Cell Seeding and Transfection on Electron Microscopy (EM) Grids for Cryotomography

細胞播種を開始するには、機械的または酵素的方法を使用して細胞を剥離した後、細胞をカウントします。マイクロピペットを使用して、気泡を避けながら、あらかじめ準備された電子顕微鏡グリッドを含む6枚のウェルプレートに、計算されたウェルあたりの細胞数を追加します。ウェルあたり1.5〜2.0ミリリットルの細胞懸濁液を維持するようにしてください。

HIV分子クローンのトランスフェクションでは、細胞を摂氏37度で16〜24時間インキュベートします。50マイクロリットルの無血清DMEMと1マイクログラムのDNAを清潔なマイクロ遠心チューブに加えます。それぞれについて、3マイクロリットルのトランスフェクション試薬を無血清DMEMで十分に希釈し、別の清潔なマイクロ遠心チューブに入れます。

マイクロピペットを使用して混合物を別々に均質化します。次に、トランスフェクション試薬混合物をマイクロピペットを介してDNA混合物に加え、室温で15分間インキュベートします。その後、100マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加え、DNA混合物をグリッド上の各ウェルに直接滴下します。

トランスフェクションの16〜24時間後に増殖培地を交換してください。顕微鏡および蛍光顕微鏡のようなコトランスフェクション段階の24時間後には、すべてのグリッドでカーボン層の裂け目が最小限に抑えられていることが示されました。モックグリッドとコトランスフェクションされたグリッドの両方のセルには、複数のグリッドの正方形に生存可能なセルが含まれていました。