まず、ラットの骨格筋線維をTMREと室温で20分間インキュベートします。次に、共焦点顕微鏡の標準ソフトウェアを起動し、構成フレームワークを選択します。[ハードウェア構成]ダイアログボックスで、[レーザー]を選択し、[ヘリウムネオン543]オプションをオンにします。
取得フレームワークから取得ダイアログボックスにアクセスし、XYZパネルを選択します。次に、512ヘルツの速度で512x400形式を選択します。表示されたピンホールパネルの下で、任意の単位を選択し、ピンホールの面積を3つ入力します。
Bean パス設定ダイアログボックスで、開口数が 0.7 で、発光波長ウィンドウが 576 から 700 ナノメートルの 20 x 水浸対物レンズを選択します。DD 488543を選択し、543 レーザーのレーザー出力を 15% に設定します20 分間のインキュベーション後、インキュベーション培地を 2 回交換します。次に、0.15ミリのケイ酸ホウ素ガラスカバースリップで記録室を準備します。
繊維束を200マイクロリットルの緩和溶液が入ったチャンバーに移します。共焦点顕微鏡の明視野モードを利用して、ミトコンドリアの蛍光記録に有効な繊維を同定します。調整、ゲイン、オフセットは、ライブボタンを使用して蛍光をスキャンします。
バックグラウンドがほぼゼロの任意の単位と、100〜200の任意の単位のミトコンドリアシグナルには、低い蛍光強度値を選択します。150 から 190 ナノメートルのピクセルサイズを選択し、XY ダイアログボックスでズーム倍率を調整して、ファイバーの全幅を取得します。「Z スタック」(Z stack) ダイアログボックスで、繊維の深さ 15 マイクロメートルから 22 マイクロメートルまでの Z 距離を設定し、3 マイクロメートルの Z ステップサイズを選択します。
[開始]ボタンをクリックして共焦点画像を取得し、15、18、21マイクロメートルの深さで取得した3つの共焦点画像で構成されるZスタックを取得します。運動した除脂肪ラップ筋線維の共焦点画像は、一貫した線維パターンを持つ骨格筋線維ミトコンドリアの予想される記録を示しています。対照的に、肥満ラットの筋線維は、ミトコンドリアの含有量と分布に実質的な変化を示します。
