CRISPR/Cas9遺伝子は、特に比較的に、弱い電気魚の遺伝子編集を可能にし、特定の遺伝子および遺伝的差異が表皮変動にどのように寄与するかについての仮説をテストすることを可能にする。CRISPR/Cas9は、変異型F-ゼロ胚を生成するための効率的な方法です。このプロトコルは、研究者が弱く進化した2種の弱い電気魚のCRISPR-Cas9操作を行うことを可能にする。
他の電気魚や他の魚種のいくつかの変更でこのアプローチを使用する鍵は、sgRNAを作るためにトランスクリプトームまたはゲノムリソースの可用性です。マイクロインジェクションを実行し、2D 平面内の 3D 位置にあるセルを視覚化するのは困難な場合があります。卵のための小さなゼブラフィッシュコロニーを取得し、一般的なマイクロインジェクション技術を実践します。
サヴァス・コンスタンティノウとの手順を実証することは、私の研究室の技術者であるジャレッド・トンプソンです。適切な繁殖条件下で関心のある魚種を収容した後、グラビドに見える雌の魚を特定します。B.gauderioでは、女性は通気孔にちょうど尾を行く腫れた生殖腺を持つことになります。
B.強発症の女性は腹が腫れ、深い体に見えます。麻酔投与後、十分な混合を伴うPCRチューブ中のDPBSの4倍の体積に産卵剤を添加する。ソリューションは曇りになります。
ピペットを使用して計算された線量を測定し、希釈剤を熱可塑性樹脂の一部に分配してから、溶液を28ゲージ19〜25ミリリットルのベベリング針を装備した精密ガラス注射器に引き込みます。滑らかな速度で後尻の体幹の筋肉に溶液を注入し、針は除去する前に2〜4秒間座らせます。その後、すぐに回復のために新鮮なシステムの水に魚を置きます。
B.gauderio精子コレクションの場合、24時間後、大きな雄の魚を選択し、セデーション後できるだけ早く、特に頭とベントの周りに魚を徹底的に乾燥させます。乾燥した魚の腹側を上に置き、適切なホルダーの左に前部、可能な限りテーブルと平行に頭でMS222浸した湿ったペーパータオルで覆う。すぐに口内に向かって生殖腺の上に光を絞り、先端を備えたマイクロピペッタを使用して、尾道方向に尾道方向に圧力をかけ、50マイクロリットル単位で男性から絞られる精子を慎重に収集する。
氷上の精子エクステンダー溶液の500マイクロリットルの量に直接精子のアリコートを追加します。収集直後に、魚をスライムコート保護製品処理された淡水に入れます。B.gauderioの卵のコレクションの場合、麻酔付きのB.gauderio雌の魚を乾燥させた後、すぐに頭を非支配的な手に向けて横に置き、通気孔に向かってゴナドの上に軽く圧迫する内側の内側に雄大な方向に圧力をかける。
ポリテトラフルオロエチレンツールを使用して、クロアカから絞った卵を慎重に収集し、すぐに小さな覆われたペトリ皿に卵を入れます。絞った後に一人で作業する場合は、卵塊を小さなペトリ皿の基部に触れ、メスから追放します。卵を採取した直後に、魚をスライムコート保護製品処理された淡水に入れます。
B.gauderio in vitro受精の場合は、卵質量の上に直接よく混合された精子SES溶液の100マイクロリットルを加え、続いて1ミリリットルの淡水を加えます。0.22マイクロメートルの細孔濾過システム水を細胞に加える前に、30〜60秒間十分にアテとの懸濁液を混ぜます。体外受精時間で皿にラベルを付け、皿を摂氏29度のインキュベーターに入れ、開発の進捗状況を確認するために50分のタイマーを設定します。
受精期間中、マイクロローダーピペットチップを使用して、目的の注射液の2マイクロリットルをマイクロインジェクションニードルにバックロードし、できるだけ先端に近い液体を排出します。少なくとも1つの細胞の動物の棒で単一の細胞が形成された場合、解剖顕微鏡の下で皿を移し、針のテーパーが剛性を示し始めるところに向かって斜めの角度で針の先端を壊すために細かい鉗子のペアを使用する。針のボアは、硬いテーパーを維持しながら、できるだけ小さくする必要があります。
顕微鏡下で現像する接合体を特定し、切りチップ付きのプラスチックトランスファーピペットを使用して、ペトリ皿の反転した上部に設定されたガラス顕微鏡スライドの端にできるだけ少ない水に10〜20個の卵を入れます。繊細な作業拭き取りを使用して、スライドを軽く押して余分な水を取り除き、卵がスライドの端にしっかりと付着できるようにします。水はスライドの下で邪悪になり、エッジに対して卵を引っ張ります。
注入中の卵の動きを避けるために、少し立っている水分を維持しながら、卵を湿らせた保つためにちょうど十分な水があるはずです。卵をスライドに垂直に、接近針に垂直に合わせ、マイクロマニピュレーターを使用して針をチョリオンに対して配置します。次に、針を約45度の角度で保持し、最初に先端をコリヨンに挿入し、次に単一の細胞に挿入し、可能であれば黄身を通して注入する。
注射中に細かい鉗子で壊れた卵を取り除きます。すべての卵が注入されたら、0.22マイクロメートルの細孔濾過システム水の噴出ボトルを使用して、注入段階から新しい100ミリメートル直径のペトリ皿に卵を静かに洗い流します。成功した短いガイドRNA選択および合成に続いて、インビトロ切断は単一細胞のマイクロインジェクションのための選択のためにテストすることができる。
PCRのクリーンアップとクローニングの後、この代表的な実験では、CRISPR-Cas9誘発突然変異が強力な電気臓器排出振幅低下を有する個々のB.gauderioおよびB.b.brachyistiusクローンで同定されたのに対し、未注入制御は参照された遺伝子型のみを示した。確認されたCRISPR変異体と薬剤サイズが未注入コントロールと一致する電気臓器排出振幅の可視化は、SCN-4 AA変異体B.brachyistusおよびB.gauderio胚の両方が制御よりも有意に低い電気臓器排出振幅を有することを実証した。マイクロ注射を行う場合は、できるだけ迅速かつ意図的に移動して、生存する単細胞注入胚の数を最大化します。
難しい卵で時間を無駄にしないでください。成功した突然変異体が同定されると、従来の繁殖方法は安定した突然変異線を作り出し、CRSPR関連のモザイク化の懸念を排除することができる。このプロトコルは、研究者が弱く進化した2種の弱い電気魚の機能検証と比較ゲノム研究を行うことを可能にする。
