Os autores gostariam de agradecer Ikiel Ptito por seu contínuo apoio técnico. NSERC conceder ao MP.

Parte 1: Pré-processamento de tecido deve ser feito de acordo com Burke et al. (2009) 5. <ol><li> Resumidamente, o tecido deve ser bem perfundidos com paraformaldeído, glutaraldeído ou formalina. Isto pode ser conseguido através de perfusão transcardial padrão normalmente utilizado para a colheita de outros órgãos. No presente estudo o assunto estava profundamente sedado com cloridrato de cetamina (10 mg / kg, im), sacrificados com uma overdose de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) e perfundidos transcardially com 0,1 M PBS até que esteja completamente sangrar. Isso é seguido por uma solução de paraformaldeído 4% em PBS por 5 min (~ 1 litro). Tecido deve ser bem perfundidos com paraformaldeyhde, gluteraldehyde, ou formol. O cérebro deve ser stereotaxically bloqueado, retirados do crânio, pesados, determinado volume, cryoprotected, e congelados 5. </li></ol> Parte 2: amostragem sistemática de tecido, de acordo com Burke et al. (2009) 6. <ol><li> Neste exemplo, focada no lobo frontal do cérebro vervet. O espaço de referência foi definido para incluir tecido cortical do sulco central do pólo frontal do hemisfério esquerdo. Para os nossos propósitos da série foram fixados em 1 / 10 seções em todo o córtex, seccionados a 50 ìm. Uma série completa foi manchada com violeta cresil (série # 1). Série 2 foi dividido de modo que metade dos cortes foram corados com o cloreto de ouro para mielina revelação e manchado outra metade para esterase acetilcolina (para a delimitação de certas áreas subcortical). Todas as outras séries foram bancados em preservar o antígeno como parte de nossos planos de investigação a longo prazo. </li></ol> Parte 3: Estereologia (para mais detalhes, veja Mouton 2002) 4 <ol><li> A estimativa total de número de células (N) é calculado com base na seguinte equação: N = ssf -1 x -1 x asf tsf -1 x Σ Q - Ssf onde é a fração de amostragem seção, asf é a fração de amostragem área, tsf se a fração de amostragem espessura (onde a espessura medida do tecido é dividido pela altura dissector), e Σ Q - é o número total de objetos de interesse contados dentro do dissector. As próximas seções deste protocolo mostrar como determinar a ssf, asf, tsf e Σ Q. </li><li> Fração seção de amostragem (computador não-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> O espaço de referência inteiro deve ser bem definida no sentido antero-posterior e dorsal para ventral. Neste exemplo, estavam interessados ​​no lobo frontal ea definiu como a região da ponta do pólo frontal (anterior) ao sulco central (posterior) eo sulco lateral (ventral) e excluiu a ínsula. </li><li> Para o lobo frontal deste assunto em particular um total de 760 seções foram sistematicamente coletados com 76 manchada por violeta cresil. Uma vez que o alvo era de 10 seções em todo o espaço de referência 06/01 seções violeta cresil manchadas foram amostradas, levando a uma fração amostral Seção de cerca de 1 / 60. Aleatoriamente começou com um dos primeiros seis cortes corados cresil violeta e sistematicamente amostrados 1 / 6 depois. Um total de 13 seções foram amostradas para o tema selecionado (Figura 2). </li></ol></li><li> Fração de área da amostra (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Um estudo piloto vai indicar o tamanho da grade ideal, a fração de amostragem de Área, a amostra do espaço de referência com cerca de 100-300 disectors. No lobo frontal, um tamanho de grade de 2500 mM dois renderam uma média de 254 disectors para este assunto (Figura 2). O tamanho da disector deve render entre cerca de 0-5 objetos contados, neste caso, os neurônios. </li></ol></li><li> Fração da espessura da amostra (computer-based) <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Em cada local disector, a altura do tecido é medida, e uma fração desta altura é amostrado, o que é conhecido como a fração de amostragem de espessura. Para determinar a espessura medida, o foco através do z-plano até que a primeira célula entra em foco, em seguida, volta-se ligeiramente para o topo da seção, ou seja, até o último objeto aparece logo fora de foco. Para determinar o fundo do tecido, o foco através do z-plano até que as células são pouco fora de foco. </li><li> Focando através do z-plano, as células devem ser coradas em cada profundidade, se não, isso pode indicar uma penetração incompleta da desidratação mancha ou não-uniforme do tecido, caso em que as seções devem ser re-marcados. Esta precaução é especialmente importante para o tecido imunocoradas que requer penetração de immunoprobes através de seções de tecido relativamente grossa. Por esta razão, o tecido deve ser leve imunocoradas contracorados com uma mancha basofílico (violeta, por exemplo, cresil, hemahematoxilina), a fim de determinar com precisão superior e inferior da seção e para confirmar a penetração do anticorpo. Neste estudo, os cortes foram cortados em um micrótomo configuração de 50 ìm. Após todo o processamento de tecidos estava completa, a espessura do tecido medido em média 17.9μm (Figura 2), com uma retração média de cerca de 65%. Note-se que estes resultados representam o encolhimento do tecido típico para processadas para preparação histológica de rotina 7. </li><li> A altura disector padrão para o estudo típico é 10μm. A diferença entre a altura ea espessura disector seção medida é a altura de guarda, o volume de tecido onde não características biológicas são contados. O uso de uma altura de guarda evita dano tecidual nas superfícies de corte (por exemplo, perdeu caps). </li></ol></li><li> O número total de objetos contados, Σ Q - <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Para evitar viés de erros de reconhecimento, é imperativo que uma definição padrão é seguido para o recurso especial de interesse biológico. Neste caso, estávamos interessados ​​em contar os neurônios. Portanto, um neurônio foi definido como tendo um nucléolo visível uma localização central e um citoplasma bem definido, enquanto que as células da glia, geralmente faltava nucléolos visíveis e citoplasma. Para este assunto 457 neurônios foram contados. </li></ol></li></ol> Parte 4: Stereologer - Um Sistema de Estereologia computadorizada (Estereologia Resource Center, Chester, MD) <ol><li> O Sistema Stereologer pede ao utilizador para preencher as informações necessárias de forma passo-a-passo. No &quot;Estudo seção&quot; Informações sobre os parâmetros do estudo são estabelecidas. Desde um espaço de referência deve ser definido para o estudo, o parâmetro de volume deve ser selecionado (para o espaço de referência do estimador Cavalieri deve ser selecionado). Volume de objeto também pode ser selecionado aqui para estimar o número ponderado de volume para a população de objetos de interesse. Para o nosso exemplo, apenas o volume do espaço de referência foi selecionado. Para cada objeto, selecione o número e definir a característica de interesse, neste caso neurônios. </li><li> Inicialização caso: Nesta seção as informações de amostragem é estabelecido. Digite o intervalo de amostragem de placas (lajes se separar de tecido foram cortados de forma exaustiva e cada seção é colocado na ordem seqüencial em seguida, digite um aqui). Digite o número total de seções tomadas através do espaço de referência (neste caso 760). Em seguida, insira o intervalo de amostragem seção (neste caso 59). O sistema calcula o número de seções devem ser amostrados (neste caso 13). </li><li> Parâmetros da sonda: Esta seção define a grade e tamanho disector. Para o volume, use uma baixa ampliação 2.5x-10x para definir o espaçamento da grade, no menu de edição. Ampliação de objeto deve ser realizada em 100x (NA 1.3 ou 1.4). Área do quadro é o tamanho do disector, neste caso usamos 50% da tela. A altura do quadro é a espessura do disector; fixado em 10μm aqui. O espaçamento é o tamanho da grade. Em nosso estudo piloto verificou-se que 2500μm rendimentos entre 150-200 frames espaçados de forma sistemática uniforme através de um espaço de referência relativamente grande. Para áreas menores, um tamanho menor da grade deve ser usada. Um estudo piloto irá identificar os parâmetros de sensor óptico para cada estudo particular. </li><li> Uma vez que os parâmetros do estudo foram estabelecidos, a amostragem através do tecido pode prosseguir. O programa irá solicitar que você experimentar a primeira seção. Passo 1: O programa irá solicitar ao usuário, em pequeno aumento, para traçar o espaço de referência na seção. O sistema em seguida, coloque uma grade sobre a seção com base nos parâmetros da sonda eo usuário irá então verificar que aponta queda no espaço de referência. Se um ponto não está dentro do espaço de referência basta clicar sobre o ponto e não será calculado para o volume. Passo 2: O sistema irá colocar uma nova grade sobre o espaço de referência, com base nos parâmetros espaçamento. Verifique se as interseções se inserem no espaço de referência. Passo 3: O sistema irá solicitar que o usuário alterne para o objetivo maior ampliação e mover o palco para o primeiro dissector. Etapa 4: Neste ponto, o sistema avisa o usuário para definir o superior e inferior da seção, em seguida, o sistema define o espaço de amostragem no eixo z Passo 5:. O usuário clique em cada objeto que cai dentro do disector através do z-plano. Objetos que tocam as linhas vermelhas ou a parte inferior da disector não podem ser contabilizadas. Uma vez que cada objeto é contado, clique em Avançar. O estágio irá se mover para a próxima disector e os passos 4 e 5 serão repetidos. Depois de todos os disectors para a seção foram contabilizados, o sistema irá solicitar que o usuário insira a próxima seção seqüencial a ser sondado. Passos 1-5 será repetido até que todas as seções seqüenciais têmforam amostrados. O sistema irá fornecer os cálculos para asf, ssf, tsf, e Q Σ. Com base nesses parâmetros, o sistema irá gerar um N estimada, volume de referência e CE para tanto o número estimado e volume. Ele também lhe dará recomendações para se tornar mais eficientes ou para reduzir a CE (Figura 2). </li></ol> Parte 5: Resultados Representante: Estereologia imparcial fornece estimativas eficiente e confiável de populações de células dentro de um espaço de referência. Há um número de sistemas baseados em computadores estereológica disponíveis, todos que dependem de amostragem sistemática e um espaço de referência definido. Nós temos usado o sistema de BIOQUANT Vida Ciências para estimar o total da população neuronal do córtex cerebral de 2 anos de idade vervet em mais de 828 milhões (Figura 3) com uma média de 0,042 CE. Temos posteriormente utilizado o sistema Stereologer estimar que as contas do lobo frontal por cerca de metade do número de neurônios corticais 8. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1 Computador sistemas baseados em Estereologia. O set-up básico dos sistemas de estereologia é o mesmo, um microscópio com um palco motorizado (xyz), um controlador de palco, câmara de vídeo, computador e software. O sistema que é em última análise, devem ser escolhidos com base na eficiência, necessidades e análise de custos. <div style="border:1px #000000 solid"><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> INFORMAÇÃO ESTUDO </td></tr><tr><td> Nome estudo </td><td> Frontal Cortex </td></tr><tr><td> Investigador Principal </td><td> MB </td></tr><tr><td> Espécies </td><td> AG </td></tr><tr><td> Espaço de referência Frontal </td><td> Córtex </td></tr><tr><td colspan="2"> Notas </td></tr><tr><td colspan="2"> Informações sobre o caso </td></tr><tr><td> Coletor de Dados </td><td> MB </td></tr><tr><td> Data </td><td> Quarta-feira, 30 de abril, 2008 </td></tr><tr><td> Grupo </td><td> Controle </td></tr><tr><td> Assunto </td><td> O26 </td></tr><tr><td colspan="2"> Notas </td></tr><tr><td colspan="2"> CARACTERÍSTICAS DE AMOSTRAGEM </td></tr><tr><td> Intervalo de amostragem laje </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Número total de seções </td><td> 760 </td></tr><tr><td> Intervalo de amostragem seção </td><td> 59 </td></tr><tr><td> Seção de partida </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="2"> FRAÇÕES </td></tr><tr><td> ASF </td><td> 0,0002 </td></tr><tr><td> SlabSF </td><td> 1,0000 </td></tr><tr><td> SSF </td><td> 0,0169 </td></tr><tr><td> TSF </td><td> 0,5587 </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="6"> RESUMO RESULTADOS </td></tr><tr><td> Parâmetro </td><td> Sondar </td><td> Nome </td><td> Resultado </td><td> CE </td><td> SD </td></tr><tr><td> Espessura </td><td> --- </td><td> --- </td><td> 17,8996 μ </td><td> --- </td><td> --- </td></tr><tr><td> Número </td><td> Disector </td><td> neurônio </td><td> 243833769.1473 </td><td> 0,0474 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Volume </td><td> Cavalieri ponto da grade </td><td> volume </td><td> 1719769397954.1284 μ ^ 3 </td><td> 0,0078 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> RECOMENDAÇÕES </td></tr><tr><td> Sondar </td><td> Número objeto (neurônio) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0474 </td></tr><tr><td> Recomendações </td><td> CE é aceitável. </td></tr></tbody></table&gt; <table border="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Número de Disectors Vista é muito alto, aumentar o espaçamento disector. </td></tr><tr><td> Sondar </td><td> Volume região (volume) </td></tr><tr><td> CE </td><td> 0,0078 </td></tr><tr><td> Recomendações </td><td> CE é aceitável. </td></tr></tbody></table><table border="0"><tbody><tr><td colspan="3"> RESULTADOS SEÇÃO </td></tr><tr><td> Seção </td><td> neurônio NumObjects neurônio NumCorners </td><td> RegPoints volume de </td></tr><tr><td> 1. 40 </td><td> 48 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> 2. 26 </td><td> 52 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 3. 29 </td><td> 56 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> 4. 39 </td><td> 100 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 5. 49 </td><td> 112 </td><td> 83 </td></tr><tr><td> 6. 53 </td><td> 156 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> 7. 65 </td><td> 128 </td><td> 106 </td></tr><tr><td> 8. 45 </td><td> 108 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 9. 52 </td><td> 100 </td><td> 77 </td></tr><tr><td> 10. 26 </td><td> 64 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> 11. 21 </td><td> 44 </td><td> 44 </td></tr><tr><td> 12. 11 </td><td> 36 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> 13. 1 </td><td> 12 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table></div> Figura 2 Os resultados do Lobe fontal obtidas com o sistema Stereologer. Para o lobo frontal, a maior parte do processo de estereológica foi na amostragem sistemática e de corte. Estimar o volume, topografia e neuronal foram concluídas em cerca de um dia para cada assunto. O hemisfério esquerdo foi amostrado eo número é o dobro no texto para uma estimativa aproximada para ambos os hemisférios. <img src="/files/ftp_upload/1262/1262fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3 Cortex Estimativa da População Neuronal Obtidos com BIOQUANT. BIOQUANT O sistema requer uma topografia exata antes da contagem das células. Aqui uma média de 13 cortes foram amostrados. Topografia cortical e estimativa de volume subseqüente levou entre 15-20 horas para cada disciplina. Topografia foi realizada sob um objetivo 2.5x e contando foi feito usando uma objetiva de imersão 100x óleo (NA 1.3). Cada seção 100 foi escolhido por todo o hemisfério esquerdo, com uma média de 180 disectors amostrados. Uma vez que a topografia foi concluída a contagem neuronal demorou cerca de um dia. O hemisfério esquerdo foi amostrado eo número é o dobro no texto para uma estimativa aproximada para ambos os hemisférios.

<ol>
	<li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Aat Rec. 231, 482-497 (1991).</li><li>Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Any+way+you+cut+it:+a+new+journal+policy+for+the+use+of+unbiased+counting+methods.">Any way you cut it: a new journal policy for the use of unbiased counting methods.</a> J Comp Neurol. 364, 5-5 (1996).</li><li>Sterio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unbiased+estimation+of+number+and+sizes+of+arbitrary+particles+using+the+disector.">The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector.</a> J Microsc. 134, 127-136 (1984).</li><li>Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles and Practices of Unbiased Stereology. , (2002).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+non-human+primate+brain+in+stereotaxic+space.">Dissecting the non-human primate brain in stereotaxic space.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+banking:+Making+the+most+of+your+research.">Brain banking: Making the most of your research.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li><li>Manaye, K. F., Wang, P., O'Neil, J., Huafu, S., Tizabi, Y., Thompson, N., Ottinger, M. A., Ingram, D. K., Mouton, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+Quantification+Of+Dtg+APP/PS1:+Neuroimaging,+Stereology,+And+Biochemistry.">Neuropathological Quantification Of Dtg APP/PS1: Neuroimaging, Stereology, And Biochemistry.</a> AGE. 29, 87-96 (2009).</li><li>Burke, M. W., Palmour, R. M., Ervin, F. R., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+reduction+in+frontal+cortex+of+primates+after+prenatal+alcohol+exposure.">Neuronal reduction in frontal cortex of primates after prenatal alcohol exposure.</a> Neuroreport. 20, 13-17 (2009).</li><li>Zangenehpour, S., Burke, M. W., Chaudhuri, A., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batch+immunostaining+for+large-scale+protein+detection+in+the+whole+monkey+brain.">Batch immunostaining for large-scale protein detection in the whole monkey brain.</a> J Vis Exp. 29, (2009).</li></ol>

Estereologia imparcial em um cérebro de primatas é semelhante ao de outras amostras biológicas. No entanto, dado o tamanho do cérebro dos primatas, um plano de tratamento cuidadoso é recomendado desde um único hemisfério do macaco vervet produz mais de 1.200 seções quando cortado em 50 micra. Em primeiro lugar recomendamos stereotaxically bloqueando o cérebro em blocos de um centímetro, que fornece um plano padrão de seção entre os blocos e assuntos, minimiza seções parcial entre blocos, e fornece blocos...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Stereologer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stereology Resource Center (Chester, MD)</td>
<td>www.disector.com</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereology Tool-Kit Stereologer system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioQuant Life Sciences (Nashville, TN)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>StereoInvestigator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MicroBright Field (Willston, VT)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain

O primata não-humano é uma importante espécie de translação para a compreensão dos processos normais de funcionamento e as doenças do cérebro humano. Estereologia imparciais, o método aceito como o estado-da-arte para a quantificação de objetos biológicos em cortes de tecido<sup&gt; 2</sup&gt;, Gera dados confiáveis ​​estruturais para os recursos biológicos no cérebro de mamíferos<sup&gt; 3</sup&gt;. Os componentes-chave da abordagem são imparciais (aleatória sistemática) de amostragem de estruturas anatomicamente definidos (espaços de referência), combinado com a quantificação de números de celular e comprimentos de fibra tamanho e capilar, superfícies, volumes regionais e distribuição espacial de objetos biológicos dentro do espaço de referência<sup&gt; 4</sup&gt;. Entre as vantagens dessas abordagens sobre os métodos estereológicos anterior é a prevenção de todas as fontes conhecidas de erro sistemático (não aleatória) decorrentes de pressupostos errôneos e não verificáveis ​​modelos. Este estudo documenta uma aplicação biológica de estereologia computadorizado para estimar o total da população neuronal no córtex frontal do cérebro do macaco vervet (<em&gt; Chlorocebus aethiops sabeus</em&gt;), Com a ajuda de dois programas estereologia comercialmente disponíveis, Ciências da Vida e BIOQUANT Stereologer (Figura 1). Além de contraste e comparação dos resultados de ambos os BIOQUANT e<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistemas, este estudo fornece um protocolo detalhado para o<em&gt; Stereologer</em&gt; Sistema.

Watch this Scientific Journal Video about Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain at JoVE.com

Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

A organização anatômica do cérebro dos primatas podem fornecer importantes insights sobre condições normais e patológicas nos seres humanos. Estereologia imparcial é um método para estimar com precisão e eficiência o número de neurônios total (ou outro tipo de célula) em um espaço de referência dado<sup&gt; 1</sup&gt;.

Sabendo o que conta: Estereologia Imparcial no cérebro de primatas não humanos

The non-human primate is an important translational species for understanding the normal function and disease processes of the human brain. Unbiased ...

knowing-what-counts-unbiased-stereology-in-the-non-human-primate-brain

Research

JoVE Journal

Biology

13.7K visualizações.  University of Montreal. A organização anatômica do cérebro dos primatas podem fornecer importantes insights sobre condições normais e patológicas nos seres humanos. Estereologia imparcial é um método para estimar com precisão e eficiência o número de neurônios total (ou outro tipo de célula) em um espaço de referência dado 1.

Vídeo: Knowing What Counts: Unbiased Stereology in the Non-human Primate Brain

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

Aplicação de Light-resina adesivo dental para Eletrodos de montagem ou Sondas microdiálise em Experimentos crônica

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Biologia

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissecção de cérebro de um rato para RNA ou Extração de Proteína da região específica do cérebro

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Eletroporação única célula in vivo dentro do cérebro intacto desenvolvimento

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In addition, the use of non-human primates has recently afforded the opportunity to naturally model complex psychiatric disorders such as alcohol abuse7. Here we describe a technique for blocking the brain in the coronal plane of the vervet monkey (Chlorocebus aethiops sabeus) in the intact skull in stereotaxic space. The method described here provides a standard plane of section between blocks and subjects and minimizes partial sections between blocks. Sectioning a block of tissue in the coronal plane also facilitates the delineation of an area of interest. This method provides manageable sized blocks since a single hemisphere of the vervet monkey yields more than 1200 sections when slicing at 50&mu;m. Furthermore by blocking the brain into 1cm blocks, it facilitates penetration of sucrose for cyroprotection and allows the block to be sliced on a standard cryostat.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of the normal processing of the brain. The anatomical organization of the primate brain can provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

Dissecando o cérebro do primata não-humano no espaço estereotáxico

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

The visual system in humans is considered the gateway to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive processes. It is therefore not surprising that quality of vision is tied to quality of life . Despite widespread clinical and basic research surrounding the causes of visual disorders, many forms of visual impairments, such as retinitis pigmentosa and macular degeneration, lack effective treatments. Non-human primates have the closest general features of eye development to that of humans. Not only do they have a similar vascular anatomy, but amongst other mammals, primates have the unique characteristic of having a region in the temporal retina specialized for high visual acuity, the fovea1. Here we describe a general technique for dissecting the primate retina to provide tissue for retinal histology, immunohistochemistry, laser capture microdissection, as well as light and electron microscopy. With the extended use of the non-human primate as a translational model, our hope is that improved understanding of the retina will provide insights into effective approaches towards attenuating or reversing the negative impact of visual disorders on the quality of life of affected individuals.

The non-human primate is an important translational species for our understanding of development and aging. The anatomical organization of the primate retina may provide important insights into normal and pathological conditions in humans.

A entrada para o cérebro: Dissecando o olho Primaz

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purificação do M. magneticum Strain AMB-1 proteína associada Magnetosome MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Determination of Mammalian Cell Counts, Cell Size and Cell Health Using the Moxi Z Mini Automated Cell Counter

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques6.
Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.
The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.
Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

The Moxi Z miniature automated cell counter is a novel instrument that combines the Coulter Principle with patented thin-film sensor technology and a proprietary software algorithm to perform sizing and counting of a broad size range of particles as well as to determine the overall health of monodisperse mammalian cell cultures. This protocol describes the use of this instrument for counting and assessing the health of cell cultures.

Determinação da contagem de células de mamíferos, tamanho de célula e Saúde célula usando o Moxi Z Mini contador de células automatizado

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls1-5. A ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

Mapear as sequelas de Theta Explosão Estimulação no córtex auditivo humano com Imagem Funcional

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Laboratório de Fisiologia Demonstração: Taxa de filtração glomerular em um Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

A amostragem de sangue a partir da veia lateral da cauda do rato

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...