私たちは、ハエ株についてブルーミントンストックセンターを認めている。この作品は、BBSRC（BB / G008973 / 1）からの研究助成金によってサポートされていました。

1。フライの準備<ol><li>遺伝的背景26をコントロールするために行動実験の前に少なくとも6つの世代のために、全ての変異体、GAL4 / UASなどCSw-などの野生株と他の行を、異系交配。 </li><li>具体的な操作が異なる温度を必要としない限り、25℃で12時12分時間の明暗サイクル下で標準的なコーンミール、酵母および糖蜜食品食のハエを育てる。 <ol><li>開発を通じたGal4 GAL80 TS（ターゲットシステム）に導入遺伝子の発現を防止した後、1〜2日間の行動実験の前に30℃のインキュベーターにハエを移動するために使用し、18℃：導入遺伝子発現の効果を判定すること。導入遺伝子発現3,4,6,7,14の効果を決定するために、30℃で実験を行う。 </li><li>神経細胞を刺激するために、熱活性化TRPA1チャネルを用いた実験の場合：既知の温度である23℃、でハエを上げる非アクティブなチャネルを維持し、その後発現ニューロン、TRPA1を活性化するために、30℃で行動室に移行する。 </li><li> 18℃でリアハエし、30℃でテストを実施：シナプス出力11、14,24をブロックする敏感 Shibire 温度を用いて実験のため。 </li></ol></li><li> 1〜2日後、実験前にハエを集め、光、CO 2麻酔下で、約25のグループでそれらを数える。 （具体的な操作が異なる温度を必要とした場合を除く）、25℃で（酵母なしで）食品用バイアル中にハエ少なくともO / Nを格納し、午前12時12時間の明を持つ環境的に制御された部屋の中で70％の相対湿度：暗い時まで実験の。 注：このストレージは、ハエがショウジョウバエの学習のための最適な条件を持っていた環境制御されたクリーンルームで行うその後の学習テストに順応することを可能にし、重要なのは、どんな毎日ENVIを削除します行動的表現型に影響した可能性があり境バリエーション。 </li></ol>実験前2。準備<ol><li>カスタムメイドのパースペックスT-迷路における実験（ 図1）を実行します。 </li><li>定期的に気密シールが実験中に得られることを保証するために、管継手をご確認ください。必要であれば、T-迷路の内側コンパートメントをシール、Oリングを変更してください。 </li><li>トレーニングチューブの内側にカスタムメイドの銅グリッドを配置します。確認し、定期的にこれらのグリッドをきれいにし、酸化された場合には交換してください。電気刺激装置に接続されたスイッチボックスに実行するワニ口クリップを介して、配線に銅グリッドを取り付けます。装置が必要なショックを配信していることを保証するために電圧計を使用してください。 </li><li>どんな空気漏れを避けるために、しっかりと迷路を保持するために、G-クランプを使用してください。 </li><li>匂いがハエを越え引かれ、その後、T-迷路から削除されるように、空気ポンプを結ぶ配管に、T-迷路を取り付けます。穏やかな空気を維持〜2リットル/分で流し</li></ol> 3臭気希釈液<ol><li>ハエは両方の臭いに対して等しい優先性を示すことがこのような濃度で二つの異なる匂いを使用してください。鉱物油7,13で希釈した：（100 1）4 -メチルシクロヘキサノール（1:67）、および3-オクタノールを使用してください。 注：慎重に研究室によって異なりますこれらの濃度を決定する。例えば他の人は、両方の匂い24 1:10を使用しています。他の一般的に使用される悪臭を酢酸エチルおよびイソ - アミルアセテートが挙げられる。 </li><li>ピペットこうして臭気プルームにハエを暴露、空気がカップに臭い上に描画することを可能にする有孔上部とプラスチックチューブで覆われた臭気ブロックに入り、カスタムメイドの匂いカップに希釈された臭気を30μl。 </li></ol> 4訓練プロトコル（図1および2） <ol><li>大人の嗅覚衝撃コンディショニングのために、暗赤色灯の下ですべての実験（ すなわち 、赤色LED）、研究者は見ることができます実行しますが、FLを防ぐこのように視覚的な入力とは対照的に、ハエは嗅覚に集中することができ、見てからのy。 </li><li>トレーニングチューブにハエを導入してから、T-迷路にアタッチし、それらを90秒間チューブと空気の流れに適応することができます。 </li><li> 60秒の合計持続時間（3.75秒パルス間間隔で12 1.25秒のパルスからなる）60-Vのショックで最初の匂い（4 - メチルシクロヘキ、MCH）を提示。 </li><li>匂いやショックなしに30秒の休止期間とショックに従ってください。 </li><li>ショックのない60秒間二臭（3 - オクタノール、OCT）を提示。 </li><li>匂いやショックなしに30秒の休止期間とショックに従ってください。 </li><li>その側にT-迷路を回し、ゆっくりとそのような古いマウスマットなどの柔らかい物の上のT-迷路の底部を強打することにより、T-迷路の中央チャンバー内にトレーニング室からハエを移動します。 90秒間中央室にハエを維持します。 </li><li> BOへの選択肢チューブを取り付け装置のttomは、T-迷路を形成する。 </li><li>学習を測定するために、それらは同時に匂いに暴露し、1に向かって移動し、T-迷路、選択ポイントにハエを移動します。 120秒間の試験期間を実施する。 </li><li>それによって選択肢管の端部を遮断する中央チャンバを上にスライドさせてトラップの選択管内でハエ。食品バイアルに、T-迷路の各アームと中央コンパートメント内のハエを収集し、カウントされます。 </li><li> 、メモリを測定する訓練（4.6）の後にハエを収集し、酵母なしで食料バイアルに、T-迷路からそれらを転送するには。ストア（導入を参照）、25℃で暗く、興味のあるメモリ位相を決定するのに必要な残りの時間、70％の湿度に飛ぶ。ステージ4.7のように、T-迷路にハエを再導入。 </li><li>長期記憶のために、ハエのいくつかのバッチを同時に訓練することができるカスタム構築された迷路を使用しています。 15分間のサイクル間隔（スパと訓練の5サイクルの管理CED）またはインターサイクル間隔なしで（密集）。試験まで、暗所で18℃、ハエおよび70％の湿度を維持します。試験の前に、25℃にハエを移動し、それらが少なくとも1時間順応することができます。訓練の後、長期記憶の24時間を評価する。 </li><li>行動実験の後、お湯と洗剤で無臭臭いカップを清掃してください。乾燥後、10μlのシグマコートでコートカップを。電子レンジで加熱することにより、シグマコートを乾燥させる。時折お湯と洗剤で無臭のT-迷路パースペックス管や臭気ブロックを清掃してください。 </li></ol>性能指数の5。計算：ハエ &#39;記憶の測定<ol><li>マイナスハエ（CSの総数で割った衝撃対に匂い（CS +）を選択するハエの数-ショックペア匂い（CS）を回避ハエの数などの条件ごとに性能指数（PI）を計算する- + CS +）1。 ペーrformance指数（PI）=（＃CS -ハエ- ＃CS +が飛ぶ）/（＃合計ハエ） </li><li> MCHはショックペア臭いと10月には衝撃ペア臭いだったものであった実験のPIを平均化することによって、実験の最終PIを計算します。これは、1つの臭いのために、より高い優先順位を持つハエのいずれかのバイアスを除去。 </li></ol> 6。感覚コントロール<ol><li> T-迷路6,7,17 ​​へ〜40-50ハエを導入することにより、臭気視力を実行します。 </li><li> 90秒後に、選択点にハエを移動し、純粋な匂いと空気のどちらかを選択する彼らに2分を可能にします。 </li><li>ハエを収集し、カウントされます。試験に参加したものによって臭気を選んだハエの合計数を割ることによって回避率を計算します。 </li><li>ショック反応性6,7,17 ​​の場合、ショックチャンバーにハエを導入。 </li><li>残りの90秒後に、ハエが同様に逃げることができる、そこから60-V D​​C電気ショックを、管理するショックのないチューブ。 </li><li>ハエが選択するための2分を許可する。ハエを収集し、カウントされます。実験でのハエの総数で衝撃波管をエスケープすることで衝撃を避けハエの数を割ることによって衝撃回避率を計算します。電気ショックを免れたものを合計で中央室に残ってハエを含めます。 </li></ol>

<ol>
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著者らは、開示することは何もない。

ここに提示ショウジョウバエ成体嗅覚ショック学習アッセイは、長期メモリ15〜17を含むメモリの異なる位相を、根底にある分子メカニズムの分析を可能にする。同様に概日リズム18の効果の決定など、メモリ上に19、ダイエット20,21、老化11-13、神経変性疾患5と薬物治療5,6,19眠る 。 多くの強力なアプローチは、最近、ハエ3,4,7,11,16,27に嗅覚記憶を仲介する神経回路の機能イメージングのために開発されている。これらの光遺伝学的技術は、ショウジョウバエ 14,16で利用可能な異なるプロモーターの膨大なレパートリーを使用しています。これらのプロモーターは、メモリ·トレース上の特定の遺伝子変異の影響を研究するために、メモリニューロン16,27に遺伝的にコードされたカルシウムおよびcAMPレポーターを発現するために使用される。 目成人では、条件付きプロモーターおよび変異のEの使用はメモリ3,4,6,7,13,14における遺伝子産物のポスト発達役割の研究を可能にする。イメージングと行動のアプローチは、さらにその機能を解明するために、メモリ回路11,14,16,22-24の異なるニューロンを刺激するかまたは阻害するために光-及び熱活性化チャネルと組み合わせることができます。また、キノコ体メモリニューロンは、 ショウジョウバエ嗅覚メモリ29をモデル化するために使用されている全細胞パッチクランプ記録28、および数学的計算技術にアクセス可能である。 ここで紹介する連想メモリ·プロトコルの異なる形と組み合わせるこれらの実験の進歩は、老化や病気、 ショウジョウバエは 、罰、モチベーション、中毒に報いるために応答して発生連想メモリ内molecular-と回路レベルの変化をモデル化するために使用できるようにする5,6,11-13,16,30-31。

ここで紹介する方法は、いくつかの小さな変更を1とタリーとクインによって記載されているものである。ハエが第一段階で訓練されており、訓練を受けたハエは、第2段階でテストされています。実験は2段階で行われます。トレーニング中、ハエのグループが同時に臭気にさらされている1（CS +）とトレーニングチューブ内の電気ショック（US）。電気ショックなしで-ハエはその後臭い2（CS）を受け取る。ショック特定の臭いのこの単一のペアリングが1サイクルトレーニングと呼ばれ、最も頻繁に使用される臭気は、4 - メチルシクロヘキサノール（MCH）および3 - オクタノール（OCT）である。 1サイクル訓練は、最大7時間を検出することができるメモリの不安定相の形成をもたらす;ただし、メモリは通常、学習、取得又は2分のメモリと呼ばれるものを決定するために、すぐにテストされています。 30分または1時間で測定されたメモリが、一方、短期記憶と呼ばれ3時間のメモリは、中期メモリと呼ばれる。トレーニングサイクル（間隔の訓練）との間のギャップを反復的な訓練サイクルハエの露出はCREB転写依存しており、週まで持続長期記憶の連結形につながる。ギャップのないトレーニング（密集訓練）は、典型的には、訓練7,13,15-17,20,21 5サイクルの24時間後に測定される長期記憶と同様に、麻酔耐性記憶（ARM）の形成をもたらす。 このアプローチでは、メモリのこれらの異なる位相におけるさまざまな遺伝子の変異の効果を決定することができる。特定のニューロンの神経活動の活性化やブロックする軽または温度感受性遺伝子のプロモーター駆動発現は、人は記憶獲得、統合と検索3,4,11,15,16,20のために必要とされる神経細胞を調べることができます22-24。このFので加齢に伴う記憶障害を研究する際に、1時間でのメモリーは、一般的に測定され、メモリのORMは11-13高齢化の影響を特に受けが表示されます。行動的および遺伝的コントロールの完全な範囲は、性能不良が原因で中央メモリ欠陥やショックや嗅覚キュー5-7を感知するハエを防ぎ、末梢感覚欠陥であるかどうかを決定するために、例えば、メモリの実験を用いて行われる1〜7、25,26。

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:28px;">Materials</td>
			<td style="width:139px;height:28px;">Source</td>
			<td style="width:116px;height:28px;">Cat. No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">3-Octanol</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">218405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">4-Methyl cyclohexanol</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">15,309-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Benzaldehyde</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">418099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Fluka</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">BP2629-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Hexyl acetate</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">108154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Fructose</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:22px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;height:22px;">Bioline</td>
			<td style="width:116px;height:22px;">BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila adult olfactory shock learning

ショウジョウバエは、このように大幅に認知疾患1-7に関与する分子メカニズムの解明を含め、メモリの理解を容易にする、40年以上にわたり、古典的条件付け実験に使用されている。学習と記憶は、大人可塑性遺伝子1-7の寄与を測定するために、神経発達遺伝子8-10とハエにおけるの効果を研究するために幼虫でアッセイすることができる。さらに、 ショウジョウバエの短い寿命は加齢に伴う記憶障害5,11-13を仲介する遺伝子の解析が容易になる。 ショウジョウバエ神経系を細分多くの誘導性プロモーターの利用可能性は、いつ、どこで、目的の遺伝子は、通常のメモリと同様に強化信号3,4,14,16の異なる側面の中継に必要とされるかを決定することを可能にする。 大人のショウジョウバエでメモリを学ぶことの詳細な分析が可能に行動と関連する回路および長期記憶15 -17の測定。成虫段階の長さは、メモリ3-6,11-13,15-21上の加齢および神経変性疾患の効果を決定することに加えて、メモリの長期的、遺伝的、行動、食事および薬理学的操作に対応しています。 古典的条件付けは、動物によって相互に関連付けられているようになるの中性臭気キュー（条件刺激、CS +）の同時提示と強化刺激、 例えば 、感電、ショ糖、（無条件刺激、US）によって誘導される1,16。第二条件刺激（CSが- ）、その後、米国なしで提示されている。テストフェーズでは、 ショウジョウバエを同時にCS +とCS-臭いされています。 ショウジョウバエ臭気の間で選択するための時間を提供した後、動物の分布が記録される。この手順はアル安値は確実に条件刺激のいずれかのための生得的な好みによって導入された偏りなく測定することが、嫌悪や食欲調節を連想。各種制御実験はまた、全ての遺伝子型は、臭いや単独の強化に正常に応答するかどうかを試験するために行われる。

性能指数（PI）は、メモリの尺度として役立つ。表1は、PIの代表計算を示す。 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MCHは、ショックと対になって </td><td> 3-OCTは、ショックと対になって </td></tr><tr><td> （OCTチューブ中）MCHを避けたハエ= 80 MCH（MCH管内で）= 20を好むハエ PI 1 - （80-20）/ 80 + 20） = 0.6 </td><td> （MCH管内の）10月= 75を避けハエ （10月管内の）10月= 25を好むハエ PI 2 =（75-25）/（75 + 25） = 0.5 </td></tr><tr><td> 実験=（0.6 + 0.5）のPI /2=0.55 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1の例示的なデータを使用して、性能指数の代表的な計算。異なる実験のための性能指数は、メモリ効果を解明するために比較することができる。そのような一度比較はカントンS野生型成虫ハエ（WT）および劣等生 1ハエ変異体、大人の学習で行った一連の実験からの結果が含まれています。図3に示されている。 10 PIの平均値を平均値の標準誤差（SEM）を表すエラーバーを、備えている。これらの結果は、 劣等生のハエは、野生型と比較して、学習の減少を示すことを実証している。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1.jpg" /> 図1：大人の実験設定。ハエが訓練とT迷路で試験する。訓練は、電気ショックのない第二臭気Bに続いて電気ショックで臭気Aを提示することを含む。中間室での休息期間の後ハエは同時に臭いの両方が表示されます。ハエは捕獲される2管に採取し、学習/記憶のスコアを取得するためにカウントされ、。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2.jpg" /> 大人のトレーニングプロトコル。図。ハエは、二段階で訓練されています。ハエは臭い（CS +）を​​受け取る最初のステップは、60秒間の電気ショック（US）と対をなす。次のステップでは、ハエが感電することなく第二の匂い（CS-）を受け取る。ハエは、その後彼らは、CS +とCS-の間に彼らの選択のためにテストされた後、90秒間休ませている。 <img alt="図3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig3highres.jpg" width="400" /> 図3 ショウジョウバエ成虫に劣等生および野生型学習を示す代表的なグラフ。 </strong&gt; WT及び劣等生ハエは、トレーニングの一つのセッション、次 ​​の試験を行った。 劣等生のハエは、WT（N = 10）と比較して学習の減少を示す。

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Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

ショウジョウバエ成虫連想メモリを測定する方法について説明する。アッセイは、負の強化（電気ショック）を提示した後、メモリを測定することができるように、後でこの情報を呼び出し臭気を関連付けるハエの能力に基づいている。

ショウジョウバエアダルト嗅覚ショックラーニング

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

drosophila-adult-olfactory-shock-learning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

27.7K ビュー.  University of Bristol.  ショウジョウバエ成虫連想メモリを測定する方法について説明する。アッセイは、負の強化（電気ショック）を提示した後、メモリを測定することができるように、後でこの情報を呼び出し臭気を関連付けるハエの能力に基づいている。 

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Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

でアッセイする運動、学習、記憶障害ショウジョウバエ</em神経変性の>モデル

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

神経科学

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

で食欲連想嗅覚学習<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;網膜

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; 4象限オルファクトメーターで

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

大人のための味の好みアッセイ<em&gt;ショウジョウバエ</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

ショウジョウバエの訓練と記憶の尺度としてのコンディショニング

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.