この作品は、視覚障害（キャリア開発のMEZとASVの受賞と眼科への無制限の助成金）、E.マチルダゼイグラー財団（MEZとASV）と国立眼研究所/ NIH（MEZを防止するための研究からの補助金によって支えられて、助成金R01EY015748とR01EY017964）。

パートI.は、ACTアッセイのセットアップが簡単にできます。 <ol><li>クロロホルム精製法（;アプライドバイオシステムズ/アンビオン、オースティン、テキサス州などmMessage mMachineキット）：自分のフェノールを使用して、製造元が推奨するように注射用キャップRNAを生成する。蛍光タンパク質をコードするRNAをトレーサーとして使用されます。私たちは、黄色蛍光タンパク質（YFP）またはpCS2 +発現ベクターになっているcDNAをmCherry 5のいずれかを書き写す。 </li><li>マイクロピペットプラーを使用してテーパーガラスチップを形成するために、ホウケイ酸ガラス毛細管を引き出します。我々は、サターマイクロピペットプラー、P - 97（サッタインスツルメンツ社、ノヴァト、CA）を使用し、前述の6を説明した。 </li><li> KClを20mMの; 20mMのCaCl 2を 、50mMのHEPES、1MのNaCl、pH7.5に調整し、オートクレーブとに格納されている10 Xマークの修正リンゲル（MMR）ソリューション株式（10mMのMgCl 2から表1の滅菌溶液を作るRT）。 </li><li>男性のカエルから精巣を分離し、1X MMR /ゲンタマイシン（50μg/ mlの硫酸ゲンタマイシン、BioWhittaker、猫＃17 - 518Z）の滅菌溶液に4℃で組織を保存する。これは、実験開始前の週までに行うことができますが、それは時間をかけてその効力を失いますている。 </li><li>産卵溶液（1X：150mMのNaCl、2.62 mMの塩化カリウム、0.8 mMののNa 2 HPO 4、20mMのTrizma塩基、2.62 mMのNaHCO 3と2.75 mMのMgSO 4を用い 、pHを7.6に調整）、8X株式として作ることができる4℃で保存することができます℃で最長2週間のための注記 ：このソリューションの汚染に注意、これは卵の品質に影響を与えるので。 </li><li>注入プレートを生成します。これを行うには、軽く泡を防止し、約のためにクールなように解決の上にエラストマー金型を（図1）アンロール、60 mmのプレートに〜6 mLの溶融アガロース溶液を追加し、電子レンジで0.4X MMRの1％アガロースを溶かす室温で20分。必要な数を決定するために、実験条件の数を考慮してください（ 例：1、YFP、2、YFP +ノギン）及び移植宿主胚の数が必要。我々の実験では、各実験条件に対して、少なくとも20移植宿主胚を生成する。 18〜19℃で、胚は1時間ステージ15になります。それは20の移植を実行するために一時間を要する場合、2つの受精時のポイントは、宿主胚はすべて移植を受け入れると仮定して、必要とされています。したがって、4つの注射の料理は（2のexpの条件× 2受精の時点= 4）必要になります。最大1週間までは4℃でプレートを保管してください。 </li><li>注入プレート用として金型を1％アガロース+ 0.7X MMRを使用してキャップの絶縁板を生成します。注入プレートを加えたつ余分あたり受精の時点（4 + 2受精の時点= 6）のようなキャップの分離の同じ数を作る。 </li><li> 500台でマイクロインジェクションの前日に一日の後半にヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを女性に注入する。 ℃で一晩16から18の雌を保管してください。 </li></ol>パートII。 アフリカツメガエルの胚のRNAのマイクロインジェクションマイクロインジェクションのためのA.の準備<ol><li>ホルモン誘発される女性を取り外し、1X産卵ソリューション（ELS）を含む個々のタンクの中に置いてください注意：私達は卵の質が低下するとELSで3つ以上の時間をされている卵を使用しないでください。そのため、 体外受精の前に約一時間、我々は唯一の新鮮な卵が収集されるように、タンクからすべての卵を捨てる。 </li><li> 25〜35μmの直径を得るために先端をオフsnippingによってマイクロインジェクション用のニードルを準備します。 picoinjectorの上に針を置き、それが注射あたり10 NLを分配するようにそれを校正する。 </li><li> 14℃にインキュベーターを設定する</li><li>かつて女性は約1時間、転送ピペットを使用してタンクから卵を除去すると60mmのペトリ皿にそれらを置くための卵を置いている。できるだけ卵から多くELSとして削除し、1X MMRと交換してください。卵は、すぐに受精または1時間まで1X MMRに滞在することができます。移植アッセイのために、それは周りの午前11時、正午と午後1時3つの別々のバッチまでの卵の単層の80％完全な2皿を、受精させる最善の方法です。注射の後、彼らは（;パートI、上記の＃6を参照ステージ15）14 ° Cは非常に彼らはキャップの分離（ステージ8.5〜9）と移植のための必要な段階に成長するとその時点で配置されます。 </li><li>精巣の品質を確認するには、我々は最初から精子が実行可能でない場合、私たちは別の男性から精巣を抽出することができる早朝の受精を（〜午前8時）、実行してください。注：我々は1 mLの1X MMRで〜0.25睾丸をホモジナイズし、卵母細胞のプレート当たり約5〜7滴を追加します。 </li><li> in vitroでは時間後、均質化した精巣に卵を受精し、脱ゼリー液（164μl1M DTT + 10mLの1Mトリス、pH 8.8、50 mLのオートクレーブnanopureの水への）を使用して卵のゼリーのコートを脱ぐ。彼らは18℃でCまたは室温で1.5時間（22℃）を約2時間かかるソートを開始する2細胞期に達するまで待ちます。 </li><li> TRANSFの使い方二ピペット、一様に色素ソートと均等に分割し胚は、として0.4X MMR + 6％フィコールで満たされた注射皿のウェルに、図3の左側のアニマルキャップに示す。 </li></ol> B.マイクロインジェクション<ol><li> 60ミリメートルペトリ皿の蓋の上にパラフィルムを伸ばす。ピペットパラフィルム上に、最初のRNAサンプルを2μlと注射針を埋めるためにPLI - 100を使用して吸引除去する。針はまだ注射を開始する前に、サンプルの10 NLを調剤していることを確認してください。 </li><li>別の皿7の500の皿と、目的の遺伝子（例えば、20 pgのノギンRNA）のPG YFP RNAに加え、YFP RNA 20〜30 2細胞期の胚を（両方の割球）注入。 </li><li>フィコール液で別の注射の皿の中で時間をポイントごとに100から200までの非注入胚を置きます。注入された胚と同時にinとoutインキュベーターのそれらを移動する。これらは、パートIVで使用されるホストです。 </li><li>注入後、14歳ですべての胚をインキュベート℃で一晩。すべての時間ポイントについて繰り返します。 </li></ol>パートIII。注入された胚から動物のキャップを分離する<ol><li>胚を上演するために早朝に到着する。早い時点ではステージ9になっているはず。生存しなかったものを削除します。バッチ内の各時点での作業は、次の手順に進みます。 </li><li>各プレートからフィコール溶液を捨て、バック0.7X MMR /ゲンタマイシン溶液を添加する。キャップの分離皿に、0.7倍MMR /ゲンタマイシンソリューションの寛大な量を追加します。作りたてのキャップの分離皿に転送ピペットと場所を使用してインジェクション皿の井戸から胚を押しのける。 </li><li>ステージング用に2つまたは3つの完全な胚を保ち、0.7X MMR +ゲンタマイシン溶液中で動物のキャップを分離します。黄色の先端は400μmに曲げたり、鋭い番号5ピンセットを装着Gastromaster、どちらを使用することができます。 </li><li>次の日まで、14℃インキュベーターに戻しキャップを置く。宿主胚は、ドナーの組織と同じ発達段階でそれらを保つためにキャップと同時にインキュベーターから削除する必要があります。 </li></ol>パートIV。側面上にキャップの移植<ol><li> 14℃インキュベーターからの最初の時点から、キャップや胚を取り出して、胚を上演。トレーサーの注入（図2）に応じて、均一な黄色または赤色蛍光陽性キャップの並べ替え、。 </li><li>キャップの数をカウントし、0.7倍MMR /ゲンタマイシン溶液を新しく調製した注入皿にステージの数が12から13までの胚を二重削除。シャープ＃5鉗子で、それぞれから卵黄膜を除去。キャップ付きのプレートに移すが、注意してください。彼らの卵黄膜がなければ、胚は、すぐに水の表面で解離することができます。 </li><li> gastromaster（黄色の先端、200 -250μm曲がった線、最高の設定）または＃5ピンセットを使用して、ステージ14から15（図3）における胚の辺上の正方形は200μmを削除します。その後、半分にキャップをカット（gastromasterまたは＃5ピンセット付き）とホスト胚に作られた穴にティッシュを置く。治癒を可能にするためによくに対する胚を回転させる。彼らがステージ15にあるときに、できるだけ多くの胚などに対してこれを行います。すべての時間ポイントについて繰り返します。 </li><li>胚は、通常30分以内に治るでしょう。 ＃5鉗子で穏やかなブラッシング運動と死細胞（白）を取り外します。 18 ° Cで一晩、それらを成長する。 </li><li>解剖蛍光顕微鏡、蛍光標識によるソートの胚、移植組織の下で。 18でそれらを戻す° Cステージ42から43まで成長する。 </li><li> tricaineで動物を麻酔。この時点で、蛍光解剖顕微鏡下で写真を撮ることができます。設定が終了したら、セクションを修正し、免疫染色や、興味のあるあなたの組織のためのマーカーを用いてin situハイブリダイゼーションで行います。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。胚保持料理を作るために使用されるエラストマー金型を鋳造するためのプレキシガラスの設計 。 38 × 38ミリメートル丸三角四角（深さ〜5 mm）を50 × 50 mm角と厚さ25 mmであるプレキシガラスの部分からルーティングされています。円形、等間隔井戸（1.5 mmの直径）は、プラスチックへの深い1mmを掘削している。マイクロインジェクションの料理用エラストマー金型を作るために、我々は、製造元の指示に従って、プレキシガラスにSylgardエラストマーを注ぎ、それが固化することができました。このエラストマー金型を射出し、キャップ絶縁板を作るために使用されます。 <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。式が変化するように移植する前にソートアニマルキャップは、重要です。右側の外植片は、むらの式があり、破棄される間、左側のアニマルキャップが組織全体に均等にmCherry表現する。 <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。ホストtadpOLEが移植アニマルキャップ細胞からその山腹の目状の構造を開発しました。蛍光画像が明視野画像上にオーバーレイされています。

<ol>
	<li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+cloning+of+noggin,+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos.">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li><li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin.">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li><li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+in+Developmental+Biology:+Xenopus+&#38;+Zebrafish.">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus &#38; Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , (1999).</li><li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells.">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells.">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li></ol>

このビデオでは、我々はアニマルキャップの移植アッセイを作成するために再配置アフリカツメガエルの生物学者によって使用される古典的なテクニック、私たちのバージョンを示している。室温では、 アフリカツメガエルの胚では、ステージ9と15を介して非常に迅速に開発する。 14 ° Cでそれらを置くことによって、胚の発達が遅くなると、より多くの移植が一つの実験で行?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mMessage mMachine SP6 Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems/Ambion</td>
<td>AM1340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FHC, Inc</td>
<td>27-30-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Inc.</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate [50 mg/ml]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BW17-528Z</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard/elastomer Kit 1.1lb</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>NC9644388</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm polystyrene petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>8609-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>human chorionic gonadotropin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet</td>
<td>22219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pico-Injector Microinjection Systems</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>650003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-680-21</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Krackeler</td>
<td>6290-20635A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumostar #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11295-10</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

tissue determination using the animal cap transplant (act) assay in xenopus laevis

多くのタンパク質は、胚発生における二重の役割を果たす。特定の組織の細胞の運命決定を制御するものも、胚の大きな領域の発展に影響を与える可能性があります。これは解析が困難、特定の組織にその役割を定義することができます。例えば、<em&gt;頭</emの&gt;過剰発現<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚では眼を含めて、全体の前方領域の拡大を引き起こす<sup&gt; 1,2</sup&gt;。この結果から、ノギンは、神経組織の拡大を引き起こすことによって眼の決定またはその直接的な役割を果たしている場合、ノギンは間接的に目の形成に影響を与える知られていない。この複雑な表現型を持つことは、分析することは困難細胞の運命決定における眼特異的な役割を研究することができます。我々はこの問題を克服するアッセイを開発した。の多能性の性質を活用して<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;アニマルキャップ<sup&gt; 3</sup&gt;、我々は同じように、遺伝子産物の機能（複数可）をテストするためのアッセイを開発した<em&gt;頭</em胚の側にこの組織を移植することにより、特定の組織または細胞型にキャップを変換する&gt;または目のフィールドの転写因子（EFTFs）、<sup&gt; 4</sup&gt;。我々は、ノギン蛋白質の治療や転写因子のコレクションのいずれかを発見した一方で、動物のキャップで網膜細胞の運命を決定することができます、この手順は同様に他の組織を指定することに関与する遺伝子産物を同定するために使用することができます。

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Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

アニマルキャップを過剰発現する遺伝子産物（s）を開発の側面に移植されています<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚組織が決定されているかどうかを確立するため。

でアニマルキャップの移植（ACT）アッセイを用いて組織の決定アフリカツメガエル</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

12.1K ビュー.  SUNY Upstate Medical University. アニマルキャップを過剰発現する遺伝子産物（s）を開発の側面に移植されていますアフリカツメガエル胚組織が決定されているかどうかを確立するため。

ビデオ: Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

アフリカツメガエルの胚および細胞接着アッセイのアセンブリから主催し、動物極の外植片の解剖

生物学

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

プラスチック製の埋め込みとアフリカツメガエル胚のセクショニング

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

アフリカツメガエル女性から卵子を入手

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

アフリカツメガエル卵抽出物の調製と分画

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

乳腺上皮移植の手順

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

顔面移植<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

の解剖<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経堤のため<em&gt; in vitroで</em&gt;外植片培養又は<em&gt; in vivoで</em&gt;移植

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

で微小管ダイナミクスを測定するためにplusTipTrackerソフトウェアを使用した<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;成長円錐

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...