このプロトコルを使用すると、特定のタンパク質のユビキチン化形態を哺乳類細胞から効率的に精製することができ、タンパク質機能の調節におけるユビキチン化の役割に関する研究が容易になります。哺乳動物細胞におけるユビキチン化タンパク質の精製は、in vitroでの精製と比較して、より多くの放射線条件下で標的タンパク質のユビキチン結合様式を保持する。まず、15ミリリットルの遠心分離管3本に1.5ミリリットルの還元血清培地を加えます。
トランスフェクション可能なプラスミドDNAを各チューブに加え、0.2マイクログラムの緑色蛍光タンパク質プラスミドを加えてトランスフェクション効率をモニタリングします。78マイクロリットルのリポソームトランスフェクション試薬を別の遠沈管の4.5ミリリットルの還元血清培地に加え、リポソームを希釈します。チューブをフリックして完全に混合し、室温で5分間放置します。
1.5ミリリットルの希釈DNA溶液を含む各チューブに1.5ミリリットルの希釈リポソーム溶液を追加します。プラスミドを室温で少なくとも20分間完全に混合し、リポソームと架橋します。ペトリ皿から元の培地を廃棄し、9ミリリットルの還元血清培地を各皿に加えます。
3ミリリットルのリポソームDNA混合物を加え、プレートを前後に3回、次に左右に3回穏やかに振って溶液を混合し、プレート上に混合物を均等に分配します。加湿インキュベーター内の細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素で培養します。4〜6時間後に培地を交換し、24〜36時間細胞培養を続けます。
24〜36時間後、細胞を最終濃度10マイクロモルのMG132で4〜6時間処理します。培地を廃棄し、氷冷PBSで細胞を2回洗浄します。皿に1ミリリットルのPBSを加えます。
きれいなスクレーパーで細胞をこすって細胞を取り除き、細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移します。700Gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収した。プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した800マイクロリットルの氷冷FLAG溶解バッファーを各チューブの細胞に加えます。
ボルテックスオシレーターまたはピペットガンを使用して細胞を混合し、ローテーター上で摂氏4度で30分間インキュベートします。各パルスが1秒間続く氷上で混合物を超音波処理し、混合物を5〜10回の短いパルスにさらします。混合物をローテーター上で40 RPMで摂氏4度で30分間インキュベートします。
次に、8, 000 Gで超音波処理されたサンプルを摂氏4度で20〜30分間遠心分離します。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。80マイクロリットルの細胞抽出物を分注し、20マイクロリットルの5X SDSローディングバッファーと混合します。
サンプルを摂氏98度で5分間煮沸します。氷上で2分間冷やし、使用するまでマイナス20°Cで保管してください。これらのサンプルを入力グループとして使用して、タンパク質発現をモニターします。
次に、残りの細胞抽出液に30マイクロリットルの抗FLAG M2抗体結合ビーズを加え、ローテーター上で摂氏4度で少なくとも4時間または一晩インキュベートします。ビーズを集めるために摂氏4度で2分間1, 500 gで遠心分離します。1ミリリットルの氷冷FLAG溶解バッファーをビーズに加え、チューブを数回反転させて混合します。
この手順を4〜6回繰り返してから、40マイクロリットルのFLAGペプチドを最終濃度200ナノグラム/マイクロリットルでビーズに加えます。前に示したようにローテーターで2時間インキュベートし、同じ温度で遠心分離します。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、10マイクロリットルの5X SDSローディングバッファーを追加します。
混合物を摂氏98度で5分間煮沸し、次に氷上で2分間冷却します。1ミリリットルの氷冷PBSをセルペレットに加え、均一に混合します。細胞懸濁液100マイクロリットルを投入試料としてマイクロ遠心チューブに分注し、700Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収した。
80マイクロリットルのFLAG溶解バッファーを投入サンプルに加え、前に示したようにボルテックス発振器を使用して細胞を混合します。細胞を氷上で1時間溶解し、その後20〜30分間再び遠心分離します。遠心分離後、80マイクロリットルの上清を新しいマイクロ遠心チューブに分注し、20マイクロリットルの5X SDSローディングバッファーを上清に加えます。
混合物を摂氏98度で5〜10分間沸騰させてから、氷上で2分間冷却します。残りの900マイクロリットルの細胞懸濁液を700Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞ペレットを回収した。細胞ペレットに1ミリリットルのユビキチンバッファー1を加え、細胞を均等に分配するために数回上下にピペッティングして混合する。
溶液がもはや粘性でなくなるまで、氷上で超音波の10〜20ラウンドに細胞溶解物をさらし、次いで溶液を遠心分離する。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移し、30マイクロリットルのニッケル仕込み樹脂を上清に加えます。ローテーターで15 RPMで4時間、または室温で一晩インキュベートしてから、2分間遠心分離します。
遠心分離後、ビーズを集め、それに1ミリリットルのユビキチンバッファー1を加える。前に示したように、振とう機で室温で10分間回転させてインキュベートし、次に1, 500 Gで2分間再び遠心分離します。1ミリリットルのユビキチンバッファー2をビーズに加え、前に示したようにインキュベーションとそれに続く遠心分離を行い、ビーズを回収します。
この手順を一度繰り返します。次に、1ミリリットルのPBSをビーズに加え、インキュベーションと遠心分離と同じ手順に従ってビーズを収集します。この手順をもう一度繰り返します。
ビーズを40マイクロリットルのイミダゾールと最終濃度0.5モルで室温で1時間インキュベートすることにより、結合タンパク質を溶出します。インキュベーション後、1, 500 Gで2分間再び遠心分離します。上清を清潔な微量遠心チューブに移し、10マイクロリットルの5X SDSローディングバッファーを追加します。
溶液を摂氏98度で5分間煮沸し、次に氷上で2分間冷却します。SDS-PAGEでサンプルを分離し、ウェスタンブロッティングでニトロセルロースメンブレンに転写し、対応する抗体を使用して標的タンパク質を検出します。化学発光イメージングシステムを起動して、ウェスタンブロッティングからのシグナルを検出します。
ニトロセルロースメンブレンをカメラオブスクラに上向きに置きます。ピペットガンを使用して、メンブレン上に基質溶液を均一にエンコードします。最後に、自動露光手順を選択して化学発光信号をキャプチャし、理想的な信号が得られるまで露光時間を手動で調整します。
ユビキチン化p53を含む全p53タンパク質を、非変性条件下でH1299細胞からFLAG M2ビーズで免疫沈降した。溶出液を、抗p53および抗ヘマグルチニン、または抗p53およびモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティングに供した。ここで、粗細胞抽出液または投入物を、抗p53および抗MDM2モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティングに供した。
これらの細胞でMDM2を異所的に発現させると、低分子量から高分子への塗抹バンドとして現れるユビキチン化p53タンパク質からのシグナルが著しく増加しました。この結果は、ユビキチン化p53タンパク質が細胞から効果的に精製されていることを示唆している。次に、変性条件下で細胞を溶解した。
細胞ユビキチン化された全タンパク質をニッケル荷電樹脂でプルダウンし、抗p53および抗ヘマグルチニンモノクローナル抗体によるウェスタンブロッティングにかけました。ユビキチン化p53タンパク質は、抗p53抗体および抗ヘマグルチニン抗体を用いて検出した。ここで粗細胞抽出液または投入物にて、抗p53および抗MDM2モノクローナル抗体によるウエスタンブロッティングを行った。
結果は、ユビキチン化タンパク質の総レベルは変化しなかったが、MDM2がこれらの細胞で過剰発現された後、ユビキチン化p53タンパク質レベルが劇的に増加したことを示した。これは、ユビキチン化p53を含むユビキチンタンパク質全体が、変性条件下で細胞溶解物から効果的に引き下げられたことを示しています。この手順を試みるときは、細胞収集の前にMG132で細胞を処理し、ユビキチン化タンパク質の精製のために氷上で細胞を適切に超音波処理することを忘れないでください。
