我々は、多くの刺激的な議論のためにマイケルJ.ブルーノ、ラッダRusinovaとジョンT.サックに感謝。 NIH、R01GM021342とARRAサプリメントR01GM021342 - 35S1、及びOSAのジョサイアメイシー、ジュニア財団からの財政支援、トライ- I HII用CMBプログラム、およびアイリスL.とレヴェレットS.ウッドワース医学者フェローシップとNIH MSTP助成金RK用GM07739。

1。 ANTS充填リポソームを生成する<ol><li> 1日目に、脂質から有機溶媒を除去。 </li><li>冷凍庫から脂質を取り外して、常温に平衡させる。 </li><li> 25mLの丸底フラスコにクロロホルム溶液25 mg / mLの（1,2 - dierucoyl - sn -グリセロ-3 - ホスホコリン）脂質0.6 mLを加え。 </li><li>すべてのクロロホルムが蒸発し、脂質コートフラスコの全体の下半分の薄い白色フィルム完了するまで、窒素下で乾燥しながら継続的にフラスコを回転させる。 </li><li>一晩真空下でデシケーター中で乾燥させます。 </li></ol><ol><li> 2日目、小胞に取り込まれる蛍光体でサンプルを準備。 </li><li> 100mMのNaNO 3を 、25mMのANTS（Na塩）、10mMのHEPESで再水和。 pHを7.0に調整してHNO 3またはNaOHを使用してください。各ANTSの分子が2のNa +を持って 、150mMの合計[Na +の ]。 10mMの脂質懸濁液を得るために電解液の1.671 mLを加え。 </li><li>徹底的にパラフィルムと渦サスペンション。 </li><li>箔で光から試料を保護し、室温で一晩、それは年齢ができます。 </li></ol><ol><li> 3日目に、大きな単ラメラ小胞を作り、小胞の外からすべての蛍光体を削除します。 </li><li>低消費電力の超音波処理器で1分間超音波洗浄します。 </li><li>凍結融解サンプルドライアイス上で5分、暖かい所で約5分で5〜6回、各時間（〜50 ° C）水。 </li><li>アバンティミニ押出機を用いて脂質懸濁液を押し出します。 0.1μmのポリカーボネートフィルターとフィルターをサポート（詳細については、押出機のマニュアルを参照してください）​​とミニ押出機を設定します。前後にサスペンションが反対側のシリンジに終わりますように、21回のサスペンションを押し出す。複数のバッチが押し出されるときは、常に同じシリンジでサンプルをロードすることを忘れないでください。押出中に曇った最初の脂質懸濁液は、（それはまだANTSの蛍光団のために黄色になる）とほぼ透明になるはず。押し出しが突然容易になり、少ない圧力がフィルタを通過移動するために必要な場合は、フィルターが破裂している可能性があり、交換する必要があります。 </li><li>重力のプロトコルを使用してPD - 10脱塩カラムに押し出されたサスペンションを実行することにより、外部ANTSを削除します。ナトリウム緩衝液の20〜30 mLでカラムを平衡化（140mMのNaNO 3を 、10mMのHEPES、pH 7.0のpHを調整するHNO 3または水酸化ナトリウムを使用することを忘れないでください）。列に押し出し脂質懸濁液1.5 mLを加え、それが入って1 mLのナトリウム緩衝液を添加することにより2.5mLのためにサンプルの合計量を持参浸透しましょう​​。バッファが完全にカラムと何も組み込まれている後は、漏れ出しナトリウム緩衝液3mLでリポソームを溶出し、得られたサンプルを収集しています。満たされた結果として得られるANTSは、ストック溶液は4〜5 mMの脂質に関する含むと半透明の乳白色を表示するLUVは。アルミホイルで光からサンプルを保護する。 </li><li>ストック溶液は13で、すぐにストアを使用されていない場合で7日間の最大のためのC。警告：フリーズまたはその結晶相転移温度（〜12 ° C）、これは小胞の整合性を破壊すると蛍光物質が漏れないので液体の下に脂質溶液を冷却していない。 </li></ol> 2。蛍光溶液を混合<ol><li> 24時間前、使用リポソームを希釈し（13℃時）グラミシジンでインキュベートする。脂質小胞&quot;内側と外側の単分子膜との間のグラミシジンの平衡は、長いインキュベーションを必要とする、時間のかかるプロセスです。 </li><li>アリが充填徹底的に渦LUVsは密度&gt; 1 g / mlのとソリューションにしたがって堆積物意志を持っているストック溶液をLUVは。 </li><li>ミックスANTS充填ナトリウム緩衝液中で株式の1:20にマブラヴ。サンプルの均一性を高めるために、単一のフラスコ中で一緒に実験の一日に使用するためのすべてのリポソームを混ぜる。 </li><li>リポソームの3 / 4を分離し、260nmのグラミシジンDMSOにあらかじめ希釈して（500μg/ mL）を加える。 </li><li>残りの1 / 4に全てのサンプル中の溶媒濃度を一定に保つためにDMSOの同じ体積を（グラミシジンせずに）追加。 </li></ol> 3。蛍光インストゥルメントの設定<ol><li>我々は、蛍光消光の速度を測定する温度制御と応用光物性SX.20ストップトフロー分光を使用してください。 </li><li>ウォームアップを可能にするために前もって時間の時間で楽器をオンにします。コンポーネントは次のとおりです。コンピュータ、電子制御ユニット、水浴（クーラーとヒーターの両方）、ランプの電力供給と窒素のタンク。 </li><li>プロのデータSXのソフトウェアを使用して記録条件を設定します。 </li><li> 1 / 1〜励起用352 nmおよびスリット幅の開口部にモノクロの励起波長を設定します。 </li><li>排出量を記録するためにλ= 455 nmのハイパスフィルタを使用してください。 </li><li>録音時の窒素圧力を維持するために楽器を可能にするため、最初の数ミリ秒の間に圧力の振動（および録音のアーティファクト）を防止する&quot;圧力ホールド&quot;の設定を、使用してください。 </li><li> &quot;Tiを設定する私は5000〜ポイント&quot;&quot;1秒とする&quot;。 </li><li>リピートボックスを使用するとリピートの数を調整するには、通常、我々はそれぞれ、バッファおよびクエンチャーの実行のために9および13のリピートを使用してください。 </li><li>水槽温度を25に設定する必要があります° C、温度は、SXソフトウェアで監視する必要があります。 </li><li>たびに楽器が、サンプルを実行するには2つのシリンジの各々から60μLを混合することを意味し、120μLのドライブボリュームを設定します。この楽器のセットアップでは、120μLボリュームは≈1.2ミリ秒のデッドタイムを与える。 </li><li> 8の周囲にANTS -リポソームの出力のための蛍光検出器に高電圧（ゲイン）を調整します。標準的な実験的な混合のために利得が400から420にする必要がありますV.一部の薬は、蛍光は、蛍光信号を飽和させることができるようになっている。これらのケースでは、ゲイン/電圧を減少させるべきである。 </li><li>常に右シリンジで左の注射器とバッファ/消光剤に蛍光サンプルをロードする。ロードする前に、リポソームを含む徹底的にボルテックスすべてのサンプルにすることを確認し、時間とLUVsは注射器で解決されることに注意してください。 </li></ol> 4。実験を行っ<ol><li>ナトリウム緩衝液またはTL -クエンチャー（50mMのTlNO 3、94 mMのNaNO 3を 、pH7.0で10mMのHEPES）のいずれかと一緒にANTS -ロードされた溶媒や化合物のいずれかとLUVs、と分光へのロードのサンプルを準備します。 </li><li>前日準備グラミシジンの有無にかかわらず、1.5 mLの希釈ANTS - Luvのソリューションを、使用してください。 </li><li>所望の濃度の化合物またはコントロールの溶剤を追加。すべてのサンプル間の最小値と定数に溶剤濃度を維持する。濃度は、所望の投与量 - 応答の範囲を達成するために、新しい（未知の）化合物とを調整する必要があります。 25℃で10分間インキュベート° Cの暗所で。 </li><li>渦は、左のシリンジにサンプルと負荷をLUVは。右のシリンジにナトリウムバッファーまたはTL -クエンチャーをロードします。 </li><li>徹底的に前後にシリンジを押すことによって、両方のサンプルから気泡を取り除く。 </li><li>両方の注射器がバルブを閉じる前に均等に負荷されていることを確認します。彼らはレコーディング室に到達する前に不平等な負荷がソリューションのプリミキシングになります。 </li><li>非常に最初のサンプルの場合は、必要に応じて高電圧（ゲイン）を調整し、4回繰り返し、5回を繰り返し、ナトリウム緩衝液と蛍光を記録。 </li><li>残りのサンプルは、Na -バッファとレコード9繰り返すため。 </li><li>タリウムクエンチャーとレコード13を繰り返すとナトリウム緩衝液を交換してください。 </li><li>水ですすぎ、次のサンプルを続行します。溶剤持つグラミシジンと、最大化合物濃度と無グラミシジンとを、グラミシジンと溶剤の両方で：私たちがサンプルを使用しない制御として。 </li></ol> 5。データの分析<ol><li>分析のコンピュータに結果を転送する。分析するためのMATLABへのすべてのデータを読み込みます。各サンプルについて、それらが混合アーティファクトを含んでいるので、それぞれの場合の最初の4つを除く、すべてのバッファおよびクエンチャーの繰り返しで読み込む。 120μLのドライブボリュームを想定し、それは完全にストップトフローチューブから前の混合物をクリアするために4つのショット弱かかります。 </li><li>すべてのサンプルのバッファの繰り返しは非常に似ている必要があります。化合物の濃度に依存して蛍光シグナル、大きな変化が存在する場合、化合物自体は蛍光可能性があります、それは最初のサンプルを正規化する前に、この余分な蛍光信号を減算する必要があるかもしれません。 </li><li>手動でトレースを通過すると、&quot;悪い&quot;繰り返し削除する：ミキシングアーティファクトおよび/または気泡によるマルチexponentialityからスパイクや逸脱を含む繰り返しを。 </li><li>各サンプルのバッファーを繰り返すの平均開始値にクエンチャーが繰り返されを正規化する。可視化のための一つのグラフにすべてのサンプルの平均値を組み合わせる。 </li><li>ないグラミシジンで記録されたトレースはどれも似たり寄ったりだとほとんど蛍光消光を示すようにすべきですが、Tlの漏れを遅くする+小胞二重層〜8による蛍光シグナルの遅い低下する可能性があります。無グラミシジンと無修飾されたサンプルは、重要な消光を示している場合は、小胞は悪化しており、さらには使用しないでください。ないグラミシジンはあるが修飾子を持つ試料が大きな消光を示す場合は、修飾子は、それが蛍光団または消光剤が二重層を通過することができるような程度に小胞の脂質二重層を乱す。 </li><li>グラミシジンのチャンネルで検出されたとして、化合物は、脂質二重層のプロパティを変更した場合、蛍光の時間経過が明白に変更されます。 </li><li>各サンプルについて、指数関数的に引き伸ばさ<img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg1.jpg" alt="式（1）" />例えば、4）は、個々の繰り返しの正規化蛍光消光カーブの最初の200から100ミリ秒と速度に適合さ<img src="/files/ftp_upload/2131/2131eg2.jpg" alt="図2" /> 42ミリ秒で計算。平均値と標準偏差はすべての個々の繰り返しから、与えられたサンプルに対して計算されます。 </li><li>最後に、グラミシジンと無修飾されている時間に最も近いコントロールサンプルに正規化することによって急冷速度の相対的な変化を決定する。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：蛍光クエンチベースのアッセイの必需品は、脂質二重層の特性の変化を検出するために左上：。ズームの内側と外側のNaNO 3を加えてTlNO 3のアリプラスNaNO 3を持つ単一の脂質小胞で。右上：クエンチャー、87、260と780nmのグラミシジンとプリドープで、消光剤と、クエンチャーなし（上から下フォーム）ANTS充填小胞を用いて記録された蛍光シグナル。ボトム：ストップトフロー混合室の模式図。 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：実験装置の説明で参照されているさまざまなパネルを示すプロデータSXのソフトウェアからのスクリーンショット。 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：彼らはミキシングアーティファクトを含むとしてのNa -バッファ付きANTS負荷LUVsからの蛍光信号の複数の繰り返し測定は、最初の4つの繰り返しは常に、除外されます。混合セルにサンプルの注射器を接続する配管には、定義されたボリュームを持っている、したがって、最初のいくつかの繰り返しは、私たちのチューブに以前にあったものの読書を与える：水を繰り返し1と2、繰り返し3の水とサンプルのいくつかの組合せに対してリピート4、残りの繰り返しのためだけのサンプルのほとんどがサンプル。 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig4.jpg" alt="図4" /> 図4：。ANTS負荷のNa -バッファ付きおよびTl -クエンチャーとLUVsからの蛍光信号の複数の繰り返しの決定は、最初の4つの繰り返しは、両方の条件から削除されています。さらに、TL -消光測定のため、アーティファクト、ほとんど気泡により、削除する8ニーズを繰り返します。 <img src="/files/ftp_upload/2131/2131fig5.jpg" alt="図5" /> 図5：ANTS蛍光消光の時間経過に対するカプサイシンの効果（キャップ）1秒以上（）正規化された蛍光シグナルは、灰色のドットは、すべてのリピート（N&gt; 5あたり状態）からの結果を表し、赤い線はすべての平均を表す繰り返す。 （B）最初の100 msのは、灰色のドットは、条件ごとに単一の繰り返しからの結果を表し、赤い線は指数関数フィット（2 - 100ミリ秒）に引き伸ばされて、それらの繰り返しにして。点描青い線が2ミリ秒のマーク、消光の速度が決定された時刻を示します。 AとBの両方でトップのトレースは、TLがない場合の結果を示しています+;次の2つのトレースは+ ±キャップTlのと、GAの不在の結果を示し、下位4トレースがどこに、260nmのGaとTlの+との結果を表示数字は、μMの[キャップ]を表します。として伸張指数関数の速度によって決定される0、10、30、90μMのキャップ、、のための消光の速度は36です± 6、69 ± 6、85 ± 8と247 ± 27（± SD、n個&gt; 8を意味する） 、それぞれ。

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原稿に記載されているメソッドをカバーする仮特許出願が提出されています。共同発明者は、HIIとOSAです。

私たちは、麻薬や他の小さな両親媒性物質の二重層変更の可能性を決定するための高速な蛍光ベースのアッセイを実証している。二重層のプロパティを変更する化合物は、おそらく&quot;オフターゲット&quot;薬の効果に​​貢献し、間接的、非特異的に膜タンパク質の機能を変更する可能性があります。アッセイは、二重層貫通タンパク質によって感知される二層プロパティの変更12の...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ANTS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A-350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gramicidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Chemical Co</td>
<td>G-5002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>850398C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini-Extruder kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti Polar Lipids</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PD-10 Desalting column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare</td>
<td>54805</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gramicidin-based fluorescence assay; for determining small molecules potential for modifying lipid bilayer properties

多くの薬と生物学的機能を調節するために使用される他の小さな分子は両親媒性脂質二重層/溶液界面のその吸着であり、それによって脂質二重層のプロパティを変更する。膜タンパク質がエネルギー的に疎水性相互作用によって、そのホストの二重層に結合されているため、これは重要です。二重層の特性の変化は、このように両親媒性物質は、タンパク質の機能と&quot;オフターゲット&quot;薬の効果の可能なメカニズムを変調するための間接的な方法を提供する、膜タンパク質の機能を変化させる。我々は以前のプローブ3,12のような線形グラミシジンのチャンネルを使用して、脂質二重層の特性の変化を検出するための電気生理学的ア ​​ッセイを開発した。グラミシジンのチャンネルは2つの非導電性サブユニットのtransbilayer二量体化によって形成されるミニ蛋​​白質である。彼らはそれらのタンパク質にまたがる二重層により検知されたとして、脂質二重層の特性の変化を監視するための強力なプローブになる彼らの膜環境の変化に敏感です。我々は現在、プローブと同じチャンネルを使用して二重層の特性の変化を検出するための蛍光アッセイを示す。アッセイは、グラミシジンのチャンネルを通じて、クエンチャーのエントリに起因する蛍光体にロードされた大きな単ラメラ小胞からの蛍光消光の時間経過を測定することに基づいています。我々は、蛍光指示薬/消光剤ペア8 -アミノナフタレン-1,3,6 - trisulfonate（ANTS）/ TL +を正常他の蛍光消光アッセイ5,13で使用されている使用してください。 TL +はゆっくり8脂質二重層に浸透がグラミシジンのチャンネル1,14を実施を通じて容易に通過する。このメソッドは、両方の効果機序の研究と二重層-摂動のための小分子のハイスループットスクリーニング、および潜在的な&quot;オフターゲット&quot;のための拡張性と最適です。我々は、このメソッドを使用して結果が以前の電気生理学的結果12とよく一致していることがわかります。

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Gramicidin-based Fluorescence Assay; for Determining Small Molecules Potential for Modifying Lipid Bilayer Properties

我々は、グラミシジンチャネル活性の尺度としての蛍光消光の速度を監視し、高速蛍光ベースのアッセイをご紹介。グラミシジンのチャンネルは、タンパク質にまたがる二重層により検知されたとして、脂質二重層の特性の変化を監視するための分子力変換器として使用されています。

グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための

Many drugs and other small molecules used to modulate biological function are amphiphiles that adsorb at the bilayer/solution interface and thereby alter ...

gramicidin-based-fluorescence-assay-for-determining-small-molecules

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K ビュー.  Weill Cornell Medical College. 我々は、グラミシジンチャネル活性の尺度としての蛍光消光の速度を監視し、高速蛍光ベースのアッセイをご紹介。グラミシジンのチャンネルは、タンパク質にまたがる二重層により検知されたとして、脂質二重層の特性の変化を監視するための分子力変換器として使用されています。

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Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

潜在的なパーキンソン病の遺伝子を検証するための線虫のドーパミンニューロンの変性のアッセイのアプリケーション

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

生物学

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

二層弾性特性の変化をモニタリングするための単一分子法

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Substrate Generation for Endonucleases of CRISPR/Cas Systems

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) 1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems 4. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5' terminus of an extending CRISPR cluster 5. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs 6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5' terminal (8 nucleotides) and a 3' terminal tag derived from the repeat sequence 9. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity10. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA 11,12 .
These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases 4.
Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5'-hydroxyl and a 2',3'-cyclic phosphate termini.

CRISPR/Cas systems mediate adaptive immunity in Bacteria and Archaea. Many Cas proteins are proposed to act as endoribonucleases acting on crRNA precursors of varying length. Here we illustrate three different approaches to generate pre-crRNA substrates for the biochemical analysis of Cas endonuclease activity.

CRISPR / CASシステムの酵素のための基質の生成

The  interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of  bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

ハイスループットシークエンシングによりマイクロRNA定量のための低分子RNA分子の高効率ライゲーション

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

蛍光プロテアーゼ保護を使用して膜タンパク質のトポロジの決定（FPP）

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

金ナノ粒子と脂質膜の熱伝達をモニターする二重層脂質膜

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

蛍光イメージングのための植物組織の光学的クリアリング

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...