私たちは、カエルの飼育および胚の準備を支援するために彼の助けのためのラデクSindelka、およびCAS Bresillaに感謝します。この作品は、HLSローラ·Jacoxに付与R01DE021109を経由して、NIHによって資金を供給されたが、ハーバード大学のハーシェル·スミス大学院フェローシップとF30の個々のフェローシップ助成F30DE022989-01 NIDCRを通してによって資金を供給された。

1。試薬の調製<ol><li> 10倍のMBS：バース生理食塩水（MBS）溶液17修正10倍の1リットルを準備します。 表1、試薬、成分、および手順を参照してください。すべてのソリューションのために、蒸留水を使用してください。完全に溶解するまで、撹拌棒を使用して、ビーカーに混ぜる。すべての溶液は室温でなされるべきである。 </li><li> 1X MBS：1X MBS 1リットルを作るために蒸留水900ミリリットルに100ミリリットル10倍のMBS溶液を希釈。 1 M CaCl 2溶液の0.7ミリリットルを追加します。 </li><li> 0.1×MBS：希釈1×MBS 0.5×MBS溶液および0.1×MBS溶液の2 LのL 1を調製する。 0.1×MBS溶液1リットルに、10 mg / mlのゲンタマイシン溶液1mlを加える。ゲンタマイシンと0.1×MBS溶液は、長期間の胚の培養に使用される。 </li><li>フィコール/ MBSは：0.5×MBS溶液500mlにフィコール400の15グラムを追加します。積極的に混ぜる。攪拌棒を追加し、フィコールが完全に（数時間）に溶解するまで混合する。 </li><li> 70％エタノール：70％エタノール、100％エタノールを用いて希釈する蒸留水。 </li></ol> 2。ガラス営業ツールの準備<ol><li>針の準備：ニードルプラーにキャピラリーチューブをロードします。 <ol><li>ニードルプラー設定： 表2に示されている設定に応じて針を引っ張る。特定の試薬や機器の表で説明するように設定は、サターInstrument社モデルP-80/PCマイクロピペットプラーとキャピラリーチューブのためのものです。しかし、これらの設定はサター針プラーに固有であり、他のマシンのために調整する必要があります。マシンの製造業者によって指定された設定は、ランプ試験を用いて決定することができる。 </li><li>手続きの準備のために4〜6針を引っ張る。針は通常、長い2〜3ミリメートルである、ガラスチップの柔軟な、髪の毛のような部分が完全に除去されるように分割する必要があります。先端部は比較的硬質であるが、切削工具として使用するのに十分に狭い静止しなければならない。 図1Aに理想的な針の写真を参照してください。 </李&gt; <li>中央下に粘土のストリップとペトリ皿に針を保管してください。所定の位置に保持するようにして離れて底部及び側部からの脆弱な鋭い先端を保つために、粘土に各針のシャフトを押してください。 </li></ol></li><li>追加ツールの場合は、長い標準パターン鉗子、ブンゼンバーナー、および3-4ガラスパスツールピペット（サイズは5¾）のペアガラスカバースリップを得る。 </li><li>ピペットツール：ピペットツールを作成するには、ブンゼンバーナーを点灯し、先端が溶けて穴が完全にシール、閉じられた、丸い端部を形成するように、それを回転させながら炎の青い部分にガラスパスツールピペットの先端を配置。丸みを帯びた、密封されたチップは、後で動作中に胚を保持する粘土皿にくぼみを作るために使用される。 図1Bを参照してください。 </li><li>ガラスの橋：ガラスの橋を作るためには、慎重にカバースリップガラスの3ミリメートルの塊で3ミリメートルを解消するために長い標準パターン鉗子を使用しています。 Tでカバースリップの一部を保持しながら、すべての4つのエッジが下方向に柔らかく曲線までweezers、小さなガラスのドームを形成する、炎でガラスを配置します。エッジはもはや鋭くないはず。 図1Cを参照してください。 </li><li>それらを挿入することにより、ガラスカバースリップ橋を保存する、ペトリ皿の底の内側を覆う、粘土に、ダウンエッジ。橋の上に粘土表面上に残るように、ブリッジを挿入します。このような橋が壊れていることをあまりにもハードにプッシュしないでください、それは除去が困難な場合がありますので、完全に、粘土に橋を埋め込まない。火炎又は70％エタノールで殺菌した後、ブリッジは実験毎に再利用することができる。 </li></ol> 3。胚操作の​​準備<ol><li>粘土の小さな60ミリメートルのプラスチック製ペトリ皿を並べる。使用の間、皿および粘土表面は十分に70％エタノールで、次いで蒸留水で洗浄する。 注：にローカルで購入することができますを使用し、赤、白や黄色、バンAken Plastalinaモデリング粘土、Yまたは美術店。それが残留を解放するため、黒色の粘土はお勧めできません。 </li><li> 3％のFicoll 0.5X MBS溶液で、皿を埋める。より高い塩濃度は、組織解離を防止し、多糖フィコール位置に顔を保持するのを補助する溶液を増粘するのに役立つ。 </li><li>燃え上がったパスツールピペットツールを使用して、ステージ20胚本体の深さ約粘土の浅い、2〜3mmの窪みを作 ​​るために（ 図1を参照）。お皿の両側に、離れて20から30の凹部1-2 mmで作るので、40〜60の凹部の合計があります。ピンセットで粘土にイニシャルを彫刻することにより、1辺LOF / GOF、反対側の野生型にラベルを付けます。 </li></ol> 4。術前の胚の準備<ol><li>入手して、文化、アフリカツメガエルは、標準的な方法17を使用して胚ツメガエル 。カエルの飼育の詳細については、SIVE らを参照してください。17 <ol><li> 48時間の実験obta前にメスのカエルからの卵と体外受精で行う。 </li><li> 1細胞期または2細胞期の2細胞に0.5〜1キャップ膜のGFP mRNAのNGに加え、任意のmRNAまたはアンチセンスモルフォリノで修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（「モルフォリノ」）を注入する。 1細胞期には約70〜90分持続します。 1-3 NLの総容量を注入する。 （例えば、GFPまたはRFP RNAのような）蛍光タンパク質をコードするRNAの代わりに、一方がFITC標識モルホリノ又は蛍光標識デキストランを注入することができる。蛍光は、組織の治癒を移植し、ヘッドに残っているか否かを判定するために重要である。 </li><li>キャップされたmRNAは、mMessage mMachine T7またはSP6のキットを用いて線状化プラスミドから調製することができる。モルホリノは、遺伝子ツールLLCを通じて設計し、注文することができます。所望の効果のために必要モルホリノの量は、各遺伝子18のために決定されなければならない。 </li><li>彼らは、ステージ19〜20に到達するまで、48時間15℃で注入した胚を保存する。 （Fまたはそれ以降のすべてのステップを、段階の胚Nieuwkoopとフェーバー19によるアフリカツメガエルの通常のテーブルによる。） 注：移植が最適に機能するためには、手術当日に、両方の受信者とドナー胚は、互いに1ステージ内でなければなりません。しかし、モルフォリノ（「モルファント」）を注入した胚は、時々、よりゆっくりと野生型よりも開発したり、モルファント胚を制御するので、モルファントと野生型の胚の両方が同じ段階にあることが必要で、実験を調整すること。モルファントは、従来の手順と12〜24時間、より高い温度に維持される必要があり得る。胚が一致する段階で見つけることができる可能性を高めるために、胚は、いくつかの温度で維持することができる。実験前に二十四時間、1は15〜18℃で18〜20℃、野生型の胚で、いくつかの皿、および場所モルファントに胚を分割しなければならない</li></ol></li><li>移植実験の日に、レムthe15℃のインキュベーターから胚オベとNieuwkoopとフェーバー19に応じてそれらを上演。彼らは後半神経胚（ステージ19）よりも若いしている場合、彼らはステージ19に到達するまで、1〜2時間室温でそれらを残す。 </li><li>蛍光顕微鏡下で注入した胚を選別。実験のための統一、明るい蛍光を示す胚を選択します。 </li><li>動作領域に近いクラッター、可能な汚染物質を除去する。 70％エタノールで操作面、実体顕微鏡およびすべてのツールを拭う。 </li><li>胚はステージ19になったら、実体顕微鏡下で＃45分の5デュモンの鉗子を使用して、卵黄膜を除去します。 <ol><li>ドナーとホスト胚の各20〜30の卵黄膜を除去します。 </li><li>最初のいくつかの顔面移植実験のために、1は、各条件のためのいくつかの胚で練習してください。この方法は、困難であり、それは、迅速かつ首尾よく、より大規模に使用する前に慎重に練習を必要とする。一つは、Uを働かせることができる20移植/実験をすることをP。 </li></ol></li><li>プラスチックを使用して、オペレーティング皿にホスト胚を移動し開口部が胚（少なくとも数ミリ）よりもはるかに広いなるようthatカットオフチップでトランスファーピペットを卒業した。胚は表面張力に爆発するように、気泡や水面に胚に触れないように注意してください。 </li><li>粘土中の胚の後部に、粘土凹部に胚を挿入するために＃45分の5ピンセットを使用してください。優しくうつ病から突出、胚の上四半期、頭を残して、ピンセットを用いて胚のベースの周りに粘土を閉じます。 </li><li>すべてのホストの胚は、それらの凹部内に固定されると、プレートの反対側に移動し、その凹部にドナー胚を挿入し始める。そのウェル中の胚を確保するプロセスを繰り返します。 </li></ol> 5。顔面移植手術を行う<ol><li>ナイフをカット：除去するための切断ナイフなどのドナーEAD組織の適切割れたガラスキャピラリーニードル（ステップ2.3および図1参照 ）を使用します。 注：一つは、直接指の間の毛管を保持することができます（これは小さな手を持つ人々に適しています）、または1は、昆虫のピンホルダーに針を取り付けることができます。ピンホルダーに装填Electrosharpenedタングステン針17の代わりに毛細管針を用いてもよい。具体的な試薬および器具の表で示唆ピンホルダー、タングステン針を参照してください。 </li><li>実体顕微鏡下では、セメント腺の左にある胚の頭の中に針を挿入します。それは胚の外側から、頭部を通って、腸に通過するように針が深く挿入する必要があります。全体EADを移植するために、カットは前腸に胚の外側から拡張する必要があります。外胚葉のみの移植のため、カットが浅くあるべきであり、唯一の外胚葉を貫通している。 <ol><li>左から右側に針をフリックセメント腺の幅全体にわたって、頭。動きがきれいにカットを与えるようにフリックが重要です。カットのデモンストレーションのための技術と、図2Bの概要については、 図2Aを参照してください。セメント腺と目がカットのための重要なランドマークです。カットの順番は結果に影響しませんし、ユーザーの好みや利き手によって異なる場合があります。 </li></ol></li><li>セメント腺の左の境界で、前のカットの開始時に針を置き、それは、左眼の下に到達するまで上方向に針をフリック。これは、左眼の下にセメント腺の左の境界からの垂直カットを作成します。 </li><li>セメント腺の右側の境界線に針を置き、それが右目の底部に到達するまで、上方向に針をフリック。これは、右眼の下にセメント腺の右側の境界線からの垂直カットを作成します。 </li><li>完全に組織、警察官を切除組織を解放する水平カットの作成、右目の下へ、左眼の下から針をk個。カットはEAD外植片における外胚葉と内胚葉の両方を含む、前腸に胚の外側から拡張することができます。代わりに、浅いカットは外胚葉のみのEAD移植のために使用することができます。 EAD組織が除去されると、ちょうど目（上から下）は、以下にセメント腺からストレッチ、前腸への胚の外側から長方形の穴があるはずです。穴は、右眼（左右に）の内側の境界線に、左眼の内側の境界から拡張する必要があります。 図2Bbはを参照してください。 </li><li>そっと針の先端の切除組織を押して、ホスト胚を含む皿の部分にバッファを介して持ち上げます。表面の空気に組織をさらさないでください、またはそれが破損します。 </li><li>ドナーに関しては、宿主胚と同じ組織を切除する。ホストEAD外植片を廃棄するか、inserに保存相互の移植のために、ドナーの顔をトン。 </li><li> ＃45分の5ピンセットを用いて結果の上位穴にドナー外植片を挿入します。 </li><li>ドナー組織が ​​正しい位置に完全に挿入されると、慎重に所定の位置に移植を保持するために、胚の顔の上に（ 図1と図2BCを参照）は、ガラスの橋を置く。橋の両端が所定の位置に保持している、粘土に挿入する必要があります。ブリッジは優しく移植は、それが頭から突き出またはディープヘッド内にあることなく、ホストヘッドと面一に位置するように移植された組織に圧力を適用する必要があります。頭が少しカバースリップにより平坦ますが、あまりにも多くの圧力で胚を傷つけないように注意してくださいすることができます。移植は5分以内に行われるべきである。 注：経験のある研究者は2〜3時間かけて、実験あたり約20の移植を行うことができます。この期間中の胚は、ステージ20〜22から進行する。顔面移植を完了ステージ21または22のSは、アウトカムに影響を与えません。 （ステージ22〜26時）以降の移植が行われますが、クレスト·フリーEADの正中領域が顔に頭蓋神経堤移動するときに狭くなるようにより困難であることができます。移植間の一貫性が重要です。 </li></ol> 6。顔面移植手術後の回復<ol><li>治癒は一般的に2〜3時間かかります。ガラスの橋が所定の位置に、ドナー組織を保持しているとの粘土凹部に邪魔されずに、室温での胚のままにしておきます。 </li><li>移植が治癒した後、慎重に、ガラスの橋を削除ピンセットを用いて胚のベース付近から粘土を削除し、プラスチックを使用して静かに彼らのくぼみから胚を真空トランスファーピペットを卒業した。 </li><li>半分ゲンタマイシンをクリーン0.1×MBSで満たされた適切に標識されたペトリ皿の中に胚を置く。 </li><li>彼らはステージ40に供給するオタマジャクシ段階に到達するまで、15℃または18℃での胚は、W、数日間成長鶏の顔の表現型を採点することができる。 <ol><li>ゲンタマイシンを0.1×MBS液を毎日交換する必要があり、デッド胚は、他の胚の汚染と死を防ぐために、速やかに削除する必要があります。 </li><li>口の中には、ステージ40に開口している。段階40〜41で、1が移植された組織は、その蛍光を表示して、所定の位置に癒さままであることを確認する必要があります。移植が時折落ちるので、1は、すべての得点の胚が所定の位置に、ドナー組織を持っていることを確認する必要があります。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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L., Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+development+of+cranial+sensory+ganglia+and+the+potentialities+of+their+component+cells+studied+in+quail-chick+chimeras.">The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras.</a> Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).</li><li>Kennedy, A., Dickinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Median+facial+clefts+in+Xenopus+laevis:+roles+of+retinoic+acid+signaling+and+homeobox+genes.">Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes.</a> Dev. 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著者らは、開示することは何もありません。

重要なステップと制限：EADの顔面移植の手順は時間であり、集中して作業。それは完璧に練習、着実に手や器用さを必要とします。顔面移植プロトコルは、効率的に組織を除去し、移植する研究者の能力に依存しています。 1ホストの顔を移植を挿入するためには長すぎるがかかる場合は、ホストの顔は収縮し、癒すために開始されます。鉗子は、微妙に顔領域を拡張するために使用す...

頭蓋顔面の先天性欠損症1〜2のメカニズムを理解するために、頭蓋顔面の開発における重要な組織とそのシグナル伝達の寄与が特定されなければならない。カエルアフリカツメガエル、外胚葉と内胚葉、直接3-4並置されている「エクストリーム前歯ドメイン」（EAD）、から口や鼻の穴の形を含む顔の一部では、。 EADはまた、顎や他の顔領域5を形成し 、頭蓋神経堤など、周囲の組織に影響を与えるために、シグナリング·センターとして機能します。組織が対応するホスト領域を除去した後に、ホスト胚にドナーから移植されている場合、EADの機能に寄与する遺伝子を同定するために、「顔面移植」技術は、開発されました。移植後、顔の発達を生じることは評価される。このように、機能の喪失（LOF）またはEAD内の特定の遺伝子のための機能（GOF）の利得の効果は、局部的に分析したところ、Hの残りの部分EADと体は、野生型組織から構成されている。野生型組織特異的遺伝子のグローバルLOFまたはGOFを有する胚に移植される移植逆数を行うことができる。移植は、しばしば、アフリカツメガエルおよびニワトリの試験6で用いられてきた。例えば、 アフリカツメガエルの移植が単純発生の神経誘導、レンズや神経の能力、および神経堤の移行7月10日に対処しています。ウズラ、ひよこキメラ移植は、前神経板、前方神経尾根、神経堤、および頭蓋骨11月14日の開発を分析しました。これは、この技術は、推定口5に基底膜形成の調節におけるWnt阻害剤Frzb1、クレセントための新たな役割を実証してきました。アフリカツメガエルにおける頭蓋顔面の開発研究のための最初の移植技術です。 アフリカツメガエル頭蓋顔面の開発の研究のための理想的なモデルです。胚が大きいように、外部の開発ND顔は、開発のマイクロマニピュレーションとイメージングを可能に容易に見ることができる。顔の開発の基礎となるメカニズムはカエルで行われた調査結果は、人間開発4,15-16への洞察を提供することを示し、保存され表示されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="559">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Pasteur pipette</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">14672-400</td>
			<td style="width:128px;">Lime Glass&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Size 5 3/4&#8217;&#8217;</td>
			<td style="width:128px;">Cotton Plugged</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:128px;">Disposable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:195px;">Graduated Transfer Pipette</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">VWR</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">16001-180</td>
			<td style="width:128px;">Disposable&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Polyethylene</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="100" rowspan="2" style="height:100px;width:195px;">#5/45 forceps</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools by Dupont medical</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">11251-35</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">Angled 45 degrees</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="81" rowspan="3" style="height:81px;width:195px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">11000-20</td>
			<td style="width:128px;">Straight; serrated tip</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Stainless Steel;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">20cm long</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Capillary Tubing (for needles)</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">FHC</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">30-30-1</td>
			<td style="width:128px;">Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">100mm each</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Cover slip&#160;</td>
			<td rowspan="4" style="width:101px;">VWR</td>
			<td style="width:136px;">48393 252&#160;</td>
			<td style="width:128px;">24x60mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">micro cover glass</td>
			<td style="width:136px;">or&#160;</td>
			<td style="width:128px;">or&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">(for glass bridges)</td>
			<td style="width:136px;">48393 230</td>
			<td style="width:128px;">24x40mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">No.1.5</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">F9378</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:195px;">Needle Puller&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">Needle Puller: discontinued Filament: FB300B</td>
			<td rowspan="3" style="width:128px;">The most similar, currently available&#160; needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:195px;">Model P-80</td>
			<td style="width:101px;">Flaming / Brown micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">(discontinued)</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Stereomicroscope</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Zeiss</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zeiss Stemi 1000</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:195px;">Stereomicroscope Lighting by Fostec</td>
			<td style="width:101px;">Fostec</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:128px;">Use a light box with 2 fiberoptic arms.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="81" rowspan="2" style="height:81px;width:195px;">Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">26018-17</td>
			<td style="width:128px;">Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;">Length: 17cm</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="101" rowspan="3" style="height:101px;width:195px;">Moria Nickel Plated Pin Holder</td>
			<td rowspan="3" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="3" style="width:136px;">26016-12</td>
			<td style="width:128px;">Jaw opening Diameter: 0 to 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:128px;">Length: 12cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:195px;">Tungsten Needles</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Fine Science Tools</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">10130-05</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;">0.125mm Rod diameter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:195px;">Van Aken Plastalina</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">Blick&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:136px;">#33268-2981</td>
			<td rowspan="2" style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Modeling Clay- white, red or yellow</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">mMessage mMashine SP6 or T7 Kit</td>
			<td style="width:101px;">Ambion</td>
			<td style="width:136px;">AM1340</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

facial transplants in xenopus laevis embryos

頭蓋顔面の先天性欠損症は、すべて700出生のうち1つで発生したが、病因はほとんどのため、頭蓋顔面の開発の限られた理解に知られていない。シグナル伝達経路や組織が ​​発達顔のパターン形成中に行動する場所を特定するには、「顔面移植」技術はカエルアフリカツメガエルの胚で開発された。推定ティッシュ（「エクストリーム前方ドメイン」（EAD））の領域は、尾芽段階でドナー胚から除去され、同等の領域が除去された同じステージの宿主胚に移植する。これは、ホストまたはドナー組織は遺伝子機能の損失又は利得を有し、および/または系統標識を含むキメラ面を生成するために使用することができる。顔領域を容易に大規模であり、次のように治癒した後、現像の結果を監視し、ドナー又は周囲の宿主組織内シグナル伝達経路の役割を示している。 アフリカツメガエルは 、顔の開発のための貴重なモデルであるマイクロマニピュレーション用ccessible。多くの胚は、開発が急速に起こるため、短い期間にわたって、アッセイすることができる。頭蓋顔面のプロセスは、アフリカツメガエルと哺乳類の間で保存現れるので、カエルでの調査結果は、人間開発に関連している。

図3Aに示すように、移植された組織は、完全に移植後に宿主ヘッド内に挿入されるべきであり、 図2BCに示すように、ガラスブリッジは、適宜、胚の顔の上に配置されている。移植を成功させるために移植されたドナー組織が正しく、ホストオープニングサイズにする必要があります。 図3B及び3Cに見られるようにEAD組織は、どのような方法?...

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Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

アフリカツメガエル胚の間の顔の組織が ​​開発された「エクストリーム前部ドメイン」移植する技術。組織は、頭蓋顔面および開発のための顔領域間の相互作用をシグナリングするための地域の要件の研究を可能にする、別に1つの遺伝子発現のバックグラウンドを移動させることができる。

顔面移植<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

facial-transplants-in-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

10.1K ビュー.  Harvard University.  アフリカツメガエル胚の間の顔の組織が ​​開発された「エクストリーム前部ドメイン」移植する技術。組織は、頭蓋顔面および開発のための顔領域間の相互作用をシグナリングするための地域の要件の研究を可能にする、別に1つの遺伝子発現のバックグラウンドを移動させることができる。 

ビデオ: Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

アフリカツメガエルの胚および細胞接着アッセイのアセンブリから主催し、動物極の外植片の解剖

生物学

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

プラスチック製の埋め込みとアフリカツメガエル胚のセクショニング

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

アフリカツメガエル女性から卵子を入手

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

アフリカツメガエル卵抽出物の調製と分画

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

アフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクション

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

でアニマルキャップの移植（ACT）アッセイを用いて組織の決定アフリカツメガエル</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

トランスジェニックの生産アフリカツメガエル制限酵素を介した統合と核移植によって

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

の解剖<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;神経堤のため<em&gt; in vitroで</em&gt;外植片培養又は<em&gt; in vivoで</em&gt;移植

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

で微小管ダイナミクスを測定するためにplusTipTrackerソフトウェアを使用した<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;成長円錐

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...