多くの遺伝子治療および神経科学的研究は、非ヒト霊長類の脳へのAAVベクターの注射を含む。これらの研究が成功するためには、注射技術が信頼できるものでなければなりません。当社の注入技術は瞬時に正確です。
この手順は、麻酔をかけた動物や覚醒している動物への注射に適しています。私たちの自家製カニューレは取り扱いが簡単で低コストです。手順を実演するのは、私の研究室のエンジニアリング技術者であるケビン・メイです。
はじめに、ディスクグラインダーで30ゲージの13ミリメートル皮下注射針の先端を鈍らせます。次に、ステンレス鋼管をターゲット脳領域の深さに応じた長さに切断します。ディスクグラインダーを使用して、カットチューブの一方の端を面取りし、もう一方の端を滑らかにします。
ブローチでチューブの内側をバリ取りします。次に、PTFEチューブを、ロードするベクター溶液の量に適した長さに切断します。鈍い皮下注射針を挿入してチューブの両端をフレアします。
鈍い皮下注射針をPTFEチューブの一方の端に約5ミリメートル挿入します。次に、ステンレス鋼管の面取りされていない端をもう一方の端に約5ミリメートル挿入します。皮下注射針ハブからろ過水を注入してカニューレをテストします。
面取りされたステンレス鋼管の先端から水がスムーズに出ていること、およびどちらの接合部からも水が漏れていないことを確認します。カニューレをテストした後、オートクレーブバッグに入れ、オートクレーブ滅菌します。ベクター溶液をP-20ピペッターで滅菌したPCRチューブに静かに移し、気泡の形成を防ぎます。
次に、斜めの先端を下に向けてカニューレを垂直方向の定位固定装置ホルダーに取り付けます。次に、1ミリリットルのルアーロックシリンジをカニューレの皮下注射針ハブに接続します。面取りされた先端をベクトル溶液に浸します。
次に、1ミリリットルのシリンジで穏やかな負圧を加え、溶液と空気の間のメニスカスを視覚的に追跡しながら、溶液をカニューレに入れます。ベクター溶液がロードされたら、溶液がニードルハブに到達するまで穏やかな負圧を続けます。次に、1ミリリットルの注射器を取り外し、気泡が入らないように注意しながら、皮下注射針ハブの内壁に沿って着色された鉱物油をゆっくりと注入します。
皮下注射針ハブを、3方向ルアーロック活栓の2つの開いているポートの1つに取り付けます。次に、ポートを閉じます。1ミリリットルのシリンジに空気を入れ、他の2つのポートのいずれかに取り付けます。
最後に、活栓の残りのポートを閉じて、シリンジをカニューレに接続します。シリンジを取り付けると、空気が活栓に押し込まれ、この空気を空いているポートにシャントすると、ベクター溶液がカニューレに押し戻されるのを防ぎます。シリンジからカニューレにゆっくりと空気を押し込みます。
PTFEチューブの鈍い針の先端に着色油が現れたら、溶液と着色油の間の空気を確認します。ベベルカニューレの先端にベクター溶液の滴が見えるまで、陽圧をかけ続けます。次に、活栓を閉じて、ベクトルが重力によってカニューレから出ないようにします。
ベクター溶液がロードされたら、カニューレを定位固定装置マニピュレーターに貼り付けます。次に、活栓を電動エアポンプに接続するには、非滅菌アシスタントからポンプチューブを取り出します。滅菌スリーブの壁を通してルアーロックコネクタをつかみます。
スリーブの襟を落とし、重力によってチューブに沿って伸びるようにします。次に、活栓を固定し、スリーブをルアーロックコネクタにしっかりとテープで固定します。次に、エアポンプを低圧に設定してエアポンプとカニューレをテストしてから、オイルがカニューレを通って進み、カニューレの先端にベクター溶液の滴が見えるまで、エアポンプをオンにして圧力を上げます。
プラスチック定規をPTFEチューブにテープで固定して、射出中のメニスカスの動きを測定します。次に、先端が表面に達するまで脳定位固定マニピュレーターでカニューレを押し下げ、深さを記録します。カニューレを最も深い部位まで運転し、トラックに沿って注入します。
接触すると表面がくぼみます。組織の圧迫によるミスターゲティングを最小限に抑えるには、カニューレを押し下げ、最も深い注射部位を500マイクロメートルオーバーシュートします。その後、ゆっくりと引っ込めます。
他の選択肢は、カニューレをゆっくりと下げるか、すばやく運転して底で1〜5分間待つことです。カニューレが最も深い注入部位に配置されたら、電動エアポンプを使用して、0.5マイクロリットルのベクター溶液を10〜30秒間注入します。PTFEチューブ内の着色油とベクター溶液の間のメニスカスを追跡して、注入の流れを確認します。
1分間待った後、カニューレをトラックに沿って次の注射部位に引っ込めます。最後の注入後、ベクター流出を避けるためにカニューレを10分間そのままにしておきます。次に、カニューレを引っ込めて、バイオハザード鋭利物の容器に捨てます。
チャネルロドプシンII導入遺伝子を保有するAAVベクターを左上丘に注入し、続いて40ミリワットの連続的な青色光で刺激すると、一連の連続した活動電位が生じました。1ミリ秒の光パルスは、40ミリワットで活動電位を呼び起こすことができませんでしたが、160ミリワットで確実にそれらを呼び起こしました。視覚誘導サッカードによって引き起こされる上丘の光刺激は、サッカードの獲得を徐々に減少させた。
この変化の遅さは、光遺伝学的に誘発された可塑性と一致しています。網状被蓋骨核へのAAV注射後の眼球運動虫への黄色レーザー光の送達は、小脳への入力である苔状線維の活動を抑制した。この抑制は、小脳の出力であるプルキンエ細胞活性を低下させた。
光遺伝抑制の間、発火速度は減少し、バースト細孔パターンに変化し、プルキンエ細胞への苔状線維入力の抑制が第2バーストを駆動することによってサッカード減速段階に影響を与えることが示唆された。チャネルロドプシンは、眼球運動虫のプルキンエ細胞でのみ発現した。短い光パルスの送達は、単離されたプルキンエ細胞の単純なスパイク活性を増加させた。
1.5ミリ秒の1つの光パルスが、複数の単純なスパイクを頻繁に呼び起こしました。サッカード中に起こるタイミングの光遺伝学的単純スパイク活性化はサッカード振幅を増加させ、眼球運動バースト発生器に対するプルキンエ細胞の抑制解除の役割を確認した。カニューレ内の気泡は、オイルベクターメニスカスを破壊し、注入量の決定を複雑にし、流量の微調整を妨げる可能性があります。
これらの理由から、気泡のないベクトル溶液をロードすることは、この手順にとって重要です。注射の6〜8週間後に、光遺伝学的操作を行い、脳組織を組織学的分析のために処理することができます。この技術により、研究者は少数の動物で多くのベクターをテストすることができ、その結果、新しいベクターの開発と検証が容易になります。
現在特に関心があるのは、特定のニューロン型を標的とするベクターの開発です。
