritt 5: Der Benutzer wird dann auf jedes Objekt, das innerhalb der disector fällt durch die z-Ebene klicken. Objekte, die die roten Linien oder der Unterseite des disector berühren kann nicht gezählt werden. Nachdem jedes Objekt gezählt wird, klicken Sie auf Weiter. Die Bühne wird zum nächsten disector und Schritte 4 und 5 wiederholen bewegen wird. Sobald alle disectors für den Abschnitt wurden gezählt, das System wird der Benutzer aufgefordert, die nächste fortlaufende Abschnitt einfügen, um sondiert werden. Schritte 1-5 werden wiederholt, bis alle die sequentielle Abschnitte werdenabgetastet worden. Das System wird dann die Berechnungen für asf, ssf, TSF und Σ Q. Basierend auf diesen Parametern, erzeugt das System einen geschätzten N, Referenz-Lautstärke und CE ist sowohl für die geschätzte Anzahl und Volumen. Es wird auch Empfehlungen effizienter zu werden oder die CE (Abbildung 2) zu reduzieren. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse: Unvoreingenommene Stereologie bietet effiziente und zuverlässige Schätzungen von Zellpopulationen in einem Referenz-Raum. Es gibt eine Reihe von Computer-based stereologische Systeme zur Verfügung, die alle auf eine systematische Probenahme und eine definierte Referenz-Raum verlassen. Wir haben die BioQuant Life Sciences-System verwendet werden, um die gesamte neuronalen Population der Großhirnrinde von 2-jährigen Meerkatzen Schätzung mehr als 828 Millionen (Abbildung 3) mit einem durchschnittlichen CE von 0,042 werden. Wir haben anschließend die Stereologer System verwendet, um schätzen, dass der Frontallappen für etwa die Hälfte der Zahl der kortikalen Neuronen 8. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 Computer-based Stereology Systems. Das Basis-Set-up des Stereologie Systeme ist der gleiche, ein Mikroskop mit einem motorisierten Stufe (xyz), eine Bühne Controller, Videokamera, Computer und Software. Das System, das letztlich gewählt wird, sollte auf Effizienz, Bedürfnisse und Kosten-Analyse zugrunde liegen. <div style="border:1px #000000 solid"><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Informationen zum Studium </td></tr><tr><td> Study Namen </td><td> Frontal Cortex </td></tr><tr><td> Principal Investigator </td><td> MB </td></tr><tr><td> Spezies </td><td> AG </td></tr><tr><td> Reference Raum Frontal </td><td> Kortex </td></tr><tr><td colspan="2"> Hinweise </td></tr><tr><td colspan="2"> CASE INFORMATION </td></tr><tr><td> Data Collector </td><td> MB </td></tr><tr><td> Datum </td><td> Mittwoch, 30 April, 2008 </td></tr><tr><td> Gruppe </td><td> Kontrolle </td></tr><tr><td> Thema </td><td> O26 </td></tr><tr><td colspan="2"> Hinweise </td></tr><tr><td colspan="2"> Abtasteigenschaften </td></tr><tr><td> Slab Sampling Interval </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Gesamtzahl der Sektionen </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Section Sampling Interval </td><td> 59 </td></tr><tr><td> Ab Section </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="2"> FRAKTIONEN </td></tr><tr><td> ASF </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td> SlabSF </td><td> 1,0000 </td></tr><tr><td> SSF </td><td> 0,0169 </td></tr><tr><td> TSF </td><td> 0,5587 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="6"> ERGEBNISSE Zusammenfassung </td></tr><tr><td> Parameter </td><td> Sonde </td><td> Name </td><td> Ergebnis </td><td> CE </td><td> SD </td></tr><tr><td> Dicke </td><td> --- </td><td> --- </td><td> 17,8996 μ </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> Anzahl </td><td> Disector </td><td> Neuron </td><td> 243833769.1473 </td><td> 0,0474 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Volumen </td><td> Cavalieri Punktraster </td><td> Volumen </td><td> 1719769397954.1284 μ ^ 3 </td><td> 0,0078 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> EMPFEHLUNGEN </td></tr><tr><td> Sonde </td><td> Objekt-Nummer (Neuron) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0474 </td></tr><tr><td> Empfehlungen </td><td> CE ist akzeptabel. </td></tr></tbody></table&gt; <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Anzahl der Disectors gesehen zu hoch ist, erhöhen Disector Abstand. </td></tr><tr><td> Sonde </td><td> Region Volume (Lautstärke) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0078 </td></tr><tr><td> Empfehlungen </td><td> CE ist akzeptabel. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> ABSCHNITT ERGEBNISSE </td></tr><tr><td> Abschnitt </td><td> Neuron NumObjects Neuron NumCorners </td><td> Volumen RegPoints </td></tr><tr><td> 1. 40 </td><td> 48 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> 2. 26 </td><td> 52 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 3. 29 </td><td> 56 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> 4. 39 </td><td> 100 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 5. 49 </td><td> 112 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 6. 53 </td><td> 156 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 7. 65 </td><td> 128 </td><td> 106 </td></tr><tr><td> 8. 45 </td><td> 108 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 9. 52 </td><td> 100 </td><td> 77 </td></tr><tr><td> 10. 26 </td><td> 64 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 11. 21 </td><td> 44 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 12. 11 </td><td> 36 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> 13. 1 </td><td> 12 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table></div> Abbildung 2 Ergebnisse der Fontal Lobe den Stereologer System erhalten. Für den Stirnlappen, der längste Teil des stereologische Prozess in die systematische Entnahme und Schneiden war. Topographie, Volumen und neuronalen Schätzung wurden in etwa einen Tag für jedes Fach abgeschlossen. Die linke Hemisphäre war abgetastet und die Zahl wird in den Text, um ungefähre Schätzung für beide Hemisphären verdoppelt. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3 Cortex neuronalen Population Estimate mit BioQuant erhalten. Die BioQuant System erfordert eine genaue Topographie vor Zellzählung. Hier durchschnittlich 13 Schnitte wurden beprobt. Kortikale Topographie und die anschließende Volumen Schätzung nahm zwischen 15-20 Stunden für jedes Fach. Topographie wurde unter einem 2.5x Ziel durchgeführt und Zählung erfolgte unter Verwendung eines 100x Ölimmersionsobjektiv (NA 1,3). Jeder 100. Abschnitt wurde in der linken Hemisphäre mit durchschnittlich 180 disectors abgetastet gewählt. Nach der Topographie wurde abgeschlossen neuronalen Zählung dauerte etwa einen Tag. Die linke Hemisphäre war abgetastet und die Zahl wird in den Text, um ungefähre Schätzung für beide Hemisphären verdoppelt.

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	<li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li><li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+cut+it:+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods.">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practices of Unbiased Stereology. , (2002).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space.">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+banking:+Making+the+most+of+your+research.">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP/PS1:+Neuroimaging,+Stereology,+And+Biochemistry.">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li><li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure.">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li><li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain.">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li></ol>

Unvoreingenommene Stereologie in einem Primaten Gehirn ist ähnlich wie bei anderen biologischen Proben. Doch angesichts der Größe des Primatengehirn, ist eine sorgfältige Verarbeitung Plan empfohlen, da eine einzelne Hemisphäre des grünen Meerkatze liefert mehr als 1200 Teile, wenn sie bei 50 um in Scheiben geschnitten. Zunächst empfehlen wir stereotaxically blockiert das Gehirn in 1 cm-Blöcke, die eine Standard-Schnittfläche zwischen den Blöcken und Themen bietet, minimiert Teilstrecken zwischen den Blöcken ...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereologer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stereology Resource Center (Chester, MD)</td>
<td>www.disector.com</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereology Tool-Kit Stereologer system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>StereoInvestigator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroBright Field (Willston, VT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain

Die nicht-menschlichen Primaten ist ein wichtiger translationale Arten für das Verständnis der normalen Funktion und Krankheit Prozesse des menschlichen Gehirns. Unvoreingenommene Stereologie, die Methode als state-of-the-art für die Quantifizierung von biologischen Objekten in Gewebeschnitten akzeptiert<sup&gt; 2</sup&gt; Erzeugt zuverlässige Strukturdaten für biologische Funktionen im Gehirn von Säugetieren<sup&gt; 3</sup&gt;. Die wichtigsten Komponenten des Ansatzes sind unvoreingenommene (systematisch-Random) Probenahme von anatomisch definierten Strukturen (Referenz Leerzeichen) Quantifizierung der Zellzahl und Größe, Faser-und Kapillar-Längen, Flächen, Volumen und regionalen räumlichen Verteilungen von biologischen Objekten innerhalb der kombinierten Referenzraum<sup&gt; 4</sup&gt;. Zu den Vorteilen dieser stereologische Ansätze im Vergleich zu früheren Methoden ist die Vermeidung aller bekannten Quellen von systematischen (nicht-zufällige) Fehler, die sich aus falschen Annahmen und nicht überprüfbare Modelle. Diese Studie dokumentiert eine biologische Anwendung von computergestützten Stereologie zur gesamten neuronalen Population im frontalen Kortex der grünen Meerkatze Gehirn Schätzung (<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;) Mit Hilfe von zwei kommerziell erhältlichen Stereologie Programme, BioQuant Life Sciences und Stereologer (Abbildung 1). Darüber hinaus, um den Kontrast und Vergleich der Ergebnisse aus beiden BioQuant und<em&gt; Stereologer</em&gt; Systeme, liefert diese Studie ein detailliertes Protokoll für die<em&gt; Stereologer</em&gt; System.

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Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

Die anatomische Organisation des Primas Gehirn kann wichtige Einblicke in normalen und pathologischen Bedingungen beim Menschen liefern. Unvoreingenommene Stereologie ist eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung der insgesamt Neuron-Nummer (oder anderen Zelltyp) in einem bestimmten Bezugsraum<sup&gt; 1</sup&gt;.

Zu wissen, was zählt: Unbiased Stereology in der nicht-menschlichen Primaten Gehirn

The non-human primate is an important translational species for understanding the normal function and disease processes of the human brain. Unbiased ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.7K Aufrufe.  University of Montreal. Die anatomische Organisation des Primas Gehirn kann wichtige Einblicke in normalen und pathologischen Bedingungen beim Menschen liefern. Unvoreingenommene Stereologie ist eine Methode zur genauen und effizienten Schätzung der insgesamt Neuron-Nummer (oder anderen Zelltyp) in einem bestimmten Bezugsraum 1.

Serie: Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Anwendung von Licht-gehärteten Dental Adhesive Resin für Montage-Elektroden oder Mikrodialysesonden in Chronic Experimente

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Forschung

Biologie

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

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Micro-Dissektion Rattenhirns RNA oder Protein Extraction von bestimmten Hirnregion

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Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Single Cell Elektroporation in vivo innerhalb der intakten sich entwickelnde Gehirn

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In addition, the use of non-human primates has recently afforded the opportunity to naturally model complex psychiatric disorders such as alcohol abuse7. Here we describe a technique for blocking the brain in the coronal plane of the vervet monkey (Chlorocebus aethiops sabeus) in the intact skull in stereotaxic space. The method described here provides a standard plane of section between blocks and subjects and minimizes partial sections between blocks. Sectioning a block of tissue in the coronal plane also facilitates the delineation of an area of interest. This method provides manageable sized blocks since a single hemisphere of the vervet monkey yields more than 1200 sections when slicing at 50&mu;m. Furthermore by blocking the brain into 1cm blocks, it facilitates penetration of sucrose for cyroprotection and allows the block to be sliced on a standard cryostat.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of the normal processing of the brain. The anatomical organization of the primate brain can provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

Grundlagen zur nicht-menschlichen Primaten Brain in stereotaktischen Raum

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

The visual system in humans is considered the gateway to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive processes. It is therefore not surprising that quality of vision is tied to quality of life . Despite widespread clinical and basic research surrounding the causes of visual disorders, many forms of visual impairments, such as retinitis pigmentosa and macular degeneration, lack effective treatments. Non-human primates have the closest general features of eye development to that of humans. Not only do they have a similar vascular anatomy, but amongst other mammals, primates have the unique characteristic of having a region in the temporal retina specialized for high visual acuity, the fovea1. Here we describe a general technique for dissecting the primate retina to provide tissue for retinal histology, immunohistochemistry, laser capture microdissection, as well as light and electron microscopy. With the extended use of the non-human primate as a translational model, our hope is that improved understanding of the retina will provide insights into effective approaches towards attenuating or reversing the negative impact of visual disorders on the quality of life of affected individuals.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of development and aging. The anatomical organization of the primate retina may provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

Das Tor zum Gehirn: Die Biologie des Primas Eye

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Bestimmung der Säugetier-Zellzahlen, Größe der Zellen und Zell Gesundheit Mit dem Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

Kartierung der Nachwirkungen der Theta Burst Stimulation auf das menschliche Gehör Cortex mit Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Physiology Lab Demonstration: glomeruläre Filtrationsrate in einem Ratten-

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Blutprobenentnahme aus der laterale Schwanzvene der Ratte

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...