まず、あらかじめ冷やしたヘラを使用して、100ミリグラムの植物組織粉末を階層化されたポリプロピレン微量遠心チューブに加えます。次に、すぐに1ミリリットルの20%メタノールをチューブに加えます。キャップ付きのチューブをロッキングシェーカーに室温で3時間置きます。
次に、チューブを9,464 Gで10分間遠心分離し、上清をLC-MSオートサンプラーバイアルに回収します。エレクトロスプレーイオン源と逆相HPLCカラムを備えたLC-MS装置をセットアップします。HPLCの場合、溶媒Aとして水中の0.1%ギ酸を使用し、溶媒Bとしてアセトニトリル中の0.1%ギ酸を使用し、カラムオーブンの温度を摂氏45度に、流量を毎分0.5ミリリットルに調整します。
カラムを99%Aおよび1%Bで平衡化し、溶媒B濃度が26分で1%から50%に増加するように30分間のグラジエントを設定し、26.01分で急速に1%Bに戻り、4分間保持します。質量分析計の動作パラメータを設定します。
インターフェース電圧を4キロボルトに、噴霧ガス流量を毎分3リットルに、加熱ガス流量を毎分10リットルに設定します。脱溶媒ラインの温度を摂氏250度に、ヒートブロックの温度を摂氏400度に、界面温度を摂氏300度に調整します。乾燥ガス流量を毎分10リットル、衝突解離ガス圧力を17キロパスカルに設定します。
エレクトロスプレーイオン化源ポジティブモードでMSメソッドを構築し、100〜1、000ダルトンの質量範囲をカバーするQ3スキャンとQ1スキャンの両方を含め、Q1スキャンは自動同位体排除の調査イベントとして機能します。50 対 1, 000 ダルトンの質量ウィンドウ、マイナス 20 ボルトの衝突セルエネルギー、0.2 秒未満のイベント時間で、Q1 スキャンにプロダクトイオンスキャンリンクを追加します。次に、MS 分析法を調整して、衝突セルエネルギーがマイナス 20 ボルト、イベント時間が 0.75 秒の LC 分析法の長さに等しいポジティブモードのプリカーサーイオンスキャンを追加します。
いずれの場合も、自動同位体排除機能または脱同位体機能が有効になっていることを確認してください。モノリプレイス、ジリプレイスド、およびトリサブレートトロパンアルカロイドフラグメントのマスターチャージ値を設定します。次に、MS-MS法に、LC法の長さに等しいポジティブモードのニュートラルロススキャンを追加し、コリジョンセルエネルギーをマイナス20ボルト、イベント時間を0.75秒にします。
いずれの場合も、自動同位体排除機能または同位体脱同体機能が有効になっていることを確認してください。チグリ酸エステル、アセチル基、フェニルラクティック酸エステルまたはトロピック酸エステル由来のエステルについて、トロパンアルカロイド上のエステルの目的の中性損失質量を設定します。LC-MS メソッドをダウンロードし、目的のサンプルのデータファイルを作成します。
HPLCカラムが摂氏45度で平衡化されたら、10〜20マイクロリットルのサンプルを注入します。
