この作業は、部分的にgrantないによってサポートされていました。イスラエル科学財団から213/09には、何を許可しない。 BSF基礎から2005258、助成金がない。欧州研究評議会（ERC）から201665、およびテクニオンでラッセルベリーナノテクノロジー研究所による。我々は、シアノバクテリアの供給及び取り扱いに関するテクニオンの化学のシューリックの学部から教授ノームADIRとファリスサラミの助けを認める。テクニオンマイクロナノファブリケーションユニットからのヘルプとスヴェトラーナYoffisのサポートが大幅に高く評価されています。

1。 ESRマイクロイメージングの概要最初に、我々は、ESRの簡単な説明、ESR顕微鏡、そして私たちのシステムのさまざまなコンポーネントを提供し、我々は、実際のイメージング実験を説明します。 電子スピン共鳴は、特定の周波数での電磁放射が外部静磁場（図1）下に置かれ、不対電子のスピンを持つ分子によって吸収される分光技術です。 ESRは、フリーラジカルや常磁性中心の検出と識別のために、このような化学、生物学、物理学、材料科学などの科学の幅広い分野で採用されている。それはライブの種で常磁性分子の環境を研究するための強力な方法であり、酸性度（pH値）、粘度、酸素、および活性酸素種の濃度が3に関する情報を提供します。 異種のサンプルについて、ESRスペクトル情報は、磁場勾配4の使用によって、（すなわち、画像を取得することによって）空間分解方法で得ることができます。これは主にプロトンのスピンを観測する磁気共鳴イメージングのより一般的な方法（MRI）と非常によく似ています。これまで、このようなESRイメージング技術は、数センチの比較的大きなサイズで、mmはスケールの分解能で生きたままの標本に適用した。 ESRイメージングにおける（例えば、参考文献5から取り出した図2を参照。）比較的最近の開発は、ミリ波、サブミリサイズの試料の測定値にミリメートルスケールの分解能で小動物を見てからその機能を拡張したものですミクロンスケールの分解能。このフィールドは、1ミクロン2（図3に代表的な例を参照）に近づい分解能で3次元ESR画像を提供することができる今日ESR顕微鏡、として知られています。 ESR顕微鏡は、従来のESR分光器と本質的に似ています。これは、取得プロセスおよびデータ処理を制御するための静的フィールド、スピン励起と信号検出のためのマイクロ波システム、サンプルを保持するためのプローブ、およびコンピュータ化されたコンソールを生成するための磁石を持っています。一般的にESRイメージングユニークとESR縮小コピーを作るにも、既存の他のコンポーネントには、イメージングプローブに配置されている磁気電子システムの一部であるフィールドの勾配の源、および勾配コイルです。私たちの特定のシステムの詳細については、プロトコルの映画の中で示され、参考文献2に記載されています。 2。 ESRマイクロイメージングサンプルの調製この段階では、ESRマイクロイメージングの実験用サンプルの調製方法を説明します。この段階の細胞の最後にトリチルラジカル6の緩衝液と一緒に特別に準備ガラスのESR顕微鏡の試料容器の底部に配置されます。このプロトコルは、シアノバクテリア細胞の測定を説明し、従って、細胞の他のタイプのため、適切な調整は、サンプルの準備段階で必要になることがあります。 <ol><li>最初に、〜400 400μmの大きさと吸収紙のいくつかの正方形を取り、続いてシアノバクテリア懸濁液1.2 mlを（40 mg / mLの濃度で）で満たされているエッペンドルフチュー​​ブに挿入されます。 </li><li>懸濁液を微量遠心機で6000rpmで2分間遠心分離する。 </li><li>この後、上清バッファが完全に藍藻脱水​​を避けるために残っている〜50μLを除いて削除されます。このプロセスの結果として、吸収紙は現在シアノバクテリアの細胞が飽和している。 </li><li>細かいピンセットを使って、いくつかの繊維が紙から抽出され、カップ状、特別に準備ガラスの試料ホルダー7の底部に配置されます。 BG - 11溶液8、9のトリチル3mMのは（スキーム1参照）細かいシリンジの援助により、試料ホルダーに追加されていることを以下。ホルダーは、小さな排気口が開いたまま、UV硬化型接着剤を用いて封止されている。 <table border="1"><tbody><tr><td> 株式4 </td><td> 株式3 </td><td> 在庫2 </td><td> 在庫1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4：3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4を ： 7H 2 O 7.5g/liter </td><td>のNa 2 MgのEDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2を ：4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td>クエン酸第二鉄アンモニウムの0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4 · 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td>クエン酸：1H2O 0.6g/liter </tD&gt; </tr><tr><td> 4 ·：5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> 塩化カルシウム：2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td>のCoCl 2 ：6H 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4：2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> スキーム1。BG - 11培地の調製。 </li></ol> 3。 ESRマイクロイメージング実験<ol><li>イメージング実験を開始するには、ESRマイクロイメージングシステムをオンにし、イメージングプローブの内部に入ることを共振器に試料を挿入する。 </li><li>今、コンピュータの制御ソフトウェアを使用して、&quot;チューニング&quot;モードでシステムを設定し、ESR測定に使用されるプローブの共振マイクロ波の周波数を見つける。 </li><li>ていることに続いて、適用されるマイクロ波の周波数と一致する値に静磁場を設定し、パルスシーケンスのタイミングパラメータを設定してもシステムが機能するとサンプルが十分用意されていることを確認するためにESR信号を観測。 </li><li>その後、このような画素数としてイメージングパラメータ、、勾配の強さ、そしてそれらの必要な値に勾配パルスの長さを設定します。 </li><li>セットアップに続いて、パルス間の分離、500、600の値、および700ナノ秒とハーンエコーイメージングのパルスシーケンス（図4）によって三次元ESR画像を収集する。 </li><li>サンプルで投射された光は、必要な実験条件に応じてオンまたはオフになっています。 </li><li>買収時には、データが自動的に保存されます。論文生データファイルは、トリチルラジカル濃度と緩和時間の画像をT 2、既存のキャリブレーションを介して酸素濃度の画像に変換されるマップを、提供するために、MATLABソフトウェアのスクリプトを介して処理されます。 </li></ol> 4。代表的な結果実験の結果は、異なるτの値で記録された複数の三次元ESRマイクロ画像です。典型的な生データの画像を図5に提供されています。暗条件下で測定した上位3つの画像は、信号強度の減少を除いて非常によく似ています。一方、試料の異なる部分で異なる緩和時間による光照射下での画像パターンの変化。このデータは、図6に示すように、また、緩和時間、T 2（図7）の画像、振幅の画像を取得するには、1を処理することができます。 T 2の画像は、方程式を経由して緩和時間に酸素濃度を結ぶ既存の検量線を経由して酸素濃度の値に変換されます。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="式（1）" />ここで、T 2 0は、無酸素条件下でのプローブのスピン-スピン緩和時間（プローブの濃度、C、に応じて、その拡散係数、D）であり、kは比例定数である。ほとんどの場合、拡散係数は、（必要であれば、それは原則的に直接ESR 6,10によっても評価できる、が）ライブサンプルのためにあまり変化しない、とスピン濃度は、イメージングプロセス中に取得されたものです。したがって、この関係は直接に酸素濃度を測定することができます。 図6に戻ると、それは、シアノバクテリアの細胞は主に、サンプルホルダの右側に位置していることが振幅画像から明らかである。さらに、図7に基づいて、それは光がO 2の生産を開始し、主にシアノバクテリアに近いボクセルで、ソリューションのO 2濃度の有意な増加を引き起こすことは明らかである。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：電子スピン共鳴のエネルギー準位。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：担癌マウスの代表的な酸素濃度のイメージ。左の画像は、MRI画像に基づいて、解剖学的情報を示しています。安定した遊離有機ラジカルは、マウスに注入し、そのESR特性は、その環境での酸素濃度を（右）を提供した。 ESRベースの結果は、MRI解剖学的画像上に重畳されています。ビューのフィールドは32 mmです。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：高分解能マイクロスケールのESの二つの例N @ C 60粉末（左）とLiPc常磁性結晶とフォトリソグラフィにより生成されたサンプルのRの画像（右） <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：典型的なマイクロ波を示すハーンイメージングパルスシーケンス（MW）と勾配、G X、G y及びG zのパルス。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="図5" /> 図5：典型的な生データESRマイクロ画像：a、b、およびcはそれぞれ、τ= 500600700ナノ秒で測定された無光照射によるシアノバクテリアサンプルの生データです。項目D、E、及び、b、およびcと同じですが、光照射と同じです。強度は、（が、3つの暗いまたは明るい生データの画像の各セット内で一貫している）任意のスケールでプロットされています<img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="図6" /> 図6：溶液中のラジカル濃度（任意スケール）に対応する振幅画像。 <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="図7" /> 図7：T 2の画像と対応する値が暗い（左）とライト（右）の条件の下で[O 2]。

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルは、ESRマイクロイメージングは​​、ライブの小さな試料の近くに酸素濃度をマップに適用できる方法を示しています。 〜30の空間分解能は、× 30 × 100μmの近マイクロモルの酸素濃度の感度とボクセル毎のサブフェムトモル絶対酸素感度で、実証されている。細胞の近くに酸素のマッピングのためのESRマイクロイメージングの使用は、微小電極や燐光/蛍光に基づいて、現在利用可能な技術を補完します。さらに、適切な常磁性プローブ​​と、それは細胞内の酸素マイクロイメージング、他の方法を達成するの​​は非常に困難な能力のために容易に適用されます。近い将来、我々はもちろんのスーパーオキシドの濃度、酸性度（pH値）、プローブの拡散係数と、酸素濃度などのコントラストのパラメータを提供、さらに数ミクロンの分解能でのライブのサンプル画像を提供するために、この方法論を改善する予定。これらの機能は、両方ともコントラストタイプのとまたサンプルの特性（例えば、非透過的な厚さのサンプルと、いくつかのケースでは、細胞対細胞の測定）の点で現在の光ベースの手法と相補的である。

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Heraus, 75003235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Microliter 7000.5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Curing</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA63, or NOA61.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

このプロトコルは、ミクロンスケールの分解能1で生きている細胞の直接の環境中の酸素濃度の三次元マッピングのための電子スピン共鳴（ESR）マイクロイメージングの方法を説明します。酸素は生命のサイクルの中で最も重要な分子の一つである。それはミトコンドリアで酸化的リン酸化の端末の電子受容体として機能し、活性酸素種の生産に使用されています。酸素の測定は、ミトコンドリアや代謝機能、シグナル伝達経路、様々な刺激、膜透過性、および疾患の分化の効果の研究に重要である。酸素消費量は、全体の生物への細胞へのミトコンドリアからの様々な生物学的システムに広く適用可能である、したがって、細胞代謝の有益なマーカーです。その重要性から、多くのメソッドは、ライブシステムでの酸素の測定のために開発されている。高解像度の酸素のイメージングを提供するために、現在の試みは、主に彼らは高い光毒性および低酸素感度を持つプローブを採用するとして、満足のいく結果を提供することができない光学的蛍光と燐光の方法に基づいています。サンプル中の外因性の常磁性プローブ​​からの信号を測定するESRは、酸素濃度の非常に正確な測定を提供することが知られている。典型的なケースでは、ESR測定は、プローブの線形拡大および/または局所酸素濃度に直接リンクされている緩和時間の短縮をマップします。 （酸素は常磁性であるため、外因性の常磁性プローブ​​に衝突するときに、その緩和時間を息切れ。）伝統的に、実験のこれらのタイプは、低解像度、小動物イメージングのためのミリメートルスケールのESRで行われている。ここでは、ESRイメージングも小さなライブサンプルの検査のためにミクロンスケールで実施することができる方法を示します。 ESRマイクロイメージングは、室温2で1ミクロンに近づき解像度と空間分解ESR信号の取得を可能にする比較的新しい手法です。このプロトコルは、紙の主な目的は、この新しいメソッドは、新しく開発された酸素に敏感なプローブと一緒に、小さなライブ試料中の酸素濃度のマッピングに適用できる方法を示すことです。 〜30の空間分解能は、× 30 × 100μmの近マイクロモルの酸素濃度の感度とボクセル毎のサブフェムトモル絶対酸素感度で、実証されている。細胞の近くに酸素のマッピングのためのESRマイクロイメージングの使用は、微小電極や燐光/蛍光に基づいて、現在利用可能な技術を補完します。さらに、適切な常磁性プローブ​​と、それはまた、細胞内の酸素マイクロイメージング、他の方法を達成するの​​は非常に困難な能力のために容易に適用されます。

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Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

このプロトコルは、電子スピン共鳴顕微鏡による生細胞の周囲の環境中の酸素濃度のミクロンスケールの三次元イメージングのための方法を説明します。

電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K ビュー.  The Technion, Israel Institute of Technology. このプロトコルは、電子スピン共鳴顕微鏡による生細胞の周囲の環境中の酸素濃度のミクロンスケールの三次元イメージングのための方法を説明します。

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A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

見つけにくい小型哺乳類から高品質のDNAを得るために非侵襲ヘアサンプリング法

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

生物学

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

一酸化窒素とスピントラップを使用して、細胞からの電子常磁性共鳴分光法によるスーパーオキシドアニオンラジカルの検出

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

生物発光共鳴エネルギー転移を用いて生細胞中のタンパク質 - タンパク質相互作用を調査する

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

マリンTubewormでライブ光学および電子顕微鏡技術を用いた石灰化イベントのキャラクタリゼーション

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

同時マッピングとヒトのミトコンドリア DNA のリボヌクレオチドの定量

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

有害な効果の低圧プラズマ滅菌を使用して住んでいる携帯顕微鏡枯草菌胞子の生存に調査

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

切り替え可能なプロトポルフィリンIX依存性活性酸素種のin situ光生成によるマウス皮膚における幹細胞ニッチの刺激と組織再生

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

交配ミツバチクイーンズへの農薬リスクの評価

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...