당사는 INGM 이미징 시설(특히 C. Cordiglieri 및 A. Fasciani)과 INGM FACS 선별 시설(특히 M.C Crosti)의 과학적, 기술적 지원을 인정합니다(Istituto Nazionale di Genetica Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM), Milan, Italy). 우리는 M. Giannaccari의 기술 정보 지원에 감사드립니다. 이 작업은 F.M. Ricerca Finalizzata(보조금 번호 GR-2018-12365280), Fondazione AIRC(보조금 번호 2022 27066), Fondazione Cariplo(보조금 번호 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica(FRRB CP2_12/2018,), Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza(PNRR) (보조금 번호 G43C22002620007) 및 Progetti di Rilevante Interesse Nazionale(PRIN)(보조금 번호 2022PKF9S)에서 B. B.

연구 목적의 인체 샘플 사용은 IRCCS(Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico(밀라노)의 윤리 위원회의 승인을 받았으며 모든 피험자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다(승인 번호: 708_2020). 프로토콜은 세 가지 주요 섹션으로 구성됩니다: 면역형광 실행, 이미지 획득 및 이미지 분석. 평균적으로 완료하는 데 영업일 기준 4일이 소요됩니다(그림 1).
1. 면역형광 제제
참고: 이 immunofluorescence 프로토콜은 고정 및 투과화 조건을 조정하여 다양한 세포 유형 및 단백질 표적에 대해 쉽게 맞춤화할 수 있습니다. 면역형광 전처리는 일반적으로 완료하는 데 3일 미만이 소요되며, 1차 항체 배양 기간은 항체 품질과 표적 단백질에 따라 다릅니다(그림 1).
<ol><li>시료 전처리<ol><li>제조업체의 지침에 따라 약 1.077g/mL 밀도의 매체를 통해 밀도 구배 원심분리를 통해 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리합니다(재료 표).</li>
		<li>제조업체의 지침(재료 표)에 따라 마그네틱 비드로 PBMC에서 CD4+ T 세포를 분리합니다.</li>
		<li>CD4, CD45RA 및 CD45RO에 대한 항체로 세포를 염색하고(Table of Materials) 다른 곳에서 설명한 바와 같이 naive CD4+ T 세포를 CD4+/CD45RA+/CD45RO- 세포로 FACS 정렬을 진행합니다(29,30). 참고: 이 프로토콜에 사용된 FACS 분류기의 사양은 재료 표를 참조하십시오.</li>
		<li>29에 기술된 바와 같이 naive CD4+ T 세포를 T helper 1(TH1 CD4+ 세포)로 분화시키십시오. 간단히 말해서, TH1 배지에서 FACS 분류된 naive CD4+ T 세포의 1.5 x 106 cells/mL를 배양하여 anti-CD3/anti-CD28 자성 비드로 1:1 비율로 자극합니다. 세포를 계수하고 2-3일마다 1.5 × 106 cells/mL에 도달하면 분할합니다(TH1배지 조성에 대한 표 1 참조).</li>
		<li>29에 설명된 대로 분화 7일 후 effector function cytokines의 분비를 평가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포 고정 및 투과화 참고 : 이러한 모든 절차는 약간의 수정으로 30,31에 설명되어 있습니다.<ol><li>최적의 셀 접착을 보장하려면 다음과 같이 유리 커버슬립(10mm, 두께 1.5H)을 코팅 용액(표 1)으로 처리하십시오.<ol><li>유리 커버슬립을 먼저 증류수(ddH2O)로 세척한 다음 70% 에탄올(EtOH)로 헹구고 자연 건조시켜 청소합니다.</li>
			<li>세척된 커버슬립을 24-1.2.1.3-1.3단계에 대해 멀티웰 플레이트에 넣습니다.</li>
			<li>코팅 용액 200μL를 유리 커버슬립에 한 방울 떨어뜨립니다. 5분 후 방울을 제거하고 자연 건조시킵니다.</li>
			<li>200 μL의 ddH2O 한 방울을 도포하여 커버 슬립을 세척하십시오. 5분 후 방울을 제거하고 자연 건조합니다.</li>
			<li>3 x 1.2.1.3-1.2.1.4 단계를 반복합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>미성숙한 CD4+ T 세포 및T H1 CD4+ 세포를 2 × 106 cells/mL 농도의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁시킵니다. 참고: 표시된 농도는 인간 1차 T 림프구와 같은 소세포에 대해 특별히 권장됩니다. 부착 세포의 경우 유리 코팅 처리가 필요하지 않습니다. 대신, 적절한 세포 배양 배지를 사용하여 유리 표면에서 세포를 직접 성장시킵니다.</li>
		<li>셀 현탁액 200μL 방울을 유리 커버 슬립에 적용합니다. 세포가 실온(RT)에서 30분 동안 파종되도록 합니다. 그런 다음 방울을 제거하십시오.</li>
		<li>갓 여과된 3% 파라포름알데히드(PFA 용액, 표 1)로 세포를 RT에서 10분 동안 고정합니다.</li>
		<li>유리 커버슬립을 TPBS(표 1)로 RT에서 3 x 5분 동안 세척합니다.</li>
		<li>TPBS를 제거하고 RT에서 10분 동안 투과화 용액(표 1)을 추가합니다.</li>
		<li>투과화 용액을 버리고 4°C에서 1시간부터 하룻밤(ON)까지 보관 용액(표 1)에 샘플을 배양합니다. 참고: 이 단계에서 프로토콜을 안전하게 중단할 수 있으며 유리 커버 슬립은 24-멀티웰 플레이트의 보관 용액에 3-4주 동안 보존할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescence(면역형광)<ol><li>(선택 사항) 24-멀티웰 플레이트에서 커버슬립을 제거하고 드라이아이스에 30초 동안 빠르게 얼린 다음 RT에서 해동한 다음 저장 용액으로 미리 채워진 우물에서 유리 커버슬립을 세척합니다.</li>
		<li>(선택 사항) 3 x 1.3.1 단계를 반복합니다.</li>
		<li>RT에서 5분 동안 투과화 용액으로 세척합니다. 다음으로, RT에서 TPBS로 2 x 5분 동안 세척합니다.</li>
		<li>RT에서 12분 동안 0.1 N HCl에서 배양합니다.</li>
		<li>1x PBS에서 두 번의 빠른 세척을 수행합니다. 참고: 동결 및 해동 단계와 HCl 처리를 포함한 지정된 세포 투과화 조건은 조밀하게 충전된 크로마틴을 특징으로 하는 세포의 핵 성분을 염색하는 데 최적입니다. 그러나 덜 압축된 염색질을 특징으로 하는 세포를 다룰 때는 이러한 단계를 줄이거나 피하는 것이 좋습니다. 또한 세포질 구성 요소를 표적으로 삼기 위해 HCl 처리를 줄이거나 제거하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>항체 희석 완충액(표 1)(각 유리 커버슬립당 200μL)에 희석한 1차 항체(BRD4, 1:500 또는 SUZ12, 1:100)를 4°C에서 ON으로 하여 세포를 배양합니다. NOTE: 면역형광은 실험적 필요성, 2차 항체 및 검출 시스템에 따라 하나 이상의 1차 항체를 멀티플렉싱하여 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>RT에서 PBS-T(표 1)로 3 x 5분 동안 약한 흔들림으로 세척합니다.</li>
		<li>항체 희석 완충액(각 유리 커버슬립당 200μL)에 희석된 2차 항체로 세포를 RT에서 1시간 동안 배양합니다. 참고: 실험 요구 사항과 사용 가능한 검출 시스템에 가장 적합한 2차 항체를 선택하십시오. 각 2차 항체가 1차 항체가 파생된 종을 표적으로 하는지 확인합니다. 또한 현미경의 필터 및 광원과 호환되는 형광단을 선택하십시오. 선택한 fluorophore와 nuclear stain의 방출 스펙트럼 사이의 스펙트럼 중복을 피하는 것이 중요합니다.</li>
		<li>RT에서 PBS-T로 3 x 5분 동안 가볍게 흔들어 씻습니다.</li>
		<li>RT에서 5분 동안 1x PBS에 희석한 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 1ng/mL로 염색합니다. 참고: 대체 염료는 2차 항체의 방출 스펙트럼과 겹치지 않는 한 핵 염색에 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>1x PBS에서 여러 번 빠르게 세척합니다.</li>
		<li>유리 커버슬립을 페이드 방지 장착 미디어가 있는 현미경 슬라이드에 장착합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 이미지 취득
참고: 이미지 획득 시간은 측량기와 선택한 설정에 따라 다릅니다.
<ol><li>컨포칼 현미경 획득<ol><li>컨포칼 현미경을 사용하여 z에서 0.25μm의 단계 크기와 0.1-0.2μm의 픽셀 크기를 설정하여 3D 이미지를 캡처합니다. 참고: 63x 1.4 NA Oil 대물렌즈로 최적의 광 회절 제한 해상도를 달성하기 위해 핀홀 크기는 0.8AU, 2x 라인 평균, 프레임 크기는 1024 × 1024 픽셀로 설정했습니다. excitation laser와 channel acquisition sequence는 사용되는 fluorophores 간의 간섭이나 누화를 방지하기 위해 의도적으로 선택되었습니다. 그러나 매개변수 조정은 특정 현미경 및 표본 특성에 맞게 조정되어야 합니다. 이 프로토콜에 사용된 컨포칼 현미경의 사양은 Table of Materials 를 참조하십시오.</li>
		<li>생물학적 복제당 약 50개의 세포를 포함하는 일관된 수의 무작위 필드를 획득합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 이미지 분석
<ol><li>소프트웨어 설치<ol><li>공식 피지 다운로드 페이지(https://imagej.net/software/fiji/downloads)에서 사용 가능한 마지막 버전의 피지를 다운로드하여 설치합니다.</li>
		<li>피지 업데이트 사이트를 통해 또는 3D Suite 웹 사이트(https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download)의 지침에 따라 수동으로 3D Suite를 설치합니다.</li>
		<li>Fiji 업데이트 사이트를 통해 또는 GitHub 저장소(https://github.com/aherbert/gdsc)의 지침에 따라 수동으로 GDSC(FindFoci)를 설치합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>TIFF 변환<ol><li>"convert_to_TIFF.py" 스크립트(보충 파일 1)를 다운로드합니다.</li>
		<li>스크립트를 피지에 끌어다 놓고 코드를 실행합니다.</li>
		<li>표시되는 패널에서 실험이 저장된 경로로 이동합니다. 변환된 TIFF 파일이 포함된 하위 폴더는 동일한 실험 폴더에 만들어집니다.</li>
	</ol></li>
	<li>3D 관리자에서 설정을 초기화합니다.<ol><li>플러그인 | 3DSuite | 3D 관리자 옵션을 클릭하여 3D 관리자 옵션 패널을 엽니다.</li>
		<li>3D Manager 옵션 창에서 볼륨(단위), 평균 그레이 값, 테두리 상자(픽스), 표준 편차 그레이 값, 중심(pix) 및 중심(단위) 측정에 해당하는 확인란을 선택합니다.</li>
		<li>다음 옵션을 선택합니다: XY 가장자리의 개체 제외 및 Z번째 가장자리의 개체 제외 를 선택하고 확인을 클릭합니다. 참고: 이 단계는 공간 및 양적 정보 파일에 저장될 메트릭을 처음 구성하기 위해 한 번만 수행해야 합니다. 선택한 메트릭은 적절한 파이프라인 기능을 보장하는 데 필수적입니다. 토론 섹션에 자세히 설명된 대로 이 단계에 선택적 추가 메트릭을 포함할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>FindFoci GUI에서 매개변수를 설정합니다. 참고: 이 단계는 최적의 매개변수로 반자동 파이프라인을 구성하기 위해 한 번만 수행해야 하며, 이 작업은 스크립트에 통합됩니다.<ol><li>테스트 이미지를 엽니다. 스택을 포함하여 단백질 채널을 복제하고(Ctrl + Shift + D) 하이퍼 스택 확인란을 선택한 다음 채널(c) 상자 내에서 적절한 채널 번호를 지정하고 그에 따라 이름을 바꿉니다.</li>
		<li>Fiji 매크로 레코더를 실행하여 Plugins | 매크로 | 기록.</li>
		<li>FindFoci 플러그인을 엽니다( 플러그인 | 지디에스씨 | 핀포시 | FindFoci GUI)를 선택하고 "이미지" 드롭다운 메뉴에서 분석할 이미지를 선택합니다.</li>
		<li>매개변수를 다음과 같이 설정합니다(그림 2A): 가우시안 블러 = 1.5; 배경 방법 = SD 위의 평균; 배경 매개 변수 = 9; 검색 방법 = 피크의 분수 - 배경; 검색 매개 변수 = 0.7; 피크 방법 = 배경보다 상대적; 피크 매개 변수 = 0.2; 최소 크기 = 5; 최대 피크 = 1,000,000. 참고: 표시된 매개변수는 당사의 사례 연구를 기반으로 선택되었으며 다른 염색 절차에는 적합하지 않을 수 있습니다.</li>
		<li>초점 식별을 향상시키려면 다음 매개변수를 조정하십시오.<ol><li>가우시안 블러(Gaussian blur )는 초점을 더 잘 분할하기 위해 매끄럽게 하는 정도를 정의합니다. 초점 직경(픽셀)에 가깝게 유지하십시오.</li>
			<li>배경 파라미터는 초점 신호와 배경을 구별하기 위한 임계값을 설정합니다. 값을 늘려 더 엄격한 임계값을 적용합니다.</li>
			<li>Search param 은 신호 인식에 포함되는 피크의 형광 비율을 정의합니다. 형광 피크에서 더 멀리 떨어진 영역을 포함하도록 값을 줄입니다.</li>
			<li>피크 파라미터는 두 신호 피크가 연속적이거나 분리된 것으로 간주되는 정도를 결정합니다. 값을 줄이면 피크가 분리됩니다.</li>
			<li>Max peaks는 식별할 수 있는 초점의 최대 수를 지정합니다. 이미지의 모든 초점을 포함하려면 높은 숫자를 설정합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>FindFoci를 실행하고 따옴표를 제외하고 선택한 매개변수가 포함된 레코더 창(단계 3.4.2, 그림 2B)에 나타나는 문자열을 복사합니다. 설정과 관련된 자세한 내용은 플러그인 설명서 지침 22를 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>핵 단백질 정량 파이프라인<ol><li>스크립트 "nuclear_prot_q.py"(보충 파일 2)를 다운로드합니다.</li>
		<li>스크립트를 피지에 끌어다 놓고 실행을 클릭하여 코드를 실행합니다.</li>
		<li>표시된 대화 상자의 지시에 따라 이미지를 처리합니다.<ol><li>Nucleus channel: DAPI(또는 핵 염색)의 채널에 해당하는 번호를 입력합니다.</li>
			<li>Nucleus Gaussian Blur: 분할을 위해 이미지를 흐리게 하는 데 필요한 시그마 값을 입력합니다. 참고: 이 매개변수를 핵 직경(즉, 5-6μm)에 더 가깝게 유지하십시오. 더 높은 시그마 값은 불균일한 염색에 대해 표시됩니다.</li>
			<li>단백질 채널: 관심 염색 채널에 해당하는 번호를 입력합니다.</li>
			<li>FindFoci 매개변수: 매크로 기록 단계에서 얻은 문자열을 통로 3.4.6에 붙여넣습니다(그림 2B).</li>
			<li>(선택 사항) 품질 관리: 분할된 핵의 품질을 확인합니다. 이렇게 하면 스크립트가 일시 중지되고 생성된 각 핵 관심 영역(ROI)을 수동으로 확인할 수 있습니다.</li>
			<li>이미지 디렉토리 선택: 찾아보기 버튼을 클릭하여 분석할 TIFF 파일이 포함된 폴더로 이동합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>모든 상자가 컴파일되면 확인을 클릭하여 실행을 계속합니다.</li>
		<li>핵이 올바르게 분할되지 않고 품질 요구 사항을 충족하지 못하는 경우 그림 2C에 표시된 대로 핵을 삭제하거나 수정하십시오.<ol><li>ROIManager3D 창에서 ROI 목록을 확인하십시오. 목록이 비어 있으면 병합 창을 선택하고 Quantify 3D를 클릭하여 관리자를 새로 고칩니다. 그런 다음 Quantify 3D 결과 테이블을 닫습니다. 핵 채널을 선택하고 Live-ROI to ON을 클릭합니다.</li>
			<li>동일한 nucleus에 속하는 ROI를 선택하고 Merge 를 누르거나 원하지 않는 nuclei의 경우 Delete 키를 누릅니다.</li>
			<li>모두 선택을 클릭하고 마스크 체크 창에서 확인을 클릭하여 분석을 진행합니다.</li>
			<li>결과를 보려면 3.5.3.6단계에 표시된 파일 경로 내의 Quantification 폴더 에서 분석에 사용된 매개변수 레코드가 있는 txt 파일을 확인합니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Google Colab의 파이프라인<ol><li>"final_nuclear_protein_metrics.ipynb" 노트북(보충 파일 3)을 다운로드합니다.</li>
		<li>Google Colab(https://colab.research.google.com/)에서 노트북을 엽니다.</li>
		<li>각 이미지 필드의 .csv 파일이 포함된 모든 폴더를 Google 드라이브의 원하는 폴더에 업로드합니다.</li>
		<li>결과 하위 폴더가 저장된 폴더의 경로를 노트북에 표시하고 모든 셀을 실행합니다. 코드 컴파일이 완료되면 컴파일된 모든 데이터를 포함하는 최종 스프레드시트 파일이 .csv 파일이 업로드된 동일한 폴더에 만들어집니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

인간 일차 세포의 핵 단백질 염색 분석 워크플로우

<ol>
	<li>Aboelnour, E., Bonev, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+organization,+dynamics,+and+function+of+the+4D+genome.">Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome.</a> Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).</li><li>Erdel, F., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+chromatin+subcompartments+by+phase+separation.">Formation of chromatin subcompartments by phase separation.</a> Biophys J. 114 (10), 2262-2270 (2018).</li><li>Henninger, J. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coactivator+condensation+at+super-enhancers+links+phase+separation+and+gene+control.">Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control.</a> Science. 361 (6400), 3958 (2018).</li><li>Jang, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain+protein+Brd4+is+a+positive+regulatory+component+of+P-TEFb+and+stimulates+RNA+polymerase+II-dependent+transcription.">The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription.</a> Mol Cell. 19 (4), 523-534 (2005).</li><li>Pasini, D., Bracken, A. P., Jensen, M. R., Denchi, E. L., Helin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suz12+is+essential+for+mouse+development+and+for+EZH2+histone+methyltransferase+activity.">Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity.</a> EMBO J. 23 (20), 4061-4071 (2004).</li><li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+complex+PRC2+and+its+mark+in+life.">The Polycomb complex PRC2 and its mark in life.</a> Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).</li><li>Peng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brd4+regulates+the+homeostasis+of+CD8(+)+T-lymphocytes+and+their+proliferation+in+response+to+antigen+stimulation.">Brd4 regulates the homeostasis of CD8(+) T-lymphocytes and their proliferation in response to antigen stimulation.</a> Front Immunol. 12, 728082 (2021).</li><li>Marasca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LINE1+are+spliced+in+non-canonical+transcript+variants+to+regulate+T+cell+quiescence+and+exhaustion.">LINE1 are spliced in non-canonical transcript variants to regulate T cell quiescence and exhaustion.</a> Nat Genet. 54 (2), 180-193 (2022).</li><li>Marasca, F., Cortesi, A., Bodega, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+COMBO+chrRNA-DNA-ImmunoFISH.">3D COMBO chrRNA-DNA-ImmunoFISH.</a> Methods Mol Biol. 2157, 281-297 (2021).</li><li>Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Multicolor+DNA+FISH+tool+to+study+nuclear+architecture+in+human+primary+cells.">3D Multicolor DNA FISH tool to study nuclear architecture in human primary cells.</a> J Vis Exp. (155), (2020).</li><li>Jakob, B., Splinter, J., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+microscopy+analysis+of+radiation-induced+DNA+double-strand+break+motion.">Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3172-3177 (2009).</li></ol>

R.V.는 신생 기업 T-One Therapeutics Srl과 과학적 협력을 맺고 있습니다. B.B.와 F.M.은 스타트업 T-One Therapeutics Srl의 공동 설립자입니다. E.P.는 현재 T-One Therapeutics Srl에서 근무하고 있습니다. 다른 모든 저자들은 서로 상충되는 이해관계가 없다고 선언합니다.

본 연구에서는 인간 T 림프구에서 핵 단백질에 대한 면역형광 실험을 수행하는 방법을 제시한다. 이 방법은 앞서 설명한 바와 같이 고정 및 투과화 단계에서의 사소한 수정을 통해 다양한 세포 유형에 사용할 수 있는 유연성을 제공합니다(30,31).
당사의 이미징 워크플로우는 문헌에 요약된 확립된 기술, 특히 FindFoci 및 3D Suite<sup class=...

진핵생물 게놈(eukaryotic genome)의 조직은 후성유전학적 변형(epigenetic modification)1의 여러 층에 의해 지배되며, 핵체 또는 응축물(vaultates)2이라고 불리는 특수한 구획 내에서 발생할 수 있는 여러 핵 기능을 조정한다. 이러한 구조 내에서 전사 시작3, RNA 처리 4,5,6, DNA 복구 7,8, 리보솜 생물 발생 9,10,11 및 헤테로크로마틴 조절12,13과 같은 과정이 발생합니다. 핵체의 조절은 위상 분리 원칙14,15에 따라 세포 요구 사항을 수용하기 위해 공간적 차원과 시간적 차원 모두에 걸쳐 조정됩니다. 결과적으로, 이러한 물체는 기능적 구성 요소가 조립되고 분해되는 일시적인 공장으로 기능하여 크기와 공간 분포의 변화를 겪습니다. 따라서 현미경을 통해 핵 단백질의 특성을 이해하면 핵 단백질의 물체 형성 경향과 다양한 세포 조건에서의 공간 배열을 포함하여 핵 단백질의 기능적 역할에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 형광 현미경 검사는 핵 단백질을 연구하는 데 널리 사용되는 방법으로, 형광 항체를 통해 검출하거나 형광 단백질 리포터16,17로 표적을 직접 표현할 수 있습니다.
이러한 맥락에서, 핵체는 밝은 초점(bright foci) 또는 푼크타(puncta)로 나타나며, 현저한 구형도(sphericity)를 가지므로 주변 환경과 쉽게 구별할 수 있다(16,18). STORM 및 PALM과 같은 초고해상도 기술은 향상된 해상도(최대 10nm)19를 제공하여 특정 응축수(20)의 구조 및 구성을 보다 정확하게 특성화할 수 있습니다. 그러나 장비 비용과 데이터 분석에 필요한 전문 기술로 인해 접근성이 제한됩니다. 따라서 컨포칼 현미경은 해상도와 더 넓은 사용 사이의 유리한 균형으로 인해 여전히 인기가 있습니다. 이러한 인기는 초점을 벗어난 빛의 본질적인 제거에 의해 촉진되며, 이는 정확한 세분화를 위한 광범위한 후처리 절차의 필요성, 연구 기관에서의 광범위한 가용성, 효과적인 획득 시간 및 일반적으로 효율적인 샘플 준비에 대한 요구 사항을 줄입니다. 그러나 다양한 세포 조건에서 면역형광 분석을 사용하여 단백질 분포, 조립 또는 확산을 정확하게 측정하는 것은 기존의 많은 방법에는 다양한 분포 패턴을 가진 단백질에 적합한 파라미터를 선택하는 방법에 대한 지침이 부족하기 때문에 문제가 발생합니다21. 또한 데이터 분석 경험이 제한된 사용자에게는 대량의 데이터를 처리하는 것이 어려울 수 있으며, 결과의 생물학적 중요성을 손상시킬 수 있습니다.
이러한 문제를 해결하기 위해 면역형광 준비 및 데이터 분석을 위한 상세한 단계별 프로토콜을 도입하여 다양한 조직 패턴으로 단백질 염색을 정량화하는 편향되지 않은 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다(그림 1). 이 반자동 파이프라인은 계산 및 이미징 분석에 대한 전문 지식이 제한된 사용자를 위해 설계되었습니다. 두 가지 확립된 피지 플러그인인 FindFoci22 및 3D suite23의 기능을 결합합니다. FindFoci의 정확한 초점 식별 기능을 3D 제품군이 제공하는 3D 공간의 물체 식별 및 세분화 기능과 통합함으로써 우리의 접근 방식은 각 획득 필드에 대해 채널당 두 개의 CSV 파일을 생성합니다. 이 파일에는 세포당 초점의 수, 핵 중심에서 초점까지의 거리, 미만성 단백질 염색을 위해 도입한 비균질성 계수(IC)와 같은 다양한 유형의 신호 분포에 적합한 메트릭을 쉽게 계산할 수 있는 보완 정보가 포함되어 있습니다. 또한 데이터 처리 기술이 제한된 사용자에게 데이터 외삽이 시간이 많이 걸릴 수 있음을 알고 있습니다. 이 프로세스를 간소화하기 위해 각 실험에 대해 수집된 모든 측정값을 단일 파일로 자동으로 컴파일하는 Python 스크립트를 제공합니다. 사용자는 프로그래밍 언어 소프트웨어를 설치할 필요 없이 이 스크립트를 실행할 수 있습니다. 브라우저에서 직접 Python 스크립트를 작성할 수 있는 클라우드 기반 플랫폼인 Google Colab에서 실행 코드를 제공합니다. 이를 통해 우리의 방법은 직관적이고 즉시 사용할 수 있도록 쉽게 액세스할 수 있습니다.
우리는 두 가지 핵 단백질, 즉 BRD4(Bromodomain-possession protein 4) 및 SUZ12(Suppressor of zeste-12)의 신호 분포 변화를 분석하고 정량화하는 데 있어 프로토콜의 효과를 입증합니다. BRD4는 중합효소 II 의존성 전사 개시24,25와 관련된 응축물을 형성하는 것으로 알려진 매개체 복합체 내에서 잘 문서화된 코액티베이터 단백질입니다. SUZ12는 H3K27me3 히스톤 변형26,27의 침착을 조절하는 Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2)의 단백질 구성 요소입니다. 이들 단백질은 두 가지 별개의 세포 유형 내에서 서로 다른 패턴을 보인다: 갓 분리된 인간 CD4+ naive T 세포는 정지 상태이며 느린 전사 활성 속도를 보이며, 체외 분화된 TH1 CD4+ 세포는 전문화되고 증식하는 effector cell로서 증가된 transcription28을 보인다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Safe-Lock Tubes</td>
			<td>Eppendord</td>
			<td>#0030121503</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#612-3700</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#2149P-HR</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#352070</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L barrier pipette tip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#2069-HR</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antifade solution - ProlongGlass - mountingmedia</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#P36984</td>
			<td>Step 1.3.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#A7030</td>
			<td>Step 1.3.6., 1.3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>#130-096-533</td>
			<td>Step 1.1.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat#D1306</td>
			<td>Step 1.3.10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Step 1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-activator anti-CD3/anti-CD28 bead</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#1131D</td>
			<td>magnetic beads step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>#4146320</td>
			<td>Step 1.2.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria SORP</td>
			<td>BD Bioscences</td>
			<td></td>
			<td>Step 1.1.3. Equipped with BD FACSDiva Software version 8.0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#10270106</td>
			<td>Step 1.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FICOLL PAQUE PLUS</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>GEH17144003F32</td>
			<td>Step 1.1.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Version 2.14.0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Protocol section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip (10 mm, thickness 1.5 H)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>#72298-13</td>
			<td>Step 1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G5516</td>
			<td>Step 1.2.7-1.3.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit AF568 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td>Step 1.3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#320331</td>
			<td>Step 1.3.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human neutralizing anti-IL-4</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat#130-095-753</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human recombinant IL-12</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat#130-096-704</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human recombinant IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>Cat#130-097-744</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 Confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>-</td>
			<td>Protocol section 2, Equipped with HCX PL APO 63x, 1.40 NA oil immersion objective, with an additional 3x zoom. Pinhole size : 0.8 AU. Line average 2&#215;. Frame size 1024&#215;1024 pixel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11140035</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>#631-1552</td>
			<td>Step 1.3.12.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-Human CD4 APC-Cy7 (RPA-T4 clone)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>#557871</td>
			<td>Step 1.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-Human CD45RA PECy5 (5H9 clone)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>#552888</td>
			<td>Step 1.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-Human CD45RO APC (UCHL1 clone)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>#130-113-546</td>
			<td>Step 1.1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 24 well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>#353047</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
			<td>Step 1.3.6., 1.3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#14190094</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#15070063</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P6148</td>
			<td>Step 1.2.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P8920</td>
			<td>1.2.1.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody - BRD4</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>#ab128874</td>
			<td>Step 1.3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody - SUZ12</td>
			<td>Cel Signalling</td>
			<td>mAb #3737</td>
			<td>Step 1.3.6.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 W/GLUTAMAX-I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#61870010</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#11360039</td>
			<td>Step 1.1.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T8787</td>
			<td>Step 1.2., 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P9416</td>
			<td>Step 1.3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Protocol section 1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a versatile pipeline for analyzing dynamic changes in nuclear bodies in a variety of cell types

전사 제어(transcriptional control)와 같은 다양한 핵 과정은 면역형광 기법을 통해 식별할 수 있는 병소(foci)로 알려진 개별 구조 내에서 발생합니다. 현미경을 통해 다양한 세포 조건에서 이러한 병소의 역학을 조사하면 세포 정체성과 기능을 지배하는 분자 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 그러나 다양한 세포 유형에 대해 면역형광 분석을 수행하고 이러한 병소의 조립, 확산 및 분포의 변화를 평가하는 것은 많은 과제를 제시합니다. 이러한 과제에는 시료 전처리, 이미징 데이터 분석을 위한 파라미터 결정, 상당한 양의 데이터 관리의 복잡성이 포함됩니다. 더욱이 기존 이미징 워크플로우는 숙련된 사용자에게 맞춤화된 경우가 많아 더 많은 사용자에 대한 접근성이 제한됩니다.
이 연구에서는 관심 단백질 및 세포 유형에 맞게 맞춤화할 수 있는 다양한 인간 일차 T 세포 유형의 핵 단백질을 조사하기 위해 맞춤화된 최적화된 면역형광 프로토콜을 소개합니다. 또한, 단백질 염색이 뚜렷한 병소를 형성하거나 확산성 핵 분포를 나타내는지 여부에 관계없이 편향되지 않게 정량화하는 방법을 제시합니다.
당사가 제안하는 방법은 자이썬에서 개발되고 피지에서 실행 가능한 반자동 파이프라인을 활용하여 세포 염색에서 분석에 이르기까지 포괄적인 가이드를 제공합니다. 또한 데이터 관리를 간소화하기 위해 사용자 친화적인 Python 스크립트를 제공하며, Google Colab 노트북에서 공개적으로 액세스할 수 있습니다. 당사의 접근 방식은 다양한 상황에서 다양한 핵 조직 패턴을 가진 단백질에 대해 매우 유익한 면역형광 분석을 수행하는 데 효능이 있음을 입증했습니다.

The organization of the eukaryotic genome is governed by multiple layers of epigenetic modifications1, coordinating several nuclear functions that can occur within specialized compartments called nuclear bodies or condensates2. Within these structures, processes such as transcription initiation3, RNA processing4,5,6, DNA repair7,8, ribosome biogenesis9,10,11, and heterochromatin regulation12,13 take place. The regulation of nuclear bodies adjusts over both spatial and temporal dimensions to accommodate cellular requirements, guided by principles of phase separation14,15. Consequently, these bodies function as transient factories where functional components assemble and disassemble, undergoing changes in size and spatial distribution. Hence, understanding the characteristics of nuclear proteins by microscopy, including their propensity to form bodies and their spatial arrangement in different cellular conditions, offers valuable insights into their functional roles. Fluorescence microscopy is a widely used method for studying nuclear proteins, allowing their detection through fluorescent antibodies or directly expressing targets with a fluorescent protein reporter16,17.
In this context, nuclear bodies appear as bright foci or puncta, with a notable degree of sphericity, making them easily distinguishable from the surrounding environment16,18. Super-resolution techniques like STORM and PALM, by providing improved resolution (up to 10 nm)19, enable more precise characterization of the structure and composition of specific condensates20. However, their accessibility is limited by equipment expenses and the specialized skills needed for data analysis. Therefore, confocal microscopy remains popular due to its favorable balance between resolution and wider usage. Such popularity is facilitated by the inherent removal of out-of-focus light, which diminishes the requirement for extensive post-processing procedures for accurate segmentation, its widespread availability in research institutes, its effective acquisition time, and sample preparation that is typically efficient. However, accurately measuring protein distribution, assembly, or diffusion using immunofluorescence assays across diverse cellular conditions poses challenges, as many existing methods lack guidance on selecting suitable parameters for proteins with varying distribution patterns21. Moreover, handling the resulting large data volume can be daunting for users with limited experience in data analysis, potentially compromising the biological significance of the results.
To address these challenges, we introduce a detailed step-by-step protocol for immunofluorescence preparation and data analysis, aiming to provide an unbiased method for quantifying protein staining with various organization patterns (Figure 1). This semi-automated pipeline is designed for users with limited expertise in computational and imaging analysis. It combines the functionalities of two established Fiji plugins: FindFoci22 and 3D suite23. By integrating the precise foci identification capability of FindFoci with the object identification and segmentation features in 3D space offered by 3D suite, our approach generates two CSV files per channel for each field of acquisition. These files contain complementary information that facilitates the calculation of metrics suitable for various types of signal distribution, such as the count of foci per cell, the distance of foci from the nuclear centroid, and the inhomogeneity coefficient (IC), which we have introduced for diffuse protein staining. In addition, we acknowledge that data extrapolation can be time-consuming for users with limited data handling skills. To streamline this process, we provide a Python script that automatically compiles all collected measurements into a single file for each experiment. Users can execute this script without the need to install any programming language software. We provide an executable code on Google Colab, a cloud-based platform that allows the writing of Python scripts directly in the browser. This ensures that our method is intuitive and readily accessible for immediate use.
We demonstrate the effectiveness of our protocol in analyzing and quantifying alterations in signal distribution of two nuclear proteins: Bromodomain-containing protein 4 (BRD4) and Suppressor of zeste-12 (SUZ12). BRD4 is a well-documented coactivator protein within the Mediator complex known to form condensates associated with polymerase II-dependent transcriptional initiation24,25. SUZ12 is a protein component of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) responsible for regulating the deposition of H3K27me3 histone modification26,27. These proteins exhibit different patterns within two distinct cell types: freshly isolated human CD4+ na&#239;ve T cells, which are quiescent and exhibit slow rates of transcriptional activity, and in vitro differentiated TH1 CD4+ cells, which are specialized, proliferating effector cells showing increased transcription28.

저자 스포트라이트: 면역형광 분석을 사용하여 인간 세포 가소성 및 환경 적응을 조사하기 위한 포괄적인 후성유전학적 분석

다양한 세포 유형에서 핵체의 동적 변화를 분석하기 위한 다목적 파이프라인

Our main research interest is an epigenetic mechanism that regulates human cellular elasticity and environmental adaptation. I am currently focusing on studying how changes in chromatization within a nuclear condensate three pathological cellular conditions. I believe that studying the biophysical properties of chromatization opens a new field and offers unique opportunities for developing novel therapeutic approaches.Immunofluorescence assays are valuable for screening protein organization in nuclear condensates. However, human genetics can be challenging due to parameter selection issues and large data volume when studying multiple conditions. We offer a comprehensive with guidance on how to use the right parameters and automated analysis pipeline to streamline the process.Our protocol guides user from sample preparation to the analysis. We provided a simulated pipeline design through Doza with limited computation and image analysis expertise. The workflow is accessible to everyone at no cost, and leveraging widely adoptable software like Imogene and Python and the free cloud based service Google Colab.

이 방법의 개요된 프로토콜은 인간 일차 T 세포 내 핵 단백질 염색의 변화를 시각화하고 정량화하는 데 도움이 되며, 다양한 세포 유형 및 단백질 표적에 맞게 맞춤화할 수 있습니다. 사례 연구로, naive 및 TH1 CD4+ 세포에서 BRD4 및 SUZ12의 염색을 수행하고 분석했습니다.
BRD4는 정지 미아 세포와 분화된 TH1 CD4+ 세포 모두에서 잘 점선으로 표시...

이 방법은 인간 T 림프구에서 다양한 핵 조직 패턴을 가진 단백질 분포를 평가하기 위한 면역형광 프로토콜 및 정량화 파이프라인을 설명합니다. 이 프로토콜은 시료 전처리부터 시작하여 피지에서 반자동 분석을 실행하는 단계별 지침을 제공하며, Google Colab 노트북을 통한 데이터 처리로 마무리됩니다.

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the ...

a-versatile-pipeline-for-analyzing-dynamic-changes-nuclear-bodies

Research

JoVE Journal

Genetics

A Versatile Pipeline for Analyzing Dynamic Changes in Nuclear Bodies in a Variety of Cell Types

273 조회수.  Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM). 우리의 주요 연구 관심사는 인간의 세포 탄성과 환경 적응을 조절하는 후성유전학적 메커니즘입니다. 저는 현재 핵 응축수 내에서 크로마화의 변화가 어떻게 세 가지 병리학적 세포 상태에 있는지 연구하는 데 집중하고 있습니다. 저는 크로마화의 생물물리학적 특성을 연구하는 것이 새로운 분야를 열고 새로운 치료법을 개발할 수 있는 독특한 기?...

비디오: 저자 스포트라이트: 면역형광 분석을 사용하여 인간 세포 가소성 및 환경 적응을 조사하기 위한 포괄적인 후성유전학적 분석

Various nuclear processes, such as transcriptional control, occur within discrete structures known as foci that are discernable through the immunofluorescence technique. Investigating the dynamics of these foci under diverse cellular conditions via microscopy yields valuable insights into the molecular mechanisms governing cellular identity and functions. However, performing immunofluorescence assays across different cell types and assessing alterations in the assembly, diffusion, and distribution of these foci present numerous challenges. These challenges encompass complexities in sample preparation, determination of parameters for analyzing imaging data, and management of substantial data volumes. Moreover, existing imaging workflows are often tailored for proficient users, thereby limiting accessibility to a broader audience.
In this study, we introduce an optimized immunofluorescence protocol tailored for investigating nuclear proteins in different human primary T cell types that can be customized for any protein of interest and cell type. Furthermore, we present a method for unbiasedly quantifying protein staining, whether they form distinct foci or exhibit a diffuse nuclear distribution.
Our proposed method offers a comprehensive guide, from cellular staining to analysis, leveraging a semi-automated pipeline developed in Jython and executable in Fiji. Furthermore, we provide a user-friendly Python script to streamline data management, publicly accessible on a Google Colab notebook. Our approach has demonstrated efficacy in yielding highly informative immunofluorescence analyses for proteins with diverse patterns of nuclear organization across different&#160;contexts.

This method describes an immunofluorescence protocol and quantification pipeline for evaluating protein distribution with varied nuclear organization patterns in human T lymphocytes. This protocol provides step-by-step guidance, starting from sample preparation and continuing through the execution of semi-automated analysis in Fiji, concluding with data handling by a Google Colab notebook.

연구

유전학

Quantification Pipeline for Evaluating Protein Distribution with Varied Nuclear Organization Patterns in Human T Lymphocytes

To begin, download and install the latest version of Fiji on a computer. After downloading the convert_to_TIFF. py script, drag and drop the script on Fiji and run the code.Browse to the path where the experiment is stored. The converted TIFF files are created within the same experimental folder. Click on plugins, then 3D Suite, and open the 3D manager options.Within the 3D manager window, select the check boxes corresponding to the volume in unit, mean gray value, bounding box in pixel, standard deviation gray value, centroid in pixel, and centroid in unit. Tick the exclude objects on edges XY, and exclude objects on edges Z.Then, click okay. Open the fluorescent image of human T-lymphocytes.Click Control Shift D to duplicate the protein channel, including the stack. Check the hyper stack checkbox. Specify the appropriate channel number within the channels box and rename it accordingly.To launch the Fiji macro recorder, navigate to the plugins, then macros, and select record. Then, to open the FindFoci plugin, sequentially click on plugins GDSC, FindFoci, and FindFoci GUI. From the image dropdown menu, select the image to be analyzed.Set the Gaussian blur to 1.5, background method to standard deviation above mean, background parameter to nine, search method to fraction of peak background, search parameter to 0.7, peak method to relative above background, peak parameter to 0.2, and minimum size to five. Set the max peaks to high numbers to include all foci in the image. To enhance foci identification, adjust the Gaussian blur close to the foci diameter, and increase the values of the background parameter to impose more stringent thresholds.Then, decrease the values of the search parameter to include areas farther away from the fluorescence peak and decrease the values of the peak parameter for the separation of peaks. Run FindFoci and copy the string that appears in the recorder window. The string contains the selected parameters, excluding the quotation marks.After downloading the nuclear_prod_q. py script, drag and drop the script on Fiji, and click run to execute the code. In the nucleus channel, enter the number corresponding to the channel of DAPI.For nucleus Gaussian blur, enter the value of sigma needed to blur the image for segmentation. Then, enter the number corresponding to the channel of the staining of interest for the protein channel. In the FindFoci parameter, paste the string representing the macro recording of the selected parameters.Tick the visual check box and click browse to select the directory where the images are stored. Once all boxes are compiled, click okay to continue the execution. From the ROI list in the ROI manager 3D window, select the nuclei channel, and click live ROI to on.Select the ROI belonging to the same nucleus and press merge. And for undesired nuclei, press delete. Again, click live ROI to on, select all, and confirm that all nuclei are correctly segmented.From the quantification folder, open the TXT file with records of the parameters used for the analysis. Open Google Colab in a browser. Then, from the file, select open notebook, and upload the final nuclear protein metrics.ipynb script. Upload all the folders containing the CSV files of each image field into a folder of preference in Google Drive. In the notebook, indicate the path of the folder where the results sub-folders are stored and run all cells.When the code has finished compiling, open the final spreadsheet file containing all the compiled data.