Si ringrazia l'assistenza scientifica e tecnica dell'INGM Imaging Facility, in particolare di C. Cordiglieri e A. Fasciani, e dell'INGM FACS sorting facility in particolare M.C Crosti (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM), Milano, Italia). Ringraziamo M. Giannaccari per il suo supporto tecnico informatico. Questo lavoro è stato finanziato dai seguenti grant: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321) e Fondazione AIRC (grant nr MFAG 29165) a F.M. Ricerca Finalizzata, (grant nr GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (grant nr 2022 27066), Fondazione Cariplo (grant nr 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018), Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (grant nr G43C22002620007) e Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (grant nr 2022PKF9S) a B. B.

L'utilizzo di campioni umani a fini di ricerca è stato approvato dai Comitati Etici della Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Milano) ed è stato ottenuto il consenso informato di tutti i soggetti (numeri di autorizzazione: 708_2020). Il protocollo è organizzato in tre sezioni principali: esecuzione dell'immunofluorescenza, acquisizione delle immagini e analisi delle immagini. In media, richiede 4 giorni lavorativi per essere completato (Figura 1).
1. Preparazione all'immunofluorescenza
NOTA: Questo protocollo di immunofluorescenza può essere facilmente personalizzato per vari tipi di cellule e bersagli proteici regolando le condizioni di fissazione e permeabilizzazione. La preparazione dell'immunofluorescenza richiede in genere meno di 3 giorni per essere completata, con la durata dell'incubazione degli anticorpi primari che varia in base alla qualità dell'anticorpo e alla proteina bersaglio (Figura 1).
<ol><li>Preparazione del campione<ol><li>Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) attraverso una centrifugazione in gradiente di densità tramite un terreno di circa 1,077 g/mL di densità secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).</li>
		<li>Isolare le cellule T CD4+ dalle PBMC con microsfere magnetiche, seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).</li>
		<li>Colorare le cellule con anticorpi per CD4, CD45RA e CD45RO (Tabella dei materiali) e procedere con la selezione FACS delle cellule T CD4+ naive come cellule CD4+/CD45RA+/CD45RO-, come descritto altrove29,30. NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per le specifiche dello smistatore FACS utilizzato in questo protocollo.</li>
		<li>Indurre la differenziazione delle cellule T CD4+ naive in T helper 1 (cellule TH1 CD4+ ) come descritto in 29. In breve, coltivare 1,5 x 106 cellule/mL di cellule T CD4+ naive selezionate FACS in terreno TH1 stimolandole con biglie magnetiche anti-CD3/anti-CD28 in un rapporto 1:1. Contare le cellule e dividerle quando raggiungono 1,5 × 106 cellule/mL ogni 2-3 giorni (vedere la Tabella 1 per la composizione del terreno TH1).</li>
		<li>Valutare la secrezione di citochine con funzione effettrice dopo 7 giorni di differenziazione, come descritto in 29.</li>
	</ol></li>
	<li>Fissazione e permeabilizzazione cellulare NOTA: Tutte queste procedure sono state descritte in 30,31 con piccoli adattamenti.<ol><li>Per garantire un'adesione ottimale delle celle, trattare i vetrini coprioggetti in vetro (10 mm, spessore 1,5 H) con una soluzione di rivestimento (Tabella 1) come segue:<ol><li>Pulire i vetrini coprioggetti lavandoli inizialmente con acqua distillata (ddH2O), quindi con un risciacquo con etanolo al 70% (EtOH) e lasciandoli asciugare all'aria.</li>
			<li>Posizionare i vetrini coprioggetti lavati in una piastra a 24 pozzetti per i passaggi 1.2.1.3-1.3.</li>
			<li>Applicare una goccia di 200 μl di soluzione di rivestimento sul vetrino coprioggetti. Dopo 5 minuti, rimuovere la goccia e lasciarla asciugare all'aria.</li>
			<li>Lavare i vetrini coprioggetti applicando una goccia di 200 μL di ddH2O. Dopo 5 minuti, rimuovere la goccia e asciugare all'aria.</li>
			<li>Ripetere 3 passaggi 1.2.1.3-1.2.1.4.</li>
		</ol></li>
		<li>Risospendere le cellule T CD4+ naive e le cellule TH1 CD4+ in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a una concentrazione di 2 × 106 cellule/mL. NOTA: La concentrazione indicata è consigliata specificamente per le piccole cellule come i linfociti T primari umani. Per le celle aderenti, il trattamento di rivestimento del vetro non è necessario. Procedere invece direttamente con la crescita delle cellule sulla superficie di vetro utilizzando il terreno di coltura cellulare appropriato.</li>
		<li>Applicare una goccia di 200 μl della sospensione cellulare sul vetrino coprivetro. Lasciare seminare le cellule a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti; Quindi, rimuovi la goccia.</li>
		<li>Fissare le cellule con paraformaldeide al 3% appena filtrata (soluzione PFA, Tabella 1) per 10 minuti a RT.</li>
		<li>Lavare il vetrino coprioggetti in vetro con TPBS (Tabella 1) per 3 x 5 minuti a RT.</li>
		<li>Rimuovere il TPBS e aggiungere la soluzione di permeabilizzazione (Tabella 1) per 10 minuti a RT.</li>
		<li>Scartare la soluzione di permeabilizzazione e incubare il campione nella soluzione di conservazione (Tabella 1) da 1 ora a una notte (ON) a 4 °C. NOTA: In questa fase, il protocollo può essere interrotto in sicurezza e i vetrini di copertura possono essere conservati in soluzione di conservazione in una piastra da 24 pozzetti per 3-4 settimane.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescenza<ol><li>(Facoltativo) Rimuovere il vetrino coprioggetti dalla piastra a 24 multipozzetti e congelare rapidamente su ghiaccio secco per 30 secondi, scongelare a RT, quindi lavare il vetrino coprioggetti in un pozzetto preriempito con soluzione di conservazione.</li>
		<li>(Facoltativo) Ripetere 3 passaggi 1.3.1.</li>
		<li>Lavare in soluzione di permeabilizzazione per 5 minuti a RT. Quindi, lavare per 2 x 5 minuti con TPBS a RT.</li>
		<li>Incubare in HCl 0,1 N per 12 minuti a RT.</li>
		<li>Eseguire due lavaggi rapidi in 1x PBS. NOTA: Le condizioni di permeabilizzazione cellulare specificate, comprese le fasi di congelamento e disgelo e il trattamento con HCl, sono ottimali per la colorazione dei componenti nucleari in cellule caratterizzate da cromatina densamente impacchettata. Tuttavia, quando si ha a che fare con celle caratterizzate da cromatina meno compatta, è consigliabile ridurre o evitare questi passaggi. Inoltre, per mirare ai componenti citoplasmatici, considerare la riduzione o l'eliminazione del trattamento con HCl.</li>
		<li>Incubare le cellule con l'anticorpo primario (BRD4, 1:500, o SUZ12, 1:100) diluito in tampone di diluizione anticorpale (Tabella 1) (200 μl per ciascun vetrino coprioggetti) ON a 4 °C. NOTA: L'immunofluorescenza può essere eseguita multiplexando più di un anticorpo primario a seconda delle esigenze sperimentali, degli anticorpi secondari e dei sistemi di rilevamento.</li>
		<li>Lavare 3 x 5 minuti con PBS-T (Tabella 1) a RT con agitazione leggerre.</li>
		<li>Incubare le cellule con anticorpo secondario diluito in tampone di diluizione anticorpale (200 μl per ogni vetrino coprioggetti) per 1 ora a RT. NOTA: Scegliere l'anticorpo secondario più adatto alle esigenze sperimentali e ai sistemi di rilevamento disponibili. Assicurarsi che ogni anticorpo secondario sia destinato alla specie da cui deriva l'anticorpo primario. Inoltre, selezionare fluorofori compatibili con i filtri e la sorgente luminosa del microscopio. È fondamentale evitare la sovrapposizione spettrale tra il fluoroforo scelto e lo spettro di emissione della colorazione nucleare.</li>
		<li>Lavare 3 x 5 minuti con PBS-T a RT agitando leggermente.</li>
		<li>Colorante con 1 ng/mL di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluito in 1x PBS per 5 minuti a RT. NOTA: I coloranti alternativi possono essere utilizzati per la colorazione nucleare purché non si sovrappongano allo spettro di emissione degli anticorpi secondari.</li>
		<li>Eseguire diversi lavaggi rapidi in 1x PBS.</li>
		<li>Montare il vetrino coprioggetti su un vetrino per microscopia con mezzi di montaggio antisbiadimento.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Acquisizione delle immagini
NOTA: La durata dell'acquisizione dell'immagine dipende dallo strumento e dalle impostazioni selezionate.
<ol><li>Acquisizione al microscopio confocale<ol><li>Acquisisci immagini 3D utilizzando un microscopio confocale, impostando una dimensione del passo di 0,25 μm in z e una dimensione dei pixel di 0,1-0,2 μm. NOTA: Per ottenere una risoluzione ottimale limitata alla diffrazione della luce con il nostro obiettivo 63x 1.4 NA Oil, abbiamo impostato la dimensione del foro stenopeico a 0.8 UA, 2x la media della linea e la dimensione del fotogramma 1024 × 1024 pixel. Il laser di eccitazione e la sequenza di acquisizione del canale sono stati selezionati deliberatamente per evitare interferenze o diafonia tra i fluorofori utilizzati. Tuttavia, la regolazione dei parametri deve essere adattata alle caratteristiche specifiche del microscopio e del campione. Vedere la Tabella dei materiali per le specifiche del microscopio confocale utilizzato in questo protocollo.</li>
		<li>Acquisisci un numero costante di campi casuali per comprendere circa 50 cellule per replicato biologico.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analisi delle immagini
<ol><li>Installazione del software<ol><li>Scarica e installa l'ultima versione disponibile delle Figi dalla pagina di download ufficiale delle Figi (https://imagej.net/software/fiji/downloads).</li>
		<li>Installa 3D Suite tramite il sito di aggiornamento delle Figi o seguendo manualmente le istruzioni sul sito Web di 3D Suite (https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download).</li>
		<li>Installa GDSC (FindFoci) tramite il sito di aggiornamento delle Fiji o manualmente seguendo le istruzioni sul repository GitHub (https://github.com/aherbert/gdsc).</li>
	</ol></li>
	<li>Conversione TIFF<ol><li>Scaricare lo script "convert_to_TIFF.py" (File supplementare 1).</li>
		<li>Trascina e rilascia lo script su Fiji ed esegui il codice.</li>
		<li>Nel pannello visualizzato, passa al percorso in cui è memorizzato l'esperimento. La sottocartella contenente i file TIFF convertiti viene creata nella stessa cartella dell'esperimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Inizializza le impostazioni su 3D Manager.<ol><li>Apri il pannello delle opzioni di 3D Manager facendo clic su Plugin | 3DSuite | Opzioni di 3D Manager.</li>
		<li>All'interno della finestra delle opzioni di 3D Manager, selezionare le caselle di controllo corrispondenti alle seguenti misure: Volume (unità), Valore medio di grigio, Riquadro di delimitazione (pix), Valore di grigio Std Dev, Baricentro (pix) e Baricentro (unità).</li>
		<li>Selezionare le seguenti opzioni: Escludi oggetti sui bordi XY ed Escludi oggetti sui bordi Z e fare clic su OK. NOTA: questo passaggio deve essere eseguito una sola volta per configurare inizialmente le metriche che verranno memorizzate nei file di informazioni spaziali e quantitative. Le metriche selezionate sono essenziali per garantire il corretto funzionamento della pipeline. In questo passaggio è possibile includere metriche aggiuntive facoltative, come descritto in dettaglio nella sezione Discussione.</li>
	</ol></li>
	<li>Imposta i parametri sulla GUI di FindFoci. NOTA: questo passaggio deve essere eseguito una sola volta per configurare la pipeline semi-automatizzata con parametri ottimali, che verranno quindi incorporati negli script.<ol><li>Aprire l'immagine di prova. Duplicare il canale proteico, incluso lo stack (Ctrl + Maiusc + D), selezionare la casella di controllo hyperstack e specificare il numero di canale appropriato all'interno della casella Canali (c) e rinominarlo di conseguenza.</li>
		<li>Avvia il registratore di macro Fiji navigando su Plugin | Macro | Registrare.</li>
		<li>Apri il plugin FindFoci (clicca su Plugin | GDSC | TrovaFoci | FindFoci GUI) e selezionare l'immagine da analizzare dal menu a discesa "Immagine".</li>
		<li>Impostare i parametri come segue (Figura 2A): Sfocatura gaussiana = 1,5; metodo di sfondo = SD sopra la media; parametro di sfondo = 9; metodo di ricerca = frazione di picco - sfondo; parametro di ricerca = 0.7; metodo del picco = relativo sopra lo sfondo; parametro di picco = 0,2; dimensione minima = 5; Picchi massimi = 1.000.000. NOTA: I parametri indicati sono stati selezionati in base ai nostri casi di studio e potrebbero non essere adatti per altre procedure di colorazione.</li>
		<li>Per migliorare l'identificazione dei fuochi, regolare i seguenti parametri:<ol><li>La sfocatura gaussiana definisce l'entità dell'attenuazione per segmentare meglio i fuochi. Tienilo vicino al diametro dei fuochi (pixel).</li>
			<li>Il parametro di sfondo imposta una soglia per distinguere lo sfondo dal segnale dei fuochi. Aumentare i valori per imporre soglie più stringenti.</li>
			<li>Il parametro di ricerca definisce la percentuale di fluorescenza dal picco inclusa nel riconoscimento del segnale. Diminuire i valori per includere le aree più lontane dal picco di fluorescenza.</li>
			<li>Il parametro di picco determina il grado in cui due picchi di segnale sono considerati continui o separati. Diminuendo il valore si otterrà la separazione dei picchi.</li>
			<li>Picchi massimi specifica il numero massimo di fuochi identificabili. Imposta numeri alti per includere tutti i punti focali nell'immagine.</li>
		</ol></li>
		<li>Eseguire FindFoci e copiare la stringa visualizzata nella finestra del registratore (Passaggio 3.4.2, Figura 2B) che contiene i parametri selezionati, escluse le virgolette. Per ulteriori informazioni relative alle impostazioni, fare riferimento alle istruzioni del manuale del plugin 22.</li>
	</ol></li>
	<li>Pipeline di quantificazione delle proteine nucleari<ol><li>Scaricare lo script "nuclear_prot_q.py" (File supplementare 2).</li>
		<li>Trascina e rilascia lo script su Fiji e fai clic su Esegui per eseguire il codice.</li>
		<li>Seguire le istruzioni all'interno della finestra di dialogo visualizzata per elaborare le immagini.<ol><li>Canale del nucleo: inserire il numero corrispondente al canale di DAPI (o qualsiasi colorazione nucleare).</li>
			<li>Sfocatura gaussiana del nucleo: inserire il valore di sigma necessario per sfocare l'immagine per la segmentazione. NOTA: Mantenere questo parametro più vicino al diametro del nucleo (cioè 5-6 μm). Valori sigma più alti sono indicati per la colorazione disomogenea.</li>
			<li>Canale proteico: inserire il numero corrispondente al canale della colorazione di interesse.</li>
			<li>Parametro FindFoci: incolla la stringa ottenuta dallo step di registrazione della macro nel passaggio 3.4.6 (Figura 2B).</li>
			<li>(Facoltativo) Controllo qualità: verifica la qualità dei nuclei segmentati. In questo modo lo script verrà messo in pausa e sarà possibile controllare manualmente ogni regione nucleare di interesse (ROI) generata.</li>
			<li>Selezionare una directory di immagini: fare clic sul pulsante Sfoglia per accedere alla cartella contenente i file TIFF da analizzare.</li>
		</ol></li>
		<li>Una volta compilate tutte le caselle, fare clic su OK per continuare l'esecuzione.</li>
		<li>Se un nucleo non è segmentato correttamente e non soddisfa i requisiti di qualità, eliminarlo o modificarlo come indicato nella Figura 2C.<ol><li>Controlla l'elenco ROI nella finestra ROIManager3D; se l'elenco è vuoto, selezionare la finestra di unione e fare clic su Quantifica 3D per aggiornare il gestore. Quindi, chiudere la tabella dei risultati Quantify 3D. Seleziona il canale dei nuclei e fai clic su Live-ROI su ON.</li>
			<li>Seleziona la ROI appartenente allo stesso nucleo e premi Unisci o premi Elimina nel caso di nuclei indesiderati.</li>
			<li>Fate clic su Seleziona tutto (Select All ) e procedete con l'analisi facendo clic su OK nella finestra di controllo della maschera (Mask check ).</li>
			<li>Per i risultati, cercare nella cartella Quantification all'interno del percorso del file indicato nel passaggio 3.5.3.6, contenente un file txt con i record del parametro utilizzato per l'analisi.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Pipeline su Google Colab<ol><li>Scaricare il notebook "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" (file supplementare 3).</li>
		<li>Apri il taccuino su Google Colab (https://colab.research.google.com/).</li>
		<li>Carica tutte le cartelle contenenti i file .csv di ciascun campo immagine in una cartella di preferenza in Google Drive.</li>
		<li>Indicare nel taccuino il percorso della cartella in cui sono memorizzate le sottocartelle dei risultati ed eseguire tutte le celle. Al termine della compilazione del codice, il file del foglio di calcolo finale contenente tutti i dati compilati viene creato nella stessa cartella in cui sono stati caricati i file .csv.</li>
	</ol></li>
</ol>

Flusso di lavoro di analisi della colorazione delle proteine nucleari nelle cellule primarie umane

<ol>
	<li>Aboelnour, E., Bonev, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+organization,+dynamics,+and+function+of+the+4D+genome.">Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome.</a> Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).</li><li>Erdel, F., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+chromatin+subcompartments+by+phase+separation.">Formation of chromatin subcompartments by phase separation.</a> Biophys J. 114 (10), 2262-2270 (2018).</li><li>Henninger, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+feedback+control+of+transcriptional+condensates.">RNA-mediated feedback control of transcriptional condensates.</a> Cell. 184 (1), 207-225 (2021).</li><li>Guo, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pol+II+phosphorylation+regulates+a+switch+between+transcriptional+and+splicing+condensates.">Pol II phosphorylation regulates a switch between transcriptional and splicing condensates.</a> Nature. 572 (7770), 543-548 (2019).</li><li>Bhat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+genome+organization+around+nuclear+speckles+drives+mRNA+splicing+efficiency.">3D genome organization around nuclear speckles drives mRNA splicing efficiency.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Spector, D. L., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+speckles.">Nuclear speckles.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a000646 (2011).</li><li>Kilic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+of+53BP1+determines+liquid-like+behavior+of+DNA+repair+compartments.">Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments.</a> EMBO J. 38 (16), e101379 (2019).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+disordered+elements+controls+DNA+replication+through+initiator+self-assembly.">A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly.</a> Elife. 8, e48562 (2019).</li><li>Feric, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexisting+liquid+phases+underlie+nucleolar+subcompartments.">Coexisting liquid phases underlie nucleolar subcompartments.</a> Cell. 165 (7), 1686-1697 (2016).</li><li>Yoneda, M., Nakagawa, T., Hattori, N., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleolus+from+a+liquid+droplet+perspective.">The nucleolus from a liquid droplet perspective.</a> J Biochem. 170 (2), 153-162 (2021).</li><li>Alberti, S., Carra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolus:+A+liquid+droplet+compartment+for+misbehaving+proteins.">Nucleolus: A liquid droplet compartment for misbehaving proteins.</a> Curr Biol. 29 (19), R930-R932 (2019).</li><li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation.">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li><li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin.">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li><li>Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+in+biology.">Liquid-liquid phase separation in biology.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 39-58 (2014).</li><li>Feric, M., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+separation+in+genome+organization+across+evolution.">Phase separation in genome organization across evolution.</a> Trends Cell Biol. 31 (8), 671-685 (2021).</li><li>Mitrea, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+physical+characterization+of+phase-separated+bodies+and+membrane-less+organelles.">Methods for physical characterization of phase-separated bodies and membrane-less organelles.</a> J Mol Biol. 430 (23), 4773-4805 (2018).</li><li>Fetter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+gene+tagging+with+fluorescent+proteins.">Endogenous gene tagging with fluorescent proteins.</a> Methods Mol Biol. 1239, 231-240 (2015).</li><li>Alberti, S., Gladfelter, A., Mittag, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+and+challenges+in+studying+liquid-liquid+phase+separation+and+biomolecular+condensates.">Considerations and challenges in studying liquid-liquid phase separation and biomolecular condensates.</a> Cell. 176 (3), 419-434 (2019).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (10), 1607-1611 (2011).</li><li>Scalisi, S., Ahmad, A., D'Annunzio, S., Rousseau, D., Zippo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+PcG-associated+condensates+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Quantitative analysis of PcG-associated condensates by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Methods Mol Biol. 2655, 183-200 (2023).</li><li>Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+quantitating+confocal+fluorescent+images.">A simple method for quantitating confocal fluorescent images.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100916 (2021).</li><li>Herbert, A. D., Carr, A. M., Hoffmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FindFoci:+a+focus+detection+algorithm+with+automated+parameter+training+that+closely+matches+human+assignments,+reduces+human+inconsistencies+and+increases+speed+of+analysis.">FindFoci: a focus detection algorithm with automated parameter training that closely matches human assignments, reduces human inconsistencies and increases speed of analysis.</a> PLoS One. 9 (12), e114749 (2014).</li><li>Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escude, C., Boudier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TANGO:+a+generic+tool+for+high-throughput+3D+image+analysis+for+studying+nuclear+organization.">TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization.</a> Bioinformatics. 29 (14), 1840-1841 (2013).</li><li>Sabari, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control.">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), 3958 (2018).</li><li>Jang, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain+protein+Brd4+is+a+positive+regulatory+component+of+P-TEFb+and+stimulates+RNA+polymerase+II-dependent+transcription.">The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription.</a> Mol Cell. 19 (4), 523-534 (2005).</li><li>Pasini, D., Bracken, A. P., Jensen, M. R., Denchi, E. L., Helin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suz12+is+essential+for+mouse+development+and+for+EZH2+histone+methyltransferase+activity.">Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity.</a> EMBO J. 23 (20), 4061-4071 (2004).</li><li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+and+its+mark+in+life.">The Polycomb complex PRC2 and its mark in life.</a> Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).</li><li>Peng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+regulates+the+homeostasis+of+CD8(+)+T-lymphocytes+and+their+proliferation+in+response+to+antigen+stimulation.">Brd4 regulates the homeostasis of CD8(+) T-lymphocytes and their proliferation in response to antigen stimulation.</a> Front Immunol. 12, 728082 (2021).</li><li>Marasca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE1+are+spliced+in+non-canonical+transcript+variants+to+regulate+T+cell+quiescence+and+exhaustion.">LINE1 are spliced in non-canonical transcript variants to regulate T cell quiescence and exhaustion.</a> Nat Genet. 54 (2), 180-193 (2022).</li><li>Marasca, F., Cortesi, A., Bodega, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+COMBO+chrRNA-DNA-ImmunoFISH.">3D COMBO chrRNA-DNA-ImmunoFISH.</a> Methods Mol Biol. 2157, 281-297 (2021).</li><li>Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Multicolor+DNA+FISH+tool+to+study+nuclear+architecture+in+human+primary+cells.">3D Multicolor DNA FISH tool to study nuclear architecture in human primary cells.</a> J Vis Exp. (155), (2020).</li><li>Jakob, B., Splinter, J., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+microscopy+analysis+of+radiation-induced+DNA+double-strand+break+motion.">Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3172-3177 (2009).</li></ol>

R.V. ha una collaborazione scientifica con la startup T-One Therapeutics Srl; B.B. e F.M. sono co-fondatori della startup T-One Therapeutics Srl; E.P. è attualmente dipendente di T-One Therapeutics Srl; Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

In questo studio, presentiamo un metodo per eseguire esperimenti di immunofluorescenza su proteine nucleari nei linfociti T umani. Questo metodo offre flessibilità per l'uso con vari tipi di cellule attraverso piccole modifiche nelle fasi di fissazione e permeabilizzazione, come descritto in precedenza30,31.
Il nostro flusso di lavoro di imaging si basa su tecniche consolidate descritte in letteratura, in particolare FindFoci e 3D Sui...

L'organizzazione del genoma eucariotico è governata da più strati di modificazioni epigenetiche1, coordinando diverse funzioni nucleari che possono verificarsi all'interno di compartimenti specializzati chiamati corpi nucleari o condensati2. All'interno di queste strutture, avvengono processi come l'inizio della trascrizione3, l'elaborazione dell'RNA 4,5,6, la riparazione del DNA 7,8, la biogenesi dei ribosomi 9,10,11 e la regolazione dell'eterocromatina12,13. La regolazione dei corpi nucleari si adatta sia alle dimensioni spaziali che temporali per soddisfare le esigenze cellulari, guidata dai principi della separazione di fase14,15. Di conseguenza, questi corpi funzionano come fabbriche transitorie in cui i componenti funzionali si assemblano e si smontano, subendo cambiamenti nelle dimensioni e nella distribuzione spaziale. Pertanto, la comprensione delle caratteristiche delle proteine nucleari al microscopio, compresa la loro propensione a formare corpi e la loro disposizione spaziale in diverse condizioni cellulari, offre preziose informazioni sui loro ruoli funzionali. La microscopia a fluorescenza è un metodo ampiamente utilizzato per lo studio delle proteine nucleari, consentendo la loro rilevazione attraverso anticorpi fluorescenti o esprimendo direttamente bersagli con un reporter di proteine fluorescenti16,17.
In questo contesto, i corpi nucleari appaiono come focolai luminosi o punti, con un notevole grado di sfericità, che li rende facilmente distinguibili dall'ambiente circostante16,18. Tecniche di super-risoluzione come STORM e PALM, fornendo una risoluzione migliorata (fino a 10 nm)19, consentono una caratterizzazione più precisa della struttura e della composizione di specifici condensati20. Tuttavia, la loro accessibilità è limitata dalle spese per le attrezzature e dalle competenze specialistiche necessarie per l'analisi dei dati. Pertanto, la microscopia confocale rimane popolare grazie al suo favorevole equilibrio tra risoluzione e utilizzo più ampio. Tale popolarità è facilitata dalla rimozione intrinseca della luce sfocata, che riduce la necessità di ampie procedure di post-elaborazione per una segmentazione accurata, la sua ampia disponibilità negli istituti di ricerca, il suo tempo di acquisizione effettivo e la preparazione del campione che è tipicamente efficiente. Tuttavia, la misurazione accurata della distribuzione, dell'assemblaggio o della diffusione delle proteine utilizzando saggi di immunofluorescenza in diverse condizioni cellulari pone delle sfide, poiché molti metodi esistenti non forniscono indicazioni sulla selezione di parametri adeguati per proteine con modelli di distribuzione variabili21. Inoltre, la gestione del grande volume di dati risultante può essere scoraggiante per gli utenti con esperienza limitata nell'analisi dei dati, compromettendo potenzialmente il significato biologico dei risultati.
Per affrontare queste sfide, introduciamo un protocollo dettagliato passo dopo passo per la preparazione dell'immunofluorescenza e l'analisi dei dati, con l'obiettivo di fornire un metodo imparziale per quantificare la colorazione delle proteine con vari modelli di organizzazione (Figura 1). Questa pipeline semi-automatizzata è progettata per utenti con competenze limitate nell'analisi computazionale e di imaging. Combina le funzionalità di due affermati plug-in delle Fiji: FindFoci22 e 3D suite23. Integrando la capacità di identificazione precisa dei punti focali di FindFoci con le funzionalità di identificazione e segmentazione degli oggetti nello spazio 3D offerte dalla suite 3D, il nostro approccio genera due file CSV per canale per ogni campo di acquisizione. Questi file contengono informazioni complementari che facilitano il calcolo di metriche adatte a vari tipi di distribuzione del segnale, come il conteggio dei focolai per cellula, la distanza dei focolai dal centroide nucleare e il coefficiente di disomogeneità (IC), che abbiamo introdotto per la colorazione diffusa delle proteine. Inoltre, riconosciamo che l'estrapolazione dei dati può richiedere molto tempo per gli utenti con limitate capacità di gestione dei dati. Per semplificare questo processo, forniamo uno script Python che compila automaticamente tutte le misurazioni raccolte in un unico file per ogni esperimento. Gli utenti possono eseguire questo script senza la necessità di installare alcun software di linguaggio di programmazione. Forniamo un codice eseguibile su Google Colab, una piattaforma basata su cloud che permette la scrittura di script Python direttamente nel browser. Ciò garantisce che il nostro metodo sia intuitivo e facilmente accessibile per un uso immediato.
Dimostriamo l'efficacia del nostro protocollo nell'analizzare e quantificare le alterazioni nella distribuzione del segnale di due proteine nucleari: la proteina 4 contenente il bromodominio (BRD4) e il soppressore di zeste-12 (SUZ12). BRD4 è una proteina coattivatrice ben documentata all'interno del complesso mediatore nota per formare condensati associati all'inizio trascrizionale dipendente dalla polimerasi II24,25. SUZ12 è un componente proteico del Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) responsabile della regolazione della deposizione della modificazione istonica H3K27me326,27. Queste proteine mostrano modelli diversi all'interno di due tipi cellulari distinti: le cellule T umane CD4+ naive appena isolate, che sono quiescenti e mostrano bassi tassi di attività trascrizionale, e le cellule TH1 CD4+ differenziate in vitro, che sono cellule effettrici specializzate e proliferanti che mostrano un aumento della trascrizione28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendord</td>
			<td>#0030121503</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#612-3700</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#2149P-HR</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352070</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#2069-HR</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36984</td>
			<td>Step 1.3.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A7030</td>
			<td>Step 1.3.6., 1.3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>#130-096-533</td>
			<td>Step 1.1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat#D1306</td>
			<td>Step 1.3.10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#1131D</td>
			<td>magnetic beads step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>#4146320</td>
			<td>Step 1.2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria SORP</td>
			<td>BD Bioscences</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10270106</td>
			<td>Step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FICOLL PAQUE PLUS</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>GEH17144003F32</td>
			<td>Step 1.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Version 2.14.0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Protocol section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#72298-13</td>
			<td>Step 1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G5516</td>
			<td>Step 1.2.7-1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Step 1.3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320331</td>
			<td>Step 1.3.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human neutralizing anti-IL-4</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat#130-095-753</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human recombinant IL-12</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat#130-096-704</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human recombinant IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat#130-097-744</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>-</td>
			<td>Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2&#215;. Frame size 1024&#215;1024 pixel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11140035</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-1552</td>
			<td>Step 1.3.12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>#557871</td>
			<td>Step 1.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>#552888</td>
			<td>Step 1.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>#130-113-546</td>
			<td>Step 1.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353047</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>Step 1.3.6., 1.3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#14190094</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#15070063</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P6148</td>
			<td>Step 1.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P8920</td>
			<td>1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody - BRD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab128874</td>
			<td>Step 1.3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody - SUZ12</td>
			<td>Cel Signalling</td>
			<td>mAb #3737</td>
			<td>Step 1.3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#61870010</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11360039</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Step 1.2., 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P9416</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a versatile pipeline for analyzing dynamic changes in nuclear bodies in a variety of cell types

Vari processi nucleari, come il controllo trascrizionale, si verificano all'interno di strutture discrete note come focolai che sono distinguibili attraverso la tecnica dell'immunofluorescenza. Lo studio della dinamica di questi focolai in diverse condizioni cellulari tramite microscopia fornisce preziose informazioni sui meccanismi molecolari che regolano l'identità e le funzioni cellulari. Tuttavia, l'esecuzione di saggi di immunofluorescenza su diversi tipi di cellule e la valutazione delle alterazioni nell'assemblaggio, nella diffusione e nella distribuzione di questi focolai presentano numerose sfide. Queste sfide comprendono complessità nella preparazione dei campioni, nella determinazione dei parametri per l'analisi dei dati di imaging e nella gestione di volumi di dati sostanziali. Inoltre, i flussi di lavoro di imaging esistenti sono spesso personalizzati per utenti esperti, limitando così l'accessibilità a un pubblico più ampio.
In questo studio, introduciamo un protocollo di immunofluorescenza ottimizzato su misura per lo studio delle proteine nucleari in diversi tipi di cellule T primarie umane che possono essere personalizzate per qualsiasi proteina di interesse e tipo di cellula. Inoltre, presentiamo un metodo per quantificare in modo imparziale la colorazione delle proteine, sia che formino focolai distinti sia che mostrino una distribuzione nucleare diffusa.
Il metodo proposto offre una guida completa, dalla colorazione cellulare all'analisi, sfruttando una pipeline semi-automatizzata sviluppata a Jython ed eseguibile nelle Fiji. Inoltre, forniamo uno script Python di facile utilizzo per semplificare la gestione dei dati, accessibile pubblicamente su un notebook Google Colab. Il nostro approccio ha dimostrato efficacia nel produrre analisi di immunofluorescenza altamente informative per proteine con diversi modelli di organizzazione nucleare in diversi contesti.

The organization of the eukaryotic genome is governed by multiple layers of epigenetic modifications1, coordinating several nuclear functions that can occur within specialized compartments called nuclear bodies or condensates2. Within these structures, processes such as transcription initiation3, RNA processing4,5,6, DNA repair7,8, ribosome biogenesis9,10,11, and heterochromatin regulation12,13 take place. The regulation of nuclear bodies adjusts over both spatial and temporal dimensions to accommodate cellular requirements, guided by principles of phase separation14,15. Consequently, these bodies function as transient factories where functional components assemble and disassemble, undergoing changes in size and spatial distribution. Hence, understanding the characteristics of nuclear proteins by microscopy, including their propensity to form bodies and their spatial arrangement in different cellular conditions, offers valuable insights into their functional roles. Fluorescence microscopy is a widely used method for studying nuclear proteins, allowing their detection through fluorescent antibodies or directly expressing targets with a fluorescent protein reporter16,17.
In this context, nuclear bodies appear as bright foci or puncta, with a notable degree of sphericity, making them easily distinguishable from the surrounding environment16,18. Super-resolution techniques like STORM and PALM, by providing improved resolution (up to 10 nm)19, enable more precise characterization of the structure and composition of specific condensates20. However, their accessibility is limited by equipment expenses and the specialized skills needed for data analysis. Therefore, confocal microscopy remains popular due to its favorable balance between resolution and wider usage. Such popularity is facilitated by the inherent removal of out-of-focus light, which diminishes the requirement for extensive post-processing procedures for accurate segmentation, its widespread availability in research institutes, its effective acquisition time, and sample preparation that is typically efficient. However, accurately measuring protein distribution, assembly, or diffusion using immunofluorescence assays across diverse cellular conditions poses challenges, as many existing methods lack guidance on selecting suitable parameters for proteins with varying distribution patterns21. Moreover, handling the resulting large data volume can be daunting for users with limited experience in data analysis, potentially compromising the biological significance of the results.
To address these challenges, we introduce a detailed step-by-step protocol for immunofluorescence preparation and data analysis, aiming to provide an unbiased method for quantifying protein staining with various organization patterns (Figure 1). This semi-automated pipeline is designed for users with limited expertise in computational and imaging analysis. It combines the functionalities of two established Fiji plugins: FindFoci22 and 3D suite23. By integrating the precise foci identification capability of FindFoci with the object identification and segmentation features in 3D space offered by 3D suite, our approach generates two CSV files per channel for each field of acquisition. These files contain complementary information that facilitates the calculation of metrics suitable for various types of signal distribution, such as the count of foci per cell, the distance of foci from the nuclear centroid, and the inhomogeneity coefficient (IC), which we have introduced for diffuse protein staining. In addition, we acknowledge that data extrapolation can be time-consuming for users with limited data handling skills. To streamline this process, we provide a Python script that automatically compiles all collected measurements into a single file for each experiment. Users can execute this script without the need to install any programming language software. We provide an executable code on Google Colab, a cloud-based platform that allows the writing of Python scripts directly in the browser. This ensures that our method is intuitive and readily accessible for immediate use.
We demonstrate the effectiveness of our protocol in analyzing and quantifying alterations in signal distribution of two nuclear proteins: Bromodomain-containing protein 4 (BRD4) and Suppressor of zeste-12 (SUZ12). BRD4 is a well-documented coactivator protein within the Mediator complex known to form condensates associated with polymerase II-dependent transcriptional initiation24,25. SUZ12 is a protein component of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) responsible for regulating the deposition of H3K27me3 histone modification26,27. These proteins exhibit different patterns within two distinct cell types: freshly isolated human CD4+ na&#239;ve T cells, which are quiescent and exhibit slow rates of transcriptional activity, and in vitro differentiated TH1 CD4+ cells, which are specialized, proliferating effector cells showing increased transcription28.

Autore in primo piano: Analisi epigenetica completa per lo studio della plasticità cellulare umana e dell'adattamento ambientale mediante saggi di immunofluorescenza

Una pipeline versatile per l'analisi dei cambiamenti dinamici nei corpi nucleari in una varietà di tipi di cellule

Il protocollo delineato in questo metodo facilita la visualizzazione e la quantificazione delle alterazioni nella colorazione delle proteine nucleari all'interno delle cellule T primarie umane e può essere personalizzato per diversi tipi di cellule e bersagli proteici. Come casi di studio, abbiamo condotto e analizzato la colorazione di BRD4 e SUZ12 in cellule CD4+ naive e TH1.
BRD4 mostra un pattern di colorazione ben punteggiato sia nelle cellule CD4<s...

Questo metodo descrive un protocollo di immunofluorescenza e una pipeline di quantificazione per valutare la distribuzione proteica con vari modelli di organizzazione nucleare nei linfociti T umani. Questo protocollo fornisce una guida passo dopo passo, a partire dalla preparazione del campione e proseguendo attraverso l'esecuzione di analisi semi-automatizzate nelle Fiji, concludendo con la gestione dei dati da parte di un taccuino Google Colab.

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the ...

a-versatile-pipeline-for-analyzing-dynamic-changes-nuclear-bodies

Research

JoVE Journal

Genetics

A Versatile Pipeline for Analyzing Dynamic Changes in Nuclear Bodies in a Variety of Cell Types

297 Views.  Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM). Il nostro principale interesse di ricerca è un meccanismo epigenetico che regola l'elasticità cellulare umana e l'adattamento ambientale. Attualmente mi sto concentrando sullo studio di come i cambiamenti nella cromatizzazione all'interno di un condensato nucleare siano tre condizioni cellulari patologiche. Credo che lo studio delle proprietà biofisiche della cromatizzazione apra un nuovo campo e offra opportunità uniche per lo sviluppo di nuovi approcci ...

Video: Autore in primo piano: Analisi epigenetica completa per lo studio della plasticità cellulare umana e dell'adattamento ambientale mediante saggi di immunofluorescenza

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the immunofluorescence technique. Investigating the dynamics of these foci under diverse cellular conditions via microscopy yields valuable insights into the molecular mechanisms governing cellular identity and functions. However, performing immunofluorescence assays across different cell types and assessing alterations in the assembly, diffusion, and distribution of these foci present numerous challenges. These challenges encompass complexities in sample preparation, determination of parameters for analyzing imaging data, and management of substantial data volumes. Moreover, existing imaging workflows are often tailored for proficient users, thereby limiting accessibility to a broader audience.
In this study, we introduce an optimized immunofluorescence protocol tailored for investigating nuclear proteins in different human primary T cell types that can be customized for any protein of interest and cell type. Furthermore, we present a method for unbiasedly quantifying protein staining, whether they form distinct foci or exhibit a diffuse nuclear distribution.
Our proposed method offers a comprehensive guide, from cellular staining to analysis, leveraging a semi-automated pipeline developed in Jython and executable in Fiji. Furthermore, we provide a user-friendly Python script to streamline data management, publicly accessible on a Google Colab notebook. Our approach has demonstrated efficacy in yielding highly informative immunofluorescence analyses for proteins with diverse patterns of nuclear organization across different&#160;contexts.

This method describes an immunofluorescence protocol and quantification pipeline for evaluating protein distribution with varied nuclear organization patterns in human T lymphocytes. This protocol provides step-by-step guidance, starting from sample preparation and continuing through the execution of semi-automated analysis in Fiji, concluding with data handling by a Google Colab notebook.