CRISPR/Cas9を介した CENP-E ノックアウトHeLa細胞の染色体調製および核型解析

まず、野生型とCENP-E変異体HeLa細胞を培養し、300ナノモルのコルヒチンを添加してから5時間インキュベートします。次に、細胞を0.25%トリプシン-EDTAと摂氏37度で3分間インキュベートし、細胞を1.5ミリリットルの遠心分離管に集めます。次に、細胞を室温で1000Gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、1.2ミリリットルの0.075モル塩化カリウム溶液を添加する。

細胞を摂氏37度で20分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、細胞を遠心分離し、上清を捨て、0.2ミリリットルの固定液をプリフィクス用に加えます。1分間穏やかに混合した後、前述のように細胞ペレットを回収し、室温で10分間1.5ミリリットルの固定液を加えます。

細胞を遠心分離し、上清を廃棄した後、0.6ミリリットルの固定液を加えて細胞懸濁液を作製します。35〜40センチメートルの細胞懸濁液を3〜5滴慎重に氷のスライドに落とします。すぐにアルコールランプを使用してスライドを乾燥させ、10%Giemsaの持続液で7分間染色します。

スライドを流水で2分間すすぎ、Plan Fluor 40倍倍倍0.75開口数対物レンズを装着した光学顕微鏡でサンプルを検査します。核型解析により、CENP-E変異体HeLa細胞の染色体数は野生型細胞と比較して減少していることが明らかになりました。