この作品は、研究所国立デ·ラ·サンテら·デ·ラ·ルシェルシュMédicaleによってサポートされていました、センター国立·デ·ラ·ルシェルシュ科学研究、大学·デストラスブール、HOPITALデストラスブール、協会注ぐラ·ルシェルシュシュルルがん、研究所国立デュがん、アジャンス国立·デ·ラ·ルシェルシュ·地域アルザス。 ピエトロLANEVEはラ·ルシェルシュMédicaleを注ぐ財団によってサポートされています。現在は、イスティトゥーイタリアーノTecnologia（IIT）フェローシップの受信者である。出版費用はNeurexネットワークによってサポートされている（TriNeuron - プログラムINTERREG IVオーバーライン）

1サンプル採取<ol><li>ピペッティングにより半接着性のシュナイダー2細胞、（平均して1〜5×10 6細胞）を、外し、遠心分離（1分間100×g）で、それらを収穫。 in vitroで培養された接着細胞の場合には、標準的な条件下でそれらをトリプシン処理、または直接細胞スクレーパーの助けによって、RNA抽出試薬の好都合な量にプレートからそれらを集める。 </li><li>胚のコレクションのために、フライケージにショウジョウバエ株を成長し、胚は産卵のプレート上に蓄積してみましょう。蒸留水（のdH 2 O）中の絵筆によって胚を拭き取り、ふるいフィルタリングによって破片を廃棄し、バイアル48内の胚を洗浄し、回復。 </li><li>代替手法として、手動で組織/器官を解剖。可視ように解剖針又は鉗子を用いて、実体顕微鏡（20倍倍率）下でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にショウジョウバエ腹部から精巣（piRNAの分析のための優先的なシステム）を単離サリバンら 49にualized。 </li><li>杵は、RNA抽出試薬の0.5容量の中毒の際にサンプルを均質化する。 </li></ol> 2 RNA抽出/分析<ol><li>続いて、製造者の指示は、市販の試薬 ​​を介してRNAの単離を行う。 注意！RNA抽出剤は、通常、有毒で腐食剤である。または、次のように、RNA単離のための50のプロテイナーゼKベースのプロトコルを適用します。 <ol><li>ストップ·ミックスを400μlにサンプルを希釈し、15分間RTでインキュベートする。 </li><li>クロロホルム：イソアミルアルコールおよびクロロホルム抽出およびエタノール（EtOH）沈殿/洗浄により、標準的なフェノールによる水溶性成分を回収。空気のサンプルを乾燥し、ジエチルピロカーボネート（）内に再懸濁し、二重（DD）、H 2 Oを蒸留-処置</li></ol></li><li>紫外線分光光度測定によってRNA濃度を評価する。また、RNAの純度が2.0に近い、高い浅を確保260上のED / 280読書。 </li><li>次のように変性アガロースゲル上でRNA調製を確認します。 <ol><li>きれいなビーカーに、連続撹拌下で、DEPC-のddH 2 O 82 mlのアガロース1.2gを溶解する。完全に溶解するまで煮る。 </li><li>ゲル溶液を冷却して;温度が到達したときに60℃で10倍4 -モルホリンプロパンスルホン酸の10ミリリットルを追加（MOPS）1X最終濃度（FC）にバッファリングし、3％のFCへの37％ホルムアルデヒドの8ミリリットル。 注意！ホルムアルデヒドは発がん性物質である。 </li><li>水平電気泳動セル内にゲルを注ぐ。ゲルは、少なくとも1時間、フードの下で固化させます。固化後、M​​OPS 1Xにジェルを沈める。 </li><li> RNAサンプルおよびラダーを1μgのアリコート2μgの（正確な評価が望まれるときにRNAマーカーを使用します）。 RNAにアガロースローディング色素（ALD）の3容量を追加し、ラダーする。氷上で5分、すぐに涼しい70℃で加熱する。 カリフォルニア州UTION！ALDの内容（エチジウムブロマイドおよびホルムアミド、マテリアルを参照）は、それぞれ、変異原と腐食性である。 </li><li>サンプルをロードし、時折バッファのリサイクルで約1時間、50Vでゲルを実行します。 UV視覚化またはゲルイメージングによるRNA分画パターンを確認してください。 28Sおよび18SのrRNAおよびtRNAのに対応した離散的なバンドを認識します（ 図1を参照）。 </li></ol></li><li> -80℃で、ノーザンアッセイまたはストアRNAに進​​みます。 </li></ol> 3変性アクリルアミドゲルの準備<ol><li>この分画工程（プレートサイズ約8cm×9センチ、櫛の厚さ0.75ミリメートル）のための小さな縦型電気泳動装置を使用してください。 </li><li>鋳造フレームで一緒にきれいなガラスを組み立てます。 </li><li> MOPS 1X、7 M尿素溶液：10％アクリルアミド/ビスアクリルアミドの10ミリリットル（1〜19）を準備します。すぐに注ぐ前、10％の過硫酸アンモニウムとTEMED10μlを100μlのを追加し、迅速に溶液を混合。 注意！アクリルアミドは神経毒性や発がん性物質である。 </li><li>ガラス板の間にゲルを注ぎ、泡を避けるために、慎重によくコームを挿入します。ゲルは、使用前に少なくとも45分間RTで重合しましょう​​。別の方法として、ゲル、O / N、水に浸したろ紙に包み、サランラップで密封して保管してください。 </li></ol> 4。サンプル調製<ol><li>各サンプルの全RNAのアリコート0.5〜20μgの。ボリューム3-4μlのを超えた場合、真空は、サンプルを乾燥する。 </li><li>サイズ決定のために、マーカーとして（調製のためのセクション4.3および4.4を参照）、サンプルと平行に放射性標識された低域のはしごの一部（20〜30 CPS）を実行します。ステップ4.5で説明したように、試料と平行して、それを扱う。 </li><li>ラダー10bpのステップラダー0.1μgのを使用して、リン酸正反応を設定します。 30分間37℃でインキュベートし、20mMのFCにエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を添加することによって反応を停止させる。 </li><li>エタノール沈殿/洗浄、空気乾燥によって精製し、のddH 2 O（約100μl）中に再懸濁。 注意！32 Pが放射線源である。 </li><li>各試料にアクリルアミド青色色素（ABD）、等量のを追加します。 5分間80℃で加熱することにより変性させ、積載。 注意まで、氷上でクール！ホルムアミド（ABDの内容は）腐食性である。 </li></ol> 5。電気泳動分画<ol><li>キャスティング支持体からガラスプレートを取り外し、適切に電気泳動セルでそれらを組み立てる。十分なランニングバッファー（RB）との内側と外側の両方のチャンバーを埋める。 </li><li>ゆっくりとコームを削除し、10分間、200Vでゲルを事前に実行します。サンプルをロードする前に、注射器を介して、いくつかのRB潮吹きによってウェルから尿素預金を洗い流す。 </li><li>各ウェルの底に段差4.5から慎重に層別サンプルに平らなヒントを参考にしてください。反転実行を回避するために、アノードとカソードの接続を確認してください。サンプルを5分間、100Vでゲルを入力した後、私200 Vに電圧をncrease </li><li>約7cmの分別の長さのために、45分、長い目で見れば十分です。ゲルをオーバーフローするブロモフェノールブルー（ABDト​​ラッキング顔料）は避けてください。 </li><li>オプションのステップとして、臭化エチジウム（EtBrを）染色によって分画し、長いRNAをゲル上、可視化： <ol><li>ゲルの上部から徒歩2センチカットし、簡単にのddH 2 Oのスライスをすすぐ</li><li> RB、EtBrを0.5 / mlのFC緩やかなshackingで15分間、室温でゲルスライスをインキュベートする。 </li><li> RBで15分間ゲルを脱色、UV照射またはゲルイメージングによって長時間のrRNAを可視化する。 RNAのロードと品質を確認してください（パネル7、 図1を参照）。 注意！ジウムブロマイドは変異原である。 </li></ol></li><li>一方、小さなRNA種を含有するゲルの下部をブロッティング進みます。 </li></ol> 6ジェルブロッティング<ol><li> 6ブロッティング領域に合わせて吸い取り紙の作品や荷を下ろすと同等の部分をカットd個のナイロン膜。紙シート、膜とRB 2ブロッティングパッドを湿らせます。完全に繰り返しRBでそれらを絞ることによって、パッドを浸すようにしてください。 </li><li>装置からゲルを取り出し、へらの平均​​によって眼鏡を開きます。井戸を除去するクリーンなカッターを使用してください。ゲル上に湿ったワットマン紙を置き、静かに持ち上げます。 </li><li>ゲルの自由面にナイロン膜を配置します。サンプルの負荷に応じてフィルタを配向するコーナーをマークします。 「サンドイッチ」（3紙片各辺）を完了する。任意の可能な気泡を除去するために、ブロット面にプラスチック製の棒を振る。 </li><li> 2ブロッティングパッド間ブロットを置き、その後ブロッティングカセット内。 （ナイロンメンブレンをゲルと正の末端の間滞在する必要があります）ブロッティングモジュール内にカセットを組み立て、RBで室内を満たし、正しい方向を確認してください。 </li><li> 20分間、20Vで転送します。注：10分ブロッティングモジュールとrを開いた後、均質な条件を確保するために転送が完了する前に、180°のサンドイッチをotate。 </li></ol> 7。メンブレン架橋<ol><li>新鮮な架橋溶液（XLS）の6ミリリットルを用意してください。 XLSを吸い取り紙10cmの×10センチメートル（ナイロン膜よりも大きい）部分を飽和させる。 注意！塩酸（XLSの構成要素）は非常に腐食性である。 </li><li>ブロットを解体し、湿った3MMろ紙上の膜を配置します。注：RNAが飽和紙に直接接触してはいけません。 2枚のガラス板との間にフィルタや紙を置き、サラン·ラップで包む。 </li><li>のddH 2 O洗浄を2時間60℃で膜を加熱する。 -20℃で保存してくださいまたはハイブリダイゼーションに進みます。 </li></ol> 8。メンブレンプレハイ<ol><li> RNA負荷が（オプションのステップ5.5）をチェックされている場合は、直接ハイブリダイゼーションに進みます。さもないと、プローブのクロスhybridizatioを避けるために、ナイロンフィルターの上部から離れて1cmに切る長いRNAを分画しするためのナノ秒。 </li><li> 37℃でのハイブリダイゼーション溶液（HS）を10mlの予熱。 5分間、95℃でのサケ精子1mgを変性させ、氷上でクールでHSに追加する。 </li><li>ハイブリダイゼーションオーブンで回転下で、少なくとも1時間、37℃でのHSでフィルタをインキュベートする。フィルターのRNA側はHSに直面していることを確認してください。 </li></ol> 9。プローブ合成<ol><li> 4.3で説明したように、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド10pmolの上のリン正反応を設定します。 </li><li> （エタノール沈殿によっても、または）、トリス-EDTA-NaClを（TEN）の5容量を反応にバッファリングし、G-25セファデックスカラム上でのゲル排除クロマトグラフィーによる取り込まれなかったヌクレオチドから標識されたプライマーを浄化追加します。プローブの活性は、液体シンチレーションカウンターにより評価することができる。 </li></ol> 10メンブレンハイブリダイゼーション<ol><li>新鮮な10ミリリットルの分量（上記のように調製し、補完）で排気し、HSを交換してください。でプローブを加熱95℃で10分間、氷上でクールで小説HSに追加する。 37℃ONでフィルターをインキュベートする。 </li></ol> 11膜洗浄<ol><li>ハイブリダイゼーション溶液を回収し、放射能遮蔽ボックスに-20℃で保管してください。 </li><li>洗浄緩衝液（WB）でフィルタをすすぎ、室温で10分間、それを徹底的に洗ってください。 </li><li>フィルターコーナーに残留放射能をチェックするためにガイガーミュラー検出器を使用してください。背景放射は約5 cpsです場合には、博覧会、膜に進みます。 </li></ol> 12信号検出<ol><li>オートラジオグラフィーフィルム上または分子イメージャ画面をONにフィルタを公開します。写真処理やデジタル変換した信号を明​​らかにした。 </li><li>専用の定量化ソフトウェア（ImageJのかOptiquant）によるバンド強度を分析します。 </li></ol> 13メンブレンストリップ<ol><li>剥離液の沸騰の500mlに浸し、膜を一次信号を除去するために、、次いで1分間RTでインキュベートする。小説（プレ）ハイブリダイゼーションに進んで、-20℃でのフィルターを格納します。 </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

RNAは神経発生を調節を通して絡み合う高度化の感謝を連続的に増加しているが、神経幹細胞生物学、神経分化/機能統合、神経病理および癌の発生に影響を与えるRNAに基づく回路網の機構影響は未踏のまま。 ショウジョウバエは、短い非コードRNAおよび転写因子が主要な分子の選手と見なされている未踏細胞経路を解明するために尽力キイロとしての王国を通して、このような?...

RNAの生化学は、過去数年1で壮大な進歩を経験している。遺伝子発現の制御におけるRNA電位の私たちの理解は、新規RNAに基づく調節機構3,4の発見によって、すでに知られている転写後事象のより深い特性評価により、強力な非コードリボ-レギュレータ2の同定により破裂されました5。すべて一緒にこれらの研究は、現在の科学的景観における主要な研究対象となってきて、RNAの生物学は劇的場面を作ることができました。特に、ここ数年、私たちは、分子神経生物学6、現代の生命科学の中で最もダイナミックな研究領域の一つの「RNAワールド」の蔓延インパクト感を得ている。前世紀の最後の10年間では、全体的な科学的なシナリオは、RNA干渉7,8の発見によって、小さな調節RNA 9,10の革命をもたらしてきたマイクロRNA 11への特定に関しては、内因的遺伝子発現の多面的コンビナトリアル規制当局などのほぼすべての細胞機能の制御に関与する小さな非コードRNAを発現した。 miRNAの高い番号は、ショウジョウバエで、同様に12〜15ヒト細胞で同定された際に約10年アンブロスとRuvkunのラボによる線虫（Caenorhabditis elegans）におけるmiRNA最初の発見後に、再び注目がフィールドになっていた。それ以来、汎用性の高い遺伝子導入のアプローチのおかげで、 キイロショウジョウバエは、miRNAの生合成と活動掘り下げるための貴重な生物学的状況として際立っていました。 ショウジョウバエ miRNAがシグナル伝達経路、代謝に高齢化から及ぶ、特定昆虫または進化的に保存されたプロセスで異なる機能を明らかにした、行動や、もちろん、神経発生。この方向に沿って、私たちは最近、興味深い共同で新たなリンク16を発表マスター遺伝子GCM /グライドとRNA合成経路との間に発生するrrelation。フライ転写因子GCM /グライド17-19は神経前駆体20を飛行多能においてニューロンの運命の選択対グリアを規定する細胞運命決定因子のユニークな例を構成している。二十年このトピックに関する長期研究は明らかに複数の発生を下線とGCM /神経発達中の神経細胞とグリアカウンターパートとの間の微妙な比率のバランスをとるために必要な閾値レベルを確立するために21-28 グライドにわたって収束遺伝子発現制御の入力が重複しています。 私たちは、DMEL-miR279ターゲティング経由その規制がGCM /発現16 グライドの転写後の微調整に寄与し、さらに制御レベルを表して発見した。世界的には、これらの研究の行は、特定の方法論的な改善を必要とした。年に沿って、いくつかの技術が独自に開発したトラッドを分析するitional RNAは、RNアーゼ保護アッセイなどのような小さな非コーディングRNA、cDNAアレイ29-31、リアルタイムPCR法32〜35および配列36,37を定量化するために変換されている。反対側には、技術的なアプローチの再キャリブレーションは、現場での連続進歩を助長しています。 ノーザンブロットアッセイ（NB、またはRNAゲルブロットアッセイ）代表のインスタンスを構成している：それは、発現レベルの定量だけでなく、サイズ決定の両方を確保しているので、それは主に、RNA蓄積をプロファイルするために使用される。しかし、この方法の本質的な乏しい感度は、それが短いRNAのような、低豊富な遺伝子発現細かいチューナーに適用する場合に限定される。有害な結果は、特定の生物学的試料への応用は困難になり、総RNA、大量の要件である。このような理由から、低分子RNA検出のための具体的なNB変異体は38〜40が開発されている：私たちは改善されたNB procを利用したedure 41（ENB、拡張ノーザンブロット）、DMEL-miR279およびGCM /グライドの間、上記の相互作用を解明している。 この方法は、固体支持体上に核酸を固定する[EDC、1 - エチル-3-（3 - ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド]カルボジイミド誘導体の活性に基づく化学的架橋工程に依存している。カルボジイミド活性化カルボキシルまたはリン酸基およびアミン基42との間のアミド結合の形成を触媒することが知られている汎用性のクロスリンカーである。このプロパティは、ナイロン膜の表面にアミノ基に自分のモノリン酸化された5&#39;-ヒドロキシル基を介して共有結合小さなRNAに活用することができる。得られ取付け構成が顕著検出強化43を生じる固定化された核酸と、今度は、プローブ-標的ハイブリダイゼーションの効率のアクセシビリティを増大させる。 技術は、特定のrelevancを想定しているショウジョウバエ分子的研究におけるeは、それによって、小さな非コードRNAの新規で独特のクラスの発生が44を浮上している。これらの中でも、rasiRNAs 45,46は配列特異的遺伝子サイレンシングに関与PIWI相互作用性RNA（piRNAは47）の特定のサブタイプを構成する。この方法の手術の詳細は十分に説明し、以下に可視化し、マイクロRNA DMEL-miR279とDMEL-miR286の分析に相対的で、初めて、1 rasiRNA、rasi4のされています。私たちは、RNA（1μg未満）の最小量から不十分な表現の目標を明らかにすることができたこの方法を、極端に押した。

enhanced northern blot detection of small rna species in drosophila melanogaster

最後の十年は、RNAレベルでの遺伝子発現制御機構の周りの科学的関心の爆発を目撃した。分子生物学のこのブランチは大幅に転写後調節の主要なプレーヤーとして非コードRNAの発見に支えられてきた。このような革新的な観点は、ハイスループットレベル（ゲノムワイド同定）または単一の候補解析（特定の種の定常状態の蓄積）の両方、を伴うと短いRNA発現をプロファイリングするための強力な技術の開発によってトリガされている。いくつかの最先端技術の戦略は投薬や、逃げるの分子を可視化するために現在利用可能であるが、ノーザンブロットアッセイは、RNA発現の迅速かつ正確な評価のための分子生物学の適格なアプローチのまま。それは、より洗練され、コストのかかる技術の応用に向けた最初のステップであると、多くの場合、簡単に洞察を得るための優先方法のままRNA生物学へ。ここでは、手動で幼虫/成体組織を切開し、またはインビトロ培養細胞で 、胚全体キイロショウジョウバエから弱く発現マイクロRNA（または他の小さな調節RNA種）を検出する（ノーザンブロット拡張）効率的なプロトコルの概要。 RNAの非常に限られた量が必要とされ、フローサイトメトリー、単離された細胞からの材料の使用も想定することができる。

全体的な手順テキストで説明し、 図1に概略的に表現さに従うことによって、私たちは異なる起源の複雑なRNAサンプルから低分子RNAの発現を評価した。 （：アガロースゲル分画変性任意の工程）と、二重にロードされ、図1に示す実験では、RNAは、整合性をチェックプロテイナーゼK抽出によるショウジョウバエシュナイダー2細胞から単離した。ゲルの半分は、...

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Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

本書の目的は、 キイロショウジョウバエの胚、細胞、および組織から抽出されたRNA上の強化されたノーザンブロットプロトコルの手術の手順を視覚化し、議論することである。このプロトコルは、小さなRNA種の効率的な検出のために特に有用である。

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

23.8K ビュー.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. 本書の目的は、 キイロショウジョウバエの胚、細胞、および組織から抽出されたRNA上の強化されたノーザンブロットプロトコルの手術の手順を視覚化し、議論することである。このプロトコルは、小さなRNA種の効率的な検出のために特に有用である。 

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

キイロショウジョウバエの幼虫中枢神経系の解剖

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

生物学

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

アダルトキイロショウジョウバエのロコモーションの高解像度のビデオトラッキング

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

のライブイメージングキイロショウジョウバエ胚性血球移行

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

大人からOenocytesの解剖キイロショウジョウバエ</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

の分離キイロショウジョウバエ精巣

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

見つけにくい小型哺乳類から高品質のDNAを得るために非侵襲ヘアサンプリング法

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

CRISPR / CASシステムの酵素のための基質の生成

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

における寿命の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

のメンテナンス<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;人口ケージ

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...