この作品は、ジェームズS.マクダネル財団21 世紀アワードプログラム、およびNIHのディレクターの新イノベーター賞からEDへの補助金によって支えられている。 GABは、再生医療のカリフォルニア工科大学からポスドクによって部分的にサポートされていました。

1。 2100バイオアナライザによるRNAサンプルの品質管理分析始める前に、 <ol><li> ℃で10分間、70梯子して、サンプルを変性させる。氷の上ですぐに冷やします。 </li><li> 10秒のためにRNaseフリー水に続いて1分間RNaseZAPと楽器の電極を、清掃してください。電極は空気乾燥することができます。 </li><li>キットに付属のスピンフィルターにゲルマトリックス550μlをペッティングによってゲルマトリックスを準備します。室温で10分間1500 RCFで遠心する。分注し、最大1ヶ月までは4で65μlを、店舗° Cにゲルをろ過した。 </li><li>チッププライミングステーションを準備するには、 <ol class="lalpha"><li>クリップに通してとルアーロックアダプタに1mlの注射器を挿入します。 </li><li>プレートを持ち上げ、ネジの増し締めは、ベースの下にネジを緩めて、Cを配置するためにベースプレートを調整します。 </li><li>トップの位置にシリンジクリップを調整します。 </li></ol></li><li>室温への染料濃縮物を平衡化させます。 10秒間ボルテックスする。フィルタリングされたゲルの65μlのアリコートに染料を1μlを追加。よくボルテックスし、室温で10分間13,000 RCFで遠心。 1日以内に使用してください。 あなたのサンプルを実行する準備ができたら、 </li><li>プライミングステーション上にチップを置きます。このプロトコルでは、RNA 6000ナノチップを使用しています。ゲルをロードするには、 <ol class="lalpha"><li>よく黒の背景に白の&quot;G&quot;が付いているのゲル色素混合のピペット9μL。あなたの先端がウェルの最下部に配置されていることを確認します。 </li><li> 1ミリリットルで、シリンジのプランジャーを置きます。プライミングステーションを閉じます。それは、ロックをクリックすることを確認してください。 </li><li>それは、クリップで固定されるまでゆっくりと、しかし着実にプランジャーを押し下げて。 </li><li> 30秒間待ちます。クリップを離します。 </li><li>プランジ​​ャーが自動的に起動行きましょう。それは移動を停止した後、数秒待つと1 mlの位置に戻ってプランジャーを引く。プライミングステーションを開きます。 </li></ol></li><li> &quot;G&quot;マーク2のウェルの各々のゲル色素混合のピペット9μL。 </li><li> 12サンプルウェルの各々で、よくはしごのマーカーのピペットを5μl。 </li><li>よくはしごの準備はしごのピペット1μL。 </li><li>ピペットサンプルウェルに各サンプルを1μl。 </li><li>よく、各未使用のサンプルにおけるマーカーのピペット1μL。 </li><li>渦2400 rpmで1分間チップ。 </li><li>チップを実行するには、 <ol class="lalpha"><li> 2100エキスパートソフトウェアを起動します。 </li><li>チップを置き、蓋を閉じます。楽器がライン上にある場合、アイコンは蓋が開いているまたは閉じて、チップの種類が挿入されているかどうかが表示されます。正しいポートが選択されていることを確認します。 </li><li>蒸発を防ぐためにサンプルをロードするの5分以内にアッセイを実行します。 </li></ol></li></ol> 2。増幅とラベリングマイクロアレイ解析の準備をするために、RNAサンプルは、T7 RNAポリメラーゼ3に基づく反応で、通常、増幅し、ラベルが付いています。二本鎖cDNAを逆転写によって生成されます。 cDNAは、cRNAをとして知られているものを生成するためのin vitro転写反応に使用されています。この反応は、アレイハイブリダイゼーションのためのラベルされたRNAのマイクログラム量を生産する、標識されたリボヌクレオチドの存在下で行われる。増幅/ラベリング方法の選択は、使用する後続のマイクロアレイプラットフォームに依存します。このセクションでは、Agilentのクイックアンプのラベリングキットを用いて蛍光標識したRNAの生成を説明します。 <ol><li> 1.5 mlチューブに5μgのRNAにピペット50ngの。ボリュームは8.3μLを超えてはならない。必要に応じて、アルコールによる真空遠心分離や沈殿によりRNAサンプルを濃縮する。 </li><li> T7プライマー1.2μlを添加する。 </li><li> RNaseフリー水11.5μlの最終容量にもたらす。 </li><li> ° Cで1​​0分間RNAを変性させ65℃でインキュベートする。我々は、チューブの上に結露を防ぐために熱い蓋付きサーマルサイクラーを使用することをお勧めします。 </li><li> 10分間のインキュベーション、暖かい5Xファーストストランドバッファー中に80℃で5分間。渦とスピンダウン。使用する準備ができるまで室温で保管してください。 </li><li> 10分間のインキュベーションの後、すぐに氷上に変性RNAサンプルクールダウン。 </li><li> cDNAのマスターミックスを調製する。反応ごとに、次の行を追加します。 <ol class="lalpha"><li> 4μlの5 ×ファーストストランドバッファー</li><li> 2μlの0.1 M DTT </li><li> 1μlの10mMのdNTPを</li><li> 1μlのMMLV​​ - RT酵素</li><li> 0.5μlのRNaseのアウト。 </li></ol></li><li>転倒混和4倍して、コンポーネントを混在させること。ボルテックスしないでください。チューブの下部にコンテンツを収集するためにスピンダウン。 </li><li>サンプルあたりマスターミックスの8.5μlを添加する。上下ペッティングにより混和する。 </li><li> 40℃で2時間インキュベート℃、65℃で10分間、続い℃に我々は、加熱蓋付きサーマルサイクラーを使用することをお勧めします。 </li><li> 5分間氷にチューブを移す。 </li><li>転写のマスターミックスを調製する。反応ごとに、次の行を追加します。 <ol class="lalpha"><li> 15.3μlヌクレアーゼフリーの水</li><li> 20μlの4X転写バッファー</li><li> 6μlの0.1 M DTT </li><li> 8μlの次のNTP </li><li> 6.4μlの50％のPEG（PEGを40℃に加温と再懸濁​​を確保するためにボルテックスしてください） </li><li> 0.5μlのRNaseのアウト</li><li> 0.6μlの無機ピロホスファターゼ</li><li> 0.8μlのT7 RNAポリメラーゼ</li><li> 2.4μLのCy3 -もしくはCy5 CTP </li></ol></li><li>簡単に言えばチューブの下部にコンテンツを収集するサンプルをスピン。 </li><li>サンプルあたりの転写マスターミックス60μlを添加する。 </li><li> 2時間、40℃でインキュベートする。 </li><li> RNaseフリー水20μlを添加する。 </li><li>取り込まれなかったヌクレオチドを​​除去するために標識cRNAを精製する。我々は、QiagenのRNeasyミニカラムを使用することをお勧めします。 </li><li>標識cRNAを定量化する。我々は、マイクロアレイ測定モードでNanoDrop2000分光光度計を使用することをお勧めします。あなたがサンプルタイプとしてRNA - 40を選択してください。 </li><li>記録のサンプルの濃度、収率（体積を掛けた濃度として計算）と比活性（cRNAの濃度以上の色素濃度の飼料を掛けた1000と計算される）。マイクロアレイハイブリダイゼーションのために、それは少なくとも825 ngおよび少なくとも8ピコモル/μgの比活性の収率を達成するために必要です。 </li></ol> 3。マイクロアレイハイブリダイゼーション<ol><li>ハイブリダイゼーションが始まる℃で少なくとも2時間前に65℃のハイブリダイゼーションステーションとセットの電源をオンにします。 </li><li>ハイブリダイゼーションの試料を調製するために、1.5 mlチューブに次のように混ぜる。 <ol class="lalpha"><li> 825 ngのCy3標識cRNAを（これは通常あなたの&quot;治療&quot;のサンプルです） </li><li> 825 ngのCy5標識cRNAを（これは通常あなたの&quot;リファレンス&quot;のサンプルです） </li><li> 11μlの10倍のブロッキング剤。 </li><li> 52.8μlの最終容量にRNaseフリー水を追加します。 </li><li> 2.2μlの断片化バッファーを追加します。 </li></ol></li><li>混在させる低速で渦。 </li><li> 60℃を正確に30分間インキュベートします。これは、アレイハイブリダイゼーションのためにラベルされた断片を生成するcRNAの断片化のステップ、です。それはまさに前述のようにインキュベートすることは非常に重要です。我々は、加熱蓋付きサーマルサイクラーを使用することをお勧めします。正確な平均の長さのプローブを生成するために説明するとおりにインキュベートすることは非常に重要です。過度または不十分な断片化は、偽陰性または偽陽性になります。 </li><li>断片化を停止するには、2Xハイブリダイゼーション緩衝液の55μlを添加します。気泡を導入しないように特別に注意しながら、ピペッティングして混ぜる。 </li><li>チューブの下部にコンテンツを収集するために最大速度で1分間遠心。気泡が認められた場合には、それらを削除するのに時間遠心してください。 </li><li>光から保護され、チューブを氷上に置きます。できるだけ早く配列にサンプルをロードします。 </li><li>配列をロードするには、最初のハイブリダイゼーションチャンバーを用意。このプロトコルは、ロシュ、NimbleGen社のハイブリダイゼーションシステムとA4のミキサー室とAgilentの4x44K配列を使用する方法を説明します。 <ol class="lalpha"><li>組立/分解ツールは、最初のバーコード側のマイクロアレイスライドを置きます。 </li><li> A4サイズのミキサーを開いて、接着剤を公開。配列およびアセンブリ/どんな動きを防ぐために、分解ツールを保持する、遠端から始まる、スライド上にA4のミキサーを置きます。それが正しくツールに沿っていることを確認します。アレイのすべてのスライドに沿ってミキサースティック。 </li><li>スライド/ミキサーアセンブリを削除するには、ミキサーの端から引き出します。 </li><li> brayingツールを使用して、それがしっかりとtheslideに接着されていることを確認するために接着剤ガスケットに沿ってすべてのキーを押します。接着剤とスライドの間に閉じ込められた小さな気泡は、暗い背景に見ることができます。 brayingツールでこれらの気泡を除去するために余分な時間がかかる。配列には、現在ロードする準備ができています。 </li></ol></li><li>ハイブリダイゼーションの試料100μlをロードするために容積式ピペットを使用してください。ポートの穴の内側にしっかりと先端を押してから、空気が配列領域にトラップされないようにゆっくりとスムーズに分注。バックアップのサンプルを吸うしようとしないでください。試料全体が調剤されると、プランジャーを解放せずにポートの穴に先端を保つ。サンプルは、配列全体をカバーし、液体がベントポートから出てきます起動すると、迅速にピペットを取り外します。先端が離れてスライドからになると、唯一のプランジャーを解放。 </li><li>両方のポートで優しく軽く余分な液体。あなたがチャンバー自体のサンプルを引き出していないことを確認してください。 </li><li>ピンセットを使って、ステッカー付きポートの穴をカバーしています。 </li><li>ハイブリダイゼーションステーションでスライドを入れ、膀胱の穴は正確にO -リングの上に置かれていることを確認してください。これは、ハイブリダイゼーション中に混合適切な保証されます。 </li><li>スライドカバーとステーションのカバーを閉じます。ミキシングモードBにステーションを設定する</li><li> ℃で17時間を65で配列をハイブリダイズさせる。 </li><li> 0.005％の最終濃度にトリトンX - 102を追加することによって、バッファ2を洗う準備する。 37℃で一晩おいてください。 </li></ol> 4。マイクロアレイの洗浄<ol><li> 0.005％の最終濃度にバッファー1を洗浄するためにトリトンX - 102を追加。部屋のtemperaturでおいてくださいE. </li><li>ハイブリダイゼーションが終了すると、洗浄バッファー1でガラス皿&quot;A&quot;をご記入ください。料理は、アセンブリ/分解工具を保持し、同様にいくつかの駆け引きを可能にするために十分な大きさにする必要があります。すべての洗浄は、ガラス製品で行う必要があります。彼らは、配列内の高いバックグラウンドで結果浸出物に傾向があるので、プラスチック製の皿を避けてください。 </li><li>染色皿&quot;B&quot;のスライドラックと攪拌棒を置く。それはラックをカバーすることを確認し、洗浄バッファー1で埋める。室温で撹拌プレート上での場所。 </li><li>空の染色皿&quot;C&quot;と撹拌プレート上での場所での攪拌棒を置く。 </li><li>アレイを削除し、組立/分解ツールでそれを置く。料理&quot;A&quot;に浸し、アセンブリ全体を。 </li><li>慎重にA4ミキサーを剥がし、片手で反対側から取り付け/取り外しツールとスライドを保持している間。もし配列の領域を傷つけたりしないことを確認してください。 </li><li>素早く料理&quot;Bを&quot;染色のラックにスライドを配置する。 Cy5の色素がオゾンに敏感なので、今から、空気への曝露を最小限に抑える必要があります。一度に8つ以上のアレイを洗浄しないでください。 </li><li>中速で攪拌しながら1分間洗浄する。 </li><li>予め温めておいた洗浄バッファー2で染色皿&quot;C&quot;を記入します。スライドを移し、1分間洗浄。 </li><li>非常にゆっくりとスライド上に取り残された液滴を最小限にする料理&quot;C&quot;を染色からスライドラックを取り外します。 </li><li> 2分間回転させてスライドを乾燥させる。互換性のある遠心機が利用できない場合、50 mlコニカルチューブにスライドを遠心またはそれ以上のアルゴンガスを吹く。 </li><li> 50 mlコニカルチューブの代わりにスライドし、アルゴンガスで塗りつぶす。信号の損失を避けるためにすぐにスキャン。我々は、分子デバイスからGenePix 4000Bスキャナーの使用をお勧めします。 </li></ol> 5。代表的な結果： 品質管理のためにバイオアナライザで実行すると良い品質のトータルRNAサンプルは、2つの主要なリボソームRNA種に相当する、唯一の二つの主要なピークを生成する必要があります。いくつかのRNAの分解は、最初のリボソームRNAのピーク前にスメアとして表示されます。 2リボソームRNAのピークが非常に低い強度またはまったく識別がされる一方でパフォーマンスが著しく低下し、低品質のRNAは、低保持時間でブロードなピークまたはピークのシリーズが表示されます。 2100バイオアナライザの出力の例については、図1を参照してください。 エキスパート2100ソフトウェアは、RNAの品質の定量的な測定として、RNAの完全性の数、またはRINを計算します。高品質のサンプルは、9よりも高いRIN値で、マイクロアレイのアプリケーションに最適明らかです。しかし、我々は合理的な品質のマイクロアレイデータを生成するには5.2という低いRIN値でのサンプルを使用している。 良い品質の配列は、比較的低いPMT値で高信号を生成する必要があります。私たちの実験では、転写産物のほとんどは、実験とリファレンスサンプル中の同じようなレベルで存在することが期待され、遺伝子発現の大規模な、広範囲に変化はおそらく生物学的意義にも支障を来たしてしまう。したがって、配列のほとんどは黄色ではなく、緑色または赤色になるはずです。良好な品質の信号はまた、ダイナミックレンジで信号のヒストグラムが完全に重なるようなものであるべきである。例については、図2を参照してください。 <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig1.jpg" alt="図1" /> 図1人間の脳の腫瘍組織から分離されたfour RNAサンプルの例。 RNAは、3.1.1で紹介したプロトコルを用いて単離した。サンプルの品質は、3.1.3で説明されているRNAの6000チップで2100バイオアナライザを用いて評価した。サンプルは、4つの異なるRNAの質の代表的なものである：非常に良いRNAの品質（RIN&gt; 9）、B、部分的に分解したRNA（RIN 5-6、28S rRNAのための有意に低いピークに注意）、C、高度に分解したRNA（RIN &lt; 3）、D、ほぼ完全に分解したRNA（RIN = 2）。私たちは、下流のマイクロアレイアプリケーション用に類似またはB（RIN&gt; 5.2）より良い品質でサンプルを正常に使用している。ソリッドとオープン矢印はそれぞれ、18Sおよび28S rRNAの種の位置を示している。 <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig2.jpg" alt="図2" /> 図2配列の画像と散布図の例。 4X44K Agilentの形式で4つの配列を示し、全体のスライドプレビュー、、B、配列の領域の一つの高解像度スキャンでは、信号のどちらも（赤または緑）が支配的であることに注意して、C、の画像の散布図B、 ​​信号が完全に重なって、これ以上-6 × 10以上の機能が飽和強度にあることに注意してください。

<ol>
	<li>Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Decade+Later:+What+has+Gene+Expression+Profiling+Told+us+About+Neuronal+Cell+Types,+Brain+Function+and+Disease.">One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease.</a> Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).</li><li>Barisone, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , (2010).</li><li>Gelder, R. N. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

DNAマイクロアレイによる発現プロファイリングは、2つの生物学的サンプル間の発現の異なる遺伝子を同定するための直接的なアプローチを提供します。成功した発現プロファイリング実験は、高品質なRNAサンプル、堅牢なラベリングとハイブリダイゼーションを必要とする。我々の経験では、Agilentから商業配列とラベリングキットは、妥当なコストで高品質なデータを提供しています。 Agilentはまた、独自のハイブリダイゼーションとスキャニング機構を提供する一方で、我々は、ロシュ、NimbleGen社と分子デバイスからGenePix 4000Bマイクロアレイスキャナーからハイブリダイゼーションシステムを好む。ロシュ- NimbleGen社のハイブリダイゼーションのユニットは、以前MAUIハイブリダイゼーションシステムとして知られていることに注意してください。ロシュによる最近の企業の買収後、A4のミキサーは廃止されました。これを書いている瞬間のように、彼らはまだそのようなKreatech診断（のような他の販売を通して見つけることができます<a href="http://www.kreatech.com/">www.kreatech.com</a> 、このウェブサイトはまた、便利な配列の互換性ツールを提供しています）が、長期在庫の有無は不明である。他のハイブリダイゼーションシステム（たとえば、アジレントから）使用できますが、配列が使用されて互換性のあるミキサーを見つけることができるなら、我々は、その品質と再現性のためにロシュ- NimbleGen社のシステムをお勧めします。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2943CA</td>
<td>Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer</td>
</tr>
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer electrophoresis set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2947CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNA 6000 Nano kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5067-1511</td>
<td>includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems &#x2013; Ambion</td>
<td>AM9780M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quick Amp labeling kit, two-color</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5190-0444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy mini kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-542</td>
<td>Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>Gene Expression Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-5327</td>
<td>Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05223652001</td>
<td>4-slide model</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization System Accesory Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05327695001</td>
<td>Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer</td>
</tr>
<tr>
<td>A4 mixer hybridization chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G4112F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary pistons for positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nimblegen</td>
<td>05223636001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix Pro 6.0 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna microarrays: sample quality control, array hybridization and scanning

神経系のマイクロアレイの発現プロファイリングは、開発のさまざまな段階で特定する遺伝子の活動への強力なアプローチ、さまざまな生理的または病理学的状態、治療への反応、及び、一般的に、実験的に1をテストされているいずれかの条件が用意されています。神経組織の発現プロファイリングは、単離されたRNAとDNAマイクロアレイへのハイブリダイゼーションの増幅、高品質のRNAの分離を必要とします。この記事では、脳腫瘍の組織2からの再現性のあるマイクロアレイ実験のためのプロトコルについて説明します。我々は、Agilentの2100バイオアナライザ&quot;ラボオンチップ&quot;技術で分離されたRNAサンプルの品質管理分析を行うことにより開始されます。高品質なRNAサンプルは、任意のマイクロアレイ実験の成功のために重要である、と2100バイオアナライザは、サンプルの品質の迅速、定量的な測定を提供します。 RNAサンプルは、標識cRNAを生成するために標識されたヌクレオチドの存在下でin vitro転写により続いて、cDNAを得るために逆転写を行うことにより増幅し、ラベルが付いています。デュアルカラーラベリングキットを使用することにより、我々は、Cy3およびCy5と参照試料との我々の実験サンプルにラベルを付けます。両方のサンプルを、組み合わせるとAgilentの4x44 Kアレイにハイブリダイズされる。デュアルカラーの配列は、2つのRNAサンプルは、単一のマイクロアレイに競合ハイブリダイズされているため、それによって、発現レベルの小さな変化のために特に、測定の精度を高める、2つのRNAサンプル間の直接比較の利点を提供する。配列は2つの対応する波長でスキャンされ、そして各機能のCy3のにCy5シグナルの比率は、対応するmRNAの相対量の直接測定として使用されます。この分析では、差動テストされている実験条件に対応して発現される遺伝子を識別します。

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DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

我々は、神経系の発現プロファイリングのためのDNAマイクロアレイの使用例を示します。我々は、RNAの品質管理、サンプルのラベリング、およびアレイハイブリダイゼーションとスキャニングを説明します。

DNAマイクロアレイ：サンプルの品質管理、アレイハイブリダイゼーションとスキャニング

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

dna-microarrays-sample-quality-control-array-hybridization

Research

JoVE Journal

Biology

37.8K ビュー.  University of California, Davis. 我々は、神経系の発現プロファイリングのためのDNAマイクロアレイの使用例を示します。我々は、RNAの品質管理、サンプルのラベリング、およびアレイハイブリダイゼーションとスキャニングを説明します。

ビデオ: DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

全ゲノムアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの技術デモンストレーション

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

生物学

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

見つけにくい小型哺乳類から高品質のDNAを得るために非侵襲ヘアサンプリング法

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays）

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

ゲノムコピー数変異体の検出のためのアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（アレイCGH）

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

光安定シアニン色素を用いた波長シフトDNAハイブリダイゼーションプローブの合成

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

タンパク質の品質管理システムを学びます<em&gt; D。 discoideumの</em&gt;温度制御された生細胞イメージングを用い

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...