Yazarlar cömertçe tümör malzeme temini için mükemmel teknik destek ve Prof. Ruebben J. Kueper ve J. Wittschier teşekkür etmek istiyorum.

Tüm ekipman ve reaktifler steril satın alınacak ya da ısı veya buharla sterilize veya% 70 ETOH ile sterilize edilmiş olması gerekir. Hayvanlar üzerinde yapılan deneylerde, hayvanların bakımı ve kullanımı ile ilgili deneysel prosedürleri ve Kurumsal Hayvan tarafından belirlenen düzenlemelere NIH Rehberi ardından, Avrupa Toplulukları Konsey Direktifi (86/609/EEC) uygun olarak yapıldığını ve bu yazarlar Bakım ve Duisburg-Essen Üniversitesi (Almanya) Komitesi (IACUC) kullanın. Bölüm 1: yumurta Kuluçka <ol><li> Döllenmiş yumurtalar 13 ° C&#39;de bir haftaya kadar saklanabilir. </li><li> Yumurta, yumurta sürekli bir günde 12 kez dönen bir kuluçka makinesi, hareketli bir tepsi ile yatay yatık, 72 saat süreyle inkübe edilir. Nem 60 tutulur -% 62, 37.5 inkübasyon sıcaklığı ° C Not: inkübasyon, kir, tüy ve dışkı başlamadan önce dikkatli bir şekilde, oldukça yumuşak bir yüzey yapısı daha kaba bir ortak, gri zikzak el kağıt havlu, kuru silerek mekanik yumurta kabukları çıkarılır . Etanol veya dezenfektan ile yumurta silme Ancak, ne olursa olsun kullanılan sıvı embriyoların hayatta kalma oranı, önemli ölçüde azalır. </li></ol> Bölüm 2: Ex-ovo kültür <ol><li> 72 saat inkübasyondan sonra, yumurtalar inkübatör kaldırılır. Not: çünkü yumurtalar 72 saat süreyle inkübe edilir, ancak bilinmeyen nedenlerle Auerbach ve al.1 önceki gelişim aşamaları ile anlaşma önemli ölçüde daha düşük sağkalım oranları vardı deneylere göre. Aşamalarında en geç 72 saat henüz CAM kapsamında değildir sarısı çuval incelir ve küçük kanamalara bağlılık alan ve (ii) yumurta sarısı-çuval rüptür (i) önde gelen yumurta kabuğu yapışma eğilimi membran. Bu nedenle sunulan yöntem 72 saatten daha büyük embriyolar için geçerli değildir. </li><li> Embriyo belli bir dereceye kadar rotasyon direnir beri yumurta embriyo bulunduğu üst tarafında, kalem ile işaretlenir. </li><li> Yumurtanın üstüne kalem işareti ile yatay düzenlenen ve 80 mm, yumurtanın uzun eksenine yönelik dikey döşeme bir üçgen manyetik karıştırıcı kenarında çatlak. Not: daha iyi bir duygu, hiç eldiven kullanılmalıdır, ancak% 70 EtOH ile eller dezenfekte edilmelidir. Yumurta kabuğu gibi yumurta zarının açılmış olduğu önemlidir. Yumurta beyazı Sızıntı yumurta zarı perfore olmuştur güvenli bir işaretidir. </li><li> Yumurta, yumurta beyazı daha fazla sızmasını önlemek için Petri kabı alt yakın tutulur. Not: ilk açılış prosedürü sırasında, Petri kabı altındaki beyaz yumurta hala bu sonuç olarak bir vakum içinde üst embriyo sarısı tutan yumurta içinde yumurta içinde geri kalanına bağlı olduğu önemlidir. yumurta. Vakum ya yumurtanın içine hava girişi kontrol parmak basıncı ile veya bağlı yumurta beyazı yani vakum sütun artırır yumurta kaldırma düzenlenir. </li><li> Hafifçe başparmak ve orta parmakları ile yumurtanın çatlak ve ekvator üzerinden çalışan meridyen basınç uygulayarak vakum düzenlenmesi mümkündür. Içerik yumurta, yumurta sarısı ile hafifçe kaldırdı ve kabuğun her iki devreyi de dikkatle ayrılır sonra hasarsız Petri çanak transfer olabilir. Embriyo ve yumurta sarısı damarları hasarsız sarısı üstüne yatırılmış olmalıdır. Not: kalem işareti üstünde tutulması değilse kabuk çatlama, embriyo zarar olabilir. Yumurta yeteri kadar dikkatli çatlamış veya embriyoların (bkz. yukarıda) 72 saatten daha yaşlı iseniz, sarısı çuval kabuk ve sık sık rüptürlerinin yapışıyor. Kuluçka nem% 60 veya daha düşük yumurta kuluçka sırasında döndürülmez zaman aynı olur. </li><li> Ex ovo kültürlerin bir kuluçka döndü ve 37.5 ° - 38.2 ° C ve% 60 nem tutulur . Inkübatör hermetik kapalı değil (havalandırma ızgarası kısmen açık!) Ve kapak ve çanak arasındaki ayırıcılar ile özel Petri kapları kullanılır CO 2 veya O 2 kaynağı gerekli değildir. Not: embriyoların Hareketli inkübasyon ilk günlerinde minimum düzeyde tutulmalıdır. Yüksek mortalite oranları çok fazla ajitasyon sonuçlanır. Inkübasyon gün 9 itibaren, embriyoların ajitasyon için daha az duyarlıdır. Ölü embriyolar, enfeksiyonları önlemek için hemen çıkarılmalıdır. Hücre kültürü inkübatörler kullanılması durumunda, hermetik kapalı olan, O 2 kaynağı ölmek değil embriyolar için zorunludur. CAM kurumasına ve aşağıdaki inkübasyon sıcaklığı 37 daha düşük ise ° C, embriyoların çok yavaş gelişecektir Nem esastır. </li></ol> Bölüm 3: anjiyogenez deneyleri için maddelerin uygulama <ol><li> Otoklavlı katlanmış filtre kağıtları (50,5 mm çapında) bir delik zımba yumrukladı ve malzeme (taşıyıcı) CAM uygulanan sıvı maddeler için destekleyici olarak kullanılır. Not: Neredeyse her taşıyıcı malzeme (bkz. aşağıda Tablo), gelişmekte olan CAM gemi mimari değişti, kuluçka 10 gün önce uygulanır özellikle, CAM tahriş olmasına neden oldu . Bu hidroksietil selüloz folyo gibi potansiyel atıl maddeler de dahil olmak üzere, süngerler Teflon (PTFE-pledgets), kollajen süngerler, kollajen folyo, steril gazlı bez (pamuklu çubuklar), yuvarlak kapak fişleri, ve silikon halkaları, tüm yalancı pozitif sonuç neden oldu. Filtre kağıdı en az tahrişe neden görünüyordu ve bu nedenle deneylerde kullanıldı. </li><li> CAM tam gelişmiş, 6 adede kadar farklı örnekleri uygulanan olabilir ve bunların etkilerini tek bir CAM mukayese edilebilir. </li><li> Filtreleri ek doz (3 mg yerli angiotropin) ya da tampon (5 ul PBS) kurutma önlemek için her gün yeniden uygulanmalıdır. </li><li> Kontrolleri çevreleyen kan damarlarının desen değişmeden ise uygulamadan sonra 3 gün, kan damarları, filtreler anjiyogenik maddelere karşı yolunuzu. Not: CAM sarısı-çuval için yanlış olmamalıdır. CAM sarısı çuval gelişimi sırasında küçük sapmaların statik ise dinamik bir gelişmekte olan bir yapıdır. Gelişmekte olan günde üç gelişmekte CAM embriyonun kaudal sonunda küçük bir vezikül olarak ilk kez kabul edilebilir. Günde üç ve on gün arasında giderek artan bir oranda sarısı çuval overgrowing katlanmış iki katmanlı bir zar oluşturarak, ilk vezikül genişletir. Uygulama yeri iletilen ışık efektleri aksi halde embriyo mikroskobik gözlem engel olarak embriyo ve CAM (sınır) kat arasında yarım olmalıdır. Alternatif olarak, CAM büyümeye devam ediyor anjiyogenik madde ile filtre içselleştirilmiş. </li></ol> Bölüm 4: CAM üzerine hücre Aşılama Hücre, 4.1.Preparation <ol><li> Konfluent hücrelerin kullanımı ile steril 25 ml plastik pipet pipet yardımı ile bir kültür şişelerinde FALCON tüplerine transfer edilir. </li><li> Hücre sayısını tahmin etmek için, hücre süspansiyonu 15 ul Neubauer odasına aktarılır ve hücreler mikroskop altında elle sayılır. </li><li> Falcon tüpler oda sıcaklığında 1000 rpm&#39;de 3 dakika santrifüj ve süpernatantı atılır. </li><li> Üreticilerin protokole göre, örneğin PKH26 (Sigma), kırmızı floresan bir canlı hücre zarı etiketleme kiti ile boyandı canlı hücre izleme için, hücreler PBS ile istenen konsantrasyona (2x10 7 hücre / ml) seyreltilir. Enjeksiyon için istenilen konsantrasyon (10 7 hücre / ml) ya da aşılama (3x10 6 hücre / ml); Hücreler hücre kültürü orta (tercihen DMEM Dulbecco&#39;nun modifiye kartal orta) yeniden askıya alınır. Zaten edebiyat 15-17 ve tecrübemizi yayınlanan yoğunluklarına göre farklı hücre konsantrasyonları enjeksiyonları karşı aşılama için uygulanır. </li></ol> 4.2 CAM üzerine hücrelerinin Aşılama <ol><li> Yüzükler (~ 1mm kalınlığında) keskin bir neşter bir 1ml pipet ya da periferik venöz kateter (PVL) tüp kesme ve E6-E14 civciv embriyo kültür ex ovo CAM uygulanır. Not: birkaç kez &quot;gördüm&quot; için çalışın ancak bir pipet veya kateter tüp yoluyla kesmek için ortaya çıkan yüzük keskin kenarlardan kaçınmak için, yeni çok keskin bir neşter kullanılarak kesilmiş . Mikroskop altında mikro çatlaklardan kaynaklanan keskin kenarlar için halkaları kontrol edin. </li><li> 3x10 6 hücre / ml hücreler 20 ul halkalar boyutuna bağlı olarak bir halka içine ya da birden fazla yüzük bölünmüş birimler olarak toplam pipetlenir . Not: Bazı durumlarda, nazik kazıma tarafından CAM travmatize hücreleri 17 ve greft capillarisation (aşağıya bakın) aşılama kolaylaştırmak için bir ön koşul, örneğin . Bununla birlikte, CAM travmatize tasarlanmamıştır ya da tümör hücrelerinin invaziv potansiyeli çalışmaları için, örneğin contraindicative, yüzük aşılama için kullanılmamalıdır olmamalı, ancak hücreleri doğrudan halkalar veya yüzük uygulama olarak uygulanmalıdır kendilerini mikro lezyon neden olabilir . Yüzük kullanılması halinde, bu ağırlığı en aza indirmek ve CAM girinti önlemek için mümkün olduğunca ince kesilmelidir. </li></ol> Bölüm 5: hücre intravitreal enjeksiyon <ol><li> Hamilton mikrolitrelik şırınga steril PBS sonunda% 70 EtOH ve birkaç kez durulanır. </li><li> Mikro şırınga hazırlanan lekeli ya da boyasız hücre süspansiyonu (bkz. Bölüm 4.1) ile doldurulur. Not: enjeksiyon yerinde iğne ile penetrasyon üzerinde dikkatle embriyo (brain!) CAM veya komşu yapılara kan damarlarının zarar değil, seçilecek. Enjeksiyon diseksiyonu binoküler altında yapılmalıdır. </li><li> Mikroskop kontrolü altında, Dikkatli, fakat hızlı bir şırınga iğnesi ile CAM ve göz katmanları nüfuz ve sürekli maksimum 20 ul hücre süspansiyonu (tercihen PBS içinde seyreltilmesi) civciv embriyo kültür ex ovo Vitreusa 10 enjekte. Not: CAM iğne ile nüfuz mümkün değilse, bu iki forseps ile yavaşça onu parçalamasını, az veya hiç kan damarları ile bir yerinde kaldırılmış olabilir . </li><li> Iğne enjekte edilen hücre süspansiyonu bir sızıntı kaybını önlemek için, göz içine 1-2 saniye kalmalıdır. </li></ol> Bölüm 6: tavuk bacak tomurcukları Diseksiyon <ol><li> Yumurta inkübatör kaldırılır inkübasyon 3 ila 4 gün sonra (E3/E4 = Hamburger Hamilton (HH) stage18-23) </li><li> Yumurta, üçgen bir manyetik karıştırıcı kenarı kırık ve Petri kabı (detaylar: Bölüm 2) aktarılır ve embriyo yaylı makas kullanılarak bir daire keserek bağlı sarısı damarlarından disseke edilir. </li><li> , Soğuk, steril PBS ile küçük bir tahliye kaşık kullanımı ile dolu bir taze Petri kabı embriyo transfer ve tür ajitasyon ile yıkanır. </li><li> Embriyo dikkatle ince forseps ile onları parçalamasını, steril PBS ile dolu ve çevresindeki membranlar kurtulmuş küçük bir Petri kabı aktarılır. </li><li> Ekstremite tomurcukları, mümkün olduğunca vücuda yakın mikrocerrahi forseps ile müstakil kavradı ve 8-10-gün eski bir konak tavuk kültürlü ex ovo (prosedürü aşılama) CAM aktarılır. </li></ol> Bölüm 7: fare bacak tomurcukları hazırlanması <ol><li> Zaman hamile çiftleşmelerin kadar vajinal fiş kadın çiftleşme tespit edildiği günün sabah ve gebeliğin gün 0 belirlenmiş. </li><li> Hamile kadın, embriyo gelişimi, (E) 10 13 embriyonik gün ulaştı ve bir balmumu kurulu sabit servikal dislokasyon ile sakrifiye. </li><li> Karın duvarı orta hat boyunca kesilir ve cilt flepleri pimleri ile yanal sabit% 70 ETOH ile ıslatılır. </li><li> Soğuk PBS ile müstakil ve bir behere aktarılır karın, rahmin iki boynuz kaldırılır. </li><li> Embriyolar, ayrılmış bir Petri kabı ve rahim duvarına aktarılır ve embriyonik membranlar forseps kullanımı dikkatle kaldırılır. </li><li> Ekstremite tomurcukları yaylı makas kullanılarak kesilmiş veya ince pens ile mümkün olduğunca vücuda yakın müstakil kavradı ve CAM transfer 8-10-günlük eski konak tavuk kültürlü ex ovo (aşılama işlemi bakınız). </li></ol> Bölüm 8: tümör örneklerinin toplanması <ol><li> Tümör biyopsileri tümör hücre belirli bir kültür ortamı ile dolu 2 ml Eppendorf tüpleri (burada: Leibovitz orta) toplanır ve oda sıcaklığında bekletilir. </li><li> Tümör biyopsileri steril neşter 1-2 mm3 parçalar halinde kesilir. Not: tümör örnekleri çok küçük olsaydı, onlar çok büyük olsaydı, onlar, CAM eklemek olmayabilir, CAM yaralı olabilir ve embriyo ölmek olabilir . </li><li> Biyopsi örneği temel bir parçası CAM üzerine aşılı 8-10-günlük eski ev sahibi tavuk kültürlü ex ovo prosedür aşılama. Not: biyopsi yüzeyinden malzeme almak kas veya bağ dokusu ile kontaminasyon riski artar. </li></ol> Bölüm 9: Aşılama prosedürü <ol><li> Bacak tomurcukları veya tümör örneklerinin, 8-10-gün eski civciv embriyosunda kültürlü ex ovo kullanılır. Tam gelişmiş CAM grefti. </li><li> Greft ideal bir kan damarı Y çatallanma yakın CAM yerleştirilir. </li><li> Istediğiniz uygulamayı yerinde, CAM seçici, bazal tabaka olduğu gibi bırakarak, nazik kazıma kapalı (forseps) çift epitel tabakası üst peridermal parçası travmatize. Not: kanama ya da kılcal damarların görünür rüptürü önlemek için çok önemlidir. </li><li> Greft minimal PBS bağlı CAM aktarılır. Greft bağlı olarak, bir veya iki kez aşılama herhangi bir final aşırı PBS kaldırmak için tasarlanmıştır ve sonra nihayet hazırlanan travmatize CAM yerinde aşılı CAM, bir sitede yerleştirilmiş olabilir. </li><li> Greft ince pens ile kavradı ve CAM üzerine katmanlı. Greft hassasiyetine bağlı olarak, hafif bir basınç (tümör örnekler için uygun) CAM girinti içine manevra greft (bacak tomurcukları için uygun değildir) uygulanan olabilir. Not: ana civciv embriyosunda sık ölecek gibi embriyonik gün (E) 18 civciv bağışıklık sistemini geliştirir, ex ovo xenografts kültürler E17 ötesinde uzatılabilir olmamalıdır. Seçtiğiniz donör doku kaynağı ile aynı zamana denk sırasıyla ev sahipliği CAM&#39;lar, civciv embriyosunda kültürlü ex ovo olması önemlidir. </li></ol> Bölüm 10: Re-greft <ol><li> Ana civciv embriyo dekapitasyon tarafından öldürülür. </li><li> Ile CAMekli greft sivri makas ile dairesel bir kesim tarafından kaldırılır ve PBS ile dolu bir Petri kabı aktarılır. </li><li> Aşırı CAM eski eki sitesi dışında yaylı makas greft kesilir. </li><li> Daha büyük tümör örneklerinin durumda greft yarısı ya da birkaç küçük parçalara kesilir ve ikinci konak yeni CAM bakan kesme kenarı ile yeniden aşılı. </li></ol> Bölüm 11: Temsilcilik Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Shell-daha az tavuk kültür Petri kutularına farklı gelişim aşamaları kültürlü ex ovo Chicken embriyolar. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Ex-ovo CAM anjiyogenez tahlil Döllenmiş tavuk yumurtası 37 ° yatay inkübe ° C ve nem 60 -% 62 ve embriyonik gün 4 (E4) Petri kapları içine kırık. Kuluçka aynı koşullar altında devam etti. CAM üstüne E10 steril filtre kağıtları (çapı 5.5 mm) az katlı ve 5 ul PBS veya 3 mg angiotropin6 yerli ya batırılmış. Kılcal damarların E14 angiotropin ıslatılmış filtre kağıdı doğru belirgin uyum gösterdi. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 bacak tomurcukları grefti Ex ovo Civciv (E3/E4) ve fare (E13) Ekstremite tomurcukları kabuk az tavuk kültürlerin CAM üzerine aşılanmıştır. CAM Kan damarları, iki gün sonra bacak tomurcukları girdi. Bacak tomurcukları gelişme bu ex ovo kültür civciv iki falanks sahne ulaşan ve fare bacak tomurcukları interdijital ağları azaltılması devam etti. <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 tümör örnek ex ovo aşılama Mesane kanseri, biyopsi örneği 10 günlük civciv embriyo kültür ex ovo CAM üzerine ekildi. Kültür iki gün sonra, tümör örnek CAM damarsal bağlı olduğu ve 7 gün sonra, greft giren birden fazla kan damarları gözlenmiştir.

<ol>
	<li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).</li><li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+development+neurobiology.">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).</li><li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+models+to+quantify+angiogenesis+induced+by+inflammatory+and+tumor+cells+or+purified+effector+molecules.">Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules.</a> Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).</li><li>H&#246;ckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+monocyte-derived+angiogenic+substance+(angiotropin)+stimulates+migration,+phenotypic+changes,+and+"tube+formation"+but+not+proliferation+of+capillary+endothelial+cells+in+vitro.">Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and "tube formation" but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro.</a> J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).</li><li>Wissler, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+blood+vessel+patterns+by+Angio+Morphogens+[Angiotropins].">Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins].</a> Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).</li><li>Kistler, H. B. . J. r. .., LaVail, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penetration+of+horseradish+peroxidase+into+the+optic+nerve+after+vitreal+or+vascular+injections+in+the+developing+chick.">Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick.</a> Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).</li><li>Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Change+in+embryonic+eye+size+and+retinal+cell+proliferation+following+intravitreal+injection+of+glycosaminoglycans.">Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).</li><li>Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-malignant+migration+of+B16+mouse+melanoma+cells+in+the+neural+crest+and+invasive+growth+in+the+eye+cup+of+the+chick+embryo.">Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo.</a> Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).</li><li>Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+tumour+cell+lines+implanted+onto+the+chorioallantoic+membrane+of+chick+embryo+to+anticancer+agents+in+combination+with+hyperthermia.">Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia.</a> Urol. Res. 20, 237-239 (1992).</li><li>Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+generates+a+more+invasive+phenotype+of+tumour+cells:+an+in+vivo+experimental+setup+based+on+the+chorioallantoic+membrane.">Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane.</a> Pathol. Oncol. Res. , (2008).</li><li>Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chorioallantoic+membrane+assay:+vascularized+3-dimensional+cell+culture+system+for+human+prostate+cancer+cells+as+an+animal+substitute+model.">Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model.</a> J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).</li><li>Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grafting+of+organs+and+tissues+to+the+chorioallantoic+membrane+of+the+embryonic+chick.">Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick.</a> TCA Manual. 4 (3), 881-883 (1978).</li><li>Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+blood+levels+of+human+S100+in+melanoma+chick+embryo+xenografts'+circulation.">Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts' circulation.</a> Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).</li><li>McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+new+continuous+cell+line+derived+from+a+human+retinoblastoma.">Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma.</a> Cancer Research. 37, 1003-1010 (1977).</li><li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination.">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Research. 65, 10959-10969 (2005).</li><li>Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay.">requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li></ol>

Yenilikçi ya da sadece başka bir civciv kültür protokolü? Eski kabuk kültür protokolleri ile civciv embriyo 1-4 toplam sağkalım oranları, örneğin ca düşüktü. % 30 1. Bu video makalede açıklanan rafine ex ovo kültür protokolü aksine,% 50&#39;nin üzerinde sağkalım oranları sağlar. Civciv embriyo ovo kültürlerin klasik karşılaştırıldığında ex ovo kültürü CAM ve civciv embriyo erişilebilirliğini ö...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fertilized Eggs</td>
<td>Animal</td>
<td>S&ouml;ries Trockels, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator Type 3000 with rotating egg tray</td>
<td>Tools</td>
<td>Siepmann GmbH Germany</td>
<td>9503</td>
<td>Maintain at 37&deg;C with relative humidity set above 60%</td>
</tr>
<tr>
<td>Egg incubator BSS 160</td>
<td>Tools</td>
<td>Grumbach, Germany</td>
<td>8101</td>
<td>Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile
</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco's modified eagle's medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 6429</td>
<td>DMEM culture medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Leibovitz's L-15 Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31415-029</td>
<td>here: collection medium for tumor samples</td>
</tr>
<tr>
<td>Tumor cell -specific medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz's Medium or Dulbecco's modified eagle's medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 &mu;M insulin</td>
</tr>
<tr>
<td>70% EtOH</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic stir bar, triangled 80 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>442-0391</td>
<td>A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5 </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors, straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine Iris scissors, straight</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14094-11</td>
<td>Use to cut our the CAM</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>microliter syringe 1702 TLLX, 25 &mu;l</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton</td>
<td>80222</td>
<td>Use for injection into the vitreous</td>
</tr>
<tr>
<td>Hamilton 33-G needle (15 mm)</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18073-15</td>
<td>Use for injection into the vitreous</td>
</tr>
<tr>
<td>Sterile scalpels</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use for dissecting tumor samples</td>
</tr>
<tr>
<td>Small drain spoon</td>
<td>Tool</td>
<td>Geuder, Germany</td>
<td>15758</td>
<td>Use to transfer of small chick embryos</td>
</tr>
<tr>
<td>Wax board with fixing pins</td>
<td>Tool</td>
<td>Self made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use to fix of animals for dissection</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes 60 x 15 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Greiner</td>
<td>628102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petri dishes 92 x 16 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>82.1472</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Petri dish 100 x 20 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Greiner</td>
<td>664160</td>
<td>extra deep, with spacers for ventilation</td>
</tr>
<tr>
<td>Beaker</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>300-600 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>FALCON tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>15 ml and 50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1.5 ml and 2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml pipette tips</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use to cut plastic rings for application of substances / cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Peripheral venous catheter (PVL)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viggo&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes and tips</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf / Abimed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter</td>
<td>Tool</td>
<td>Schleicher &amp; Schuell</td>
<td>311643</td>
<td>Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper</td>
</tr>
<tr>
<td>PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>santec-medical</td>
<td>REF 277, LOT 832/511-1</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Kollidon 17 PF</td>
<td>Reagent</td>
<td>BASF</td>
<td>S30200</td>
<td>mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagen Biomatrix TissuDura</td>
<td>Tool</td>
<td>Baxter Healthcare S.A.</td>
<td>REF B2246000999999</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Round glass cover slips, 11 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Assistent Germany</td>
<td>1001/0011</td>
<td>Carrier; causes false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine Collagen Sponge</td>
<td>Tool</td>
<td>Wyeth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Resodont Absorbable Collagen Membrane</td>
<td>Tool</td>
<td>Resorba Woundcare Germany</td>
<td>LOT 280303</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-Woven Swabs</td>
<td>Tool</td>
<td>Fink &amp; Walter GmbH</td>
<td>REF 328132</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

chick ex ovo culture and ex ovo cam assay: how it really works

Islah erken dönemde tavuk yumurtası, in vitro ve in vivo sistemleri arasında ve anjiyogenez okumak için değil, aynı zamanda tümörogenez çalışma sadece vasküler bir test ortamı sağlamak . Civciv chorioallantoic membran (CAM) sonra, kan damarı ağına kolayca erişilen manipüle ve gözlenen ve bu nedenle anjiyogenez deneyleri için uygun bir ortam sağlar. Lenfoid sistem tamamen inkübasyon geç evrelerine kadar gelişmemiş olduğundan, civciv embriyo türe özgü bir kısıtlama olmaksızın aşılı doku ve hücreler sürdürme yeteneğine doğal bağışık yetmezliği olan bir ev sahibi olarak hizmet vermektedir. Gelişmekte olan besleyici ek olarak allo ve xenografts, CAM kan damarı ağı, tümör hücresi intravasation, dağıtılması, ve damar tutuklandı hücrelerin mikro metastatik odaklar oluşturmak için extravasate tutuklanması ve bir depo için benzersiz bir destekleyici bir ortam sağlar. Deneysel amaçlar için, son çalışmalar en CAM yumurta kabuğu ile bir pencere kesme ve deneyler, gözlem ve etkileri fotoğraf dokümantasyon imkanları CAM ve erişilebilirliğini önemli sınırlamalar, ovo yapılmıştır maruz kalmıştır . Civciv embriyo kabuk az kültürleri 1-4 kullanıldığı zaman, eğer yayınlanan hiçbir deneysel ayrıntıları, sağlanan ve bu kültürlerin sağkalım oranları oldukça düşüktür. Biz yumurta içeriğini bir rasyonel kontrollü ekstrüzyon tanıtarak civciv embriyo ex ovo kültürünün önemli yöntem rafine. Bu ex ovo kültürlerinin etkileri in vivo belgelerinde kolay sağlayan ve embriyo deneysel manipülasyon kolaylaştırılması, CAM ve civciv embriyo erişilebilirliğini artırmak. Bu bilimsel soruların çok sayıda başarılı uygulama sağlar: (1) tahlil 5,6 olarak geliştirilmiş bir anjiyogenez, (2) deneysel (3), 7-9 civciv embriyo göz vitreus kolaylaştırdı enjeksiyonlar için ayarlamak yaygınlaştırılması ve intravasation için bir test ortamı (5 CAM 10-12 inoküle kurulan hücre hatları tümör hücrelerinin, (4), tavuk ve fareler 13 de bacak tomurcukları başarılı transplantasyon ve kültürünün sürdürülmesi için geliştirilmiş bir sistem olarak dağınık olarak , aşılama, yayılımı, ve CAM (14) yüzeyinde biyopsilerinde elde edilen katı primer tümör dokusunun yeniden aşılama) . Bu video makalede rafine civciv ex ovo kültür ve CAM sağkalım oranları% 50 üzerinde tahlil kurulması açıklanmaktadır. Ayrıca, çok sayıda bilimsel uygulamaları için ex ovo kültürünün başarılı bir uygulama adım gösteri bir adım sağlar . Daniel S. Dohle, Susanne D. Paşa ve Sebastian Gustmann Bu çalışmada eşit katkıda bulunmuştur.

Watch this Scientific Journal Video about Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works at JoVE.com

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

Civciv chorioallantoic membran (CAM), anjiyogenez ve tümörogenez çalışmak için eşsiz bir doğal bağışık yetmezliği olan, destekleyici bir kültür ortamı. Bu video makale piliç farklı adımları gösteriyor.<em&gt; Ex ovo</em&gt; Kültür, potansiyel anjiyogenik maddeler ve CAM yüzeyinde tümör hücre ve dokuların başarılı aşılama uygulaması.

Civciv Ex ovo Kültür ve Ex ovo CAM Testi: Gerçekten Nasıl Çalışır?

Chicken eggs in the early phase of breeding are between in vitro and in vivo systems and provide a vascular test environment not only to study ...

chick-ex-ovo-culture-and-ex-ovo-cam-assay-how-it-really-works

Research

JoVE Journal

Biology

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

48.5K Görüntüleme.  University of Duisburg-Essen. Civciv chorioallantoic membran (CAM), anjiyogenez ve tümörogenez çalışmak için eşsiz bir doğal bağışık yetmezliği olan, destekleyici bir kültür ortamı. Bu video makale piliç farklı adımları gösteriyor. Ex ovo Kültür, potansiyel anjiyogenik maddeler ve CAM yüzeyinde tümör hücre ve dokuların başarılı aşılama uygulaması.

Video: Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

HH Sahne 10 Tavuk Embriyolar Ovo Electroporations

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biyoloji

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Bir Eski-ovo</emGörüntüleme ve Mikrocerrahi Uygulamaları için uygundur> Tavuk Embriyo Kültürü Sistemi

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

Embriyonik Chick Retina Ovo Elektroporasyon

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Tarafından Eski Tavuk Embriyolar içine Gen Transferi<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elektroporasyon

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Fare Embriyonik Cilt ve Melanoblast Göç Canlı görüntüleme ex vivo Kültür

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.