まず、最新バージョンのフィジーをコンピューターにダウンロードしてインストールします。convert_to_TIFFをダウンロードした後。py スクリプトを実行し、スクリプトをフィジーにドラッグアンドドロップしてコードを実行します。
実験が保存されているパスを参照します。変換されたTIFFファイルは、同じ実験フォルダ内に作成されます。[プラグイン]、[3D Suite]の順にクリックし、3Dマネージャーオプションを開きます。
[3D マネージャー] ウィンドウで、体積 (単位)、平均グレー値、境界ボックス (ピクセル)、標準偏差グレー値、重心 (ピクセル)、および重心 (単位) に対応するチェックボックスをオンにします。チェックマークを付けます エッジ上のオブジェクトを除外する XYとエッジ上のオブジェクトを除外する Z.次に、[OK]をクリックします。ヒトTリンパ球の蛍光画像を開きます。
「Shift D」をコントロールして、スタックを含むタンパク質チャネルを複製します。[ハイパースタック]チェックボックスをオンにします。チャネルボックス内で適切なチャネル番号を指定し、それに応じて名前を変更します。
フィジーマクロレコーダーを起動するには、プラグインに移動してからマクロに移動し、[記録]を選択します。次に、FindFoci プラグインを開くには、プラグイン GDSC、FindFoci、および FindFoci GUI を順番にクリックします。画像のドロップダウンメニューから、分析する画像を選択します。
ガウスぼかしを 1.5 に、背景法を平均値より上の標準偏差に、背景パラメーターを 9 に、検索方法をピーク背景の割合に、検索パラメーターを 0.7 に、ピーク法を背景より上に相対的に、ピーク パラメーターを 0.2 に、最小サイズを 5 に設定します。最大ピークを高い数値に設定して、画像内のすべての焦点を含めます。焦点の識別を強化するには、ガウスぼかしを焦点の直径に近づけて調整し、背景パラメーターの値を大きくして、より厳しいしきい値を課します。
次に、蛍光ピークから遠い領域を含めるように検索パラメーターの値を減らし、ピークの分離のためにピークパラメーターの値を減らします。FindFoci を実行し、レコーダー ウィンドウに表示される文字列をコピーします。文字列には、引用符を除く、選択したパラメータが含まれます。
nuclear_prod_q. pyスクリプトをダウンロードしたら、スクリプトをフィジーにドラッグアンドドロップし、[実行]をクリックしてコードを実行します。核チャネルに、DAPI のチャネルに対応する番号を入力します。
[nucleus Gaussian blur] に、セグメンテーションのためにイメージをぼかすために必要な sigma の値を入力します。次に、タンパク質チャネルの目的の染色のチャネルに対応する番号を入力します。[FindFoci] パラメーターに、選択したパラメーターのマクロ記録を表す文字列を貼り付けます。
ビジュアルチェックボックスにチェックを入れ、[参照]をクリックして、画像が保存されているディレクトリを選択します。すべてのボックスがコンパイルされたら、[OK] をクリックして実行を続行します。ROI manager 3D ウィンドウの ROI リストから、核チャネルを選択し、live ROI to on をクリックします。
同じ核に属するROIを選択し、mergeを押します。また、望ましくない原子核の場合は、Deleteキーを押します。再度、live ROI をクリックして on にし、すべてを選択して、すべての nucle が正しくセグメント化されていることを確認します。
定量化フォルダから、分析に使用したパラメータのレコードを含むTXTファイルを開きます。ブラウザでGoogle Colabを開きます。次に、ファイルから [ノートブックを開く] を選択し、最終的な核タンパク質メトリクスをアップロードします。
ipynb スクリプト。各画像フィールドのCSVファイルを含むすべてのフォルダを、Googleドライブの任意のフォルダにアップロードします。ノートブックで、結果サブフォルダーが格納されているフォルダーのパスを指定し、すべてのセルを実行します。
コードのコンパイルが完了したら、コンパイルされたすべてのデータを含む最終的なスプレッドシート ファイルを開きます。
