1。手術を行う前に、研究と教育における動物の使用を中心法的および倫理的な要件があることに注意してください<ol><li>すべての外科的処置は、地元の倫理的または法律上の権限（IACUCまたは倫理委員会やホームオフィス、等）によって承認されなければならない。 </li><li>この承認は、開始前に場所にあることを確認します。 </li><li>動物の使用のための手術または承認の承認の質問がある場合は、続行しないでください。 </li></ol> 2。無菌操作を理解する<ol><li>概念としての不稔性<ol><li>無菌操作の目的は、動物の上で、環境中に存在する正常細菌の負担は手術開始前に、可能な限り軽減または排除することです。これは、楽器が滅菌され、外科的作業面は消毒であり、そして動物と外科医の手を消毒されていることを意味します。 </li><li>手術は、適切に実行される、痛みの軽減以外の予防的抗生物質または他の治療法を、必要としません。 </li><li>にも優秀な無菌操作で、外科患者に由来する細菌は、依然として外科的に作られた傷に導入することができる。適切な無菌操作は外科のサイトに、主に細菌、感染性病原体の導入のリスクを制限する。 </li></ol></li><li>滅菌フィールド<ol><li>滅菌フィールドは、外科領域、動物に準備エリア、そして外科医の正面を網羅しています。 </li></ol></li><li>不妊でブレーク<ol><li>外科医は、滅菌野外で何かに触れたときに不妊にブレークが発生します。これは彼女の顔、照明器具、動物の準備ができていない領域、または非滅菌器具があります。 </li><li>これは、予防的抗生物質が使用される理由です。 </li><li>覚えておいて、特別な活動が発生しています。 、穏やかな思慮深い、そして正確である。 </li></ol></li></ol> 3。手術の準備<ol><li>齧歯類の手術は、専用の手術室を必要としません。理想的には、手術はこのようなフードや層流キャビネットとして、実験室内で別の領域で実施されるべきである。関係なく、選択されたエリアにはきちんとした、明るい、と出入りするトラフィックのフローである必要があります。齧歯類の手術は、しばしば実験室のベンチトップで実施されています。外科領域を配置する前に、消毒剤でよくベンチをきれいに。 </li><li>それは、アシスタントを持っている外科医のために有用です。この助手は動物、および監視のリカバリの準備が、麻酔を支援することができます。これは、このように麻酔下で動物の時間を短縮し、おそらく実行される多くの手術を可能にする、動物が用意されている間、外科医が自分自身を準備することができます。 </li><li>準備、手術、そして回復の3つの別個のゾーンが存在するように外科領域を手配する。 </li><li>準備領域の場合は、必要な電源を組み立てる。 <ol><li>潤滑の眼軟膏</li><li>バリカンまたはかみそり</li><li>ガーゼ</li><li>外科スクラブソリューション<ol><li>一般的に使用される外科用スクラブのソリューションは、ヨードフォアまたはクロルヘキシジン/です。 </li><li> 70％のイソプロピルアルコールはまた外科スクラブの一部として使用されます。 </li></ol></li></ol></li><li>外科領域の場合は、必要な電源を組み立ててアレンジ。 <ol><li>げっ歯類は保温のための熱源<ol><li>理想的な熱源は、循環水の加温パッドです。電気加熱パッドは、手術のために受け入れられるものではない。暖かい水、または化学ハンドウォーマーで満たされた手術用手袋を使用してもよい。後者の二つのうちどちらかが使用されている場合、オブジェクトの温度は、慎重に手術中に監視する必要があります。 </li></ol></li><li>外科的プラットフォーム<ol><li>これは、熱源の上に配置無菌防水パッドがあります。 </li></ol></li><li>使い捨て用品<ol><li>これらのものがあります。滅菌外科用ドレープ、ガーゼ、綿アプリケーター、齧歯類に投与するために体液、組織の灌漑ソリューションを。 </li></ol></li><li>滅菌器具<ol><li>楽器の補数は、手術によって異なりますが、一般的にメス、組織のリトラクター、鉗子、止血、そしてはさみが含まれます。 </li><li>同じ楽器が複数の外科患者に使用する場合は計器の殺菌または消毒液<ol><li>動物の間に楽器を殺菌するホットビーズ滅菌器の使用が一般的です。 </li></ol></li></ol></li><li>外科的切開を閉じるための材料。 <ol><li>手術部位やアプリケーションに依存しますが、含めることができます使用される材料：縫合糸と針、ステープルおよびステープルアプリケーター、または組織の接着剤</li></ol></li><li>必要に応じて、他の特別な装置（定位固定装置、インプラント、手術用顕微鏡） </li></ol></li></ol> 4。外科用器具の準備<ol><li>楽器はきれいになるとしてください手術の開始時に滅菌。これは多くの場合、オートクレーブしている完全な外科的パックを作成することによって実現されます。 </li><li>ナショナルインスツルメンツは、オートクレーブ処理し、再梱包することなく複数の齧歯類の手術のために使用されるかもしれませんが、きれいにしてげっ歯類の間で滅菌する。 <ol><li>ホットビーズ滅菌器が使用されている場合は、滅菌後にクールダウンするの楽器のための時間を確保してください。ナショナルインスツルメンツは、滅菌水に浸漬して冷却することができる。 </li><li>化学滅菌剤も使用できますが、（〜10分、ことができる洗浄が必要な、30〜60分になる）より長い接触時間が必要になることがあります。アルコールは殺菌剤ではありません。 </li></ol></li><li>それらが使用される順序で滅菌防水ドレープ上で楽器を手配する。 </li></ol> 5。手術のため動物の準備<ol><li>手術前に投与されている三つのことは麻酔、鎮痛、および抗生物質です。 <ol><li>麻酔は手術のために必要です。麻酔薬は、吸入または注射により投与することができる。 <ol><li>使用中の最も一般的な吸入麻酔薬は現在、イソフルランです。 </li><li>使用される最も一般的な注射麻酔は、他の鎮静剤が追加された可能性があると、ケタミンとキシラジンの組み合わせです。 </li><li>適切な投与量については、施設獣医スタッフにご相談ください。 </li></ol></li><li>先制鎮痛薬が推奨されており、手術が始まる前に投与する必要があります。 <ol><li>一般的に使用される非ステロイド性抗炎症剤は、フルニキシンとカルプロフェンを含む。 </li><li>利用可能なオピオイドはブプレノルフィン、モルヒネ、またはフェンタニルを含めることができます。 </li><li>適切な投与量と投与経路のため、施設獣医スタッフにご相談ください。 </li></ol></li><li>適切に実施された手術で、抗生物質は一般的に、いくつかのリスクの高い消化管手術を除いて、必要とされていません。 <ol><li>抗生物質が使用されている場合は、使用される（最初の切開の前に）周囲の作動を提供。 </li><li>適切な抗生物質、投与量、および投与経路のため、施設獣医スタッフにご相談ください。 </li></ol></li></ol></li><li>切開部位の外科的準備<ol><li>切開部位を剃る。一般的に提案された切開の約3倍の大きさの領域を削る。剃毛し、準備領域の大きさは、動物で、動物やエリアの大きさによって制限される場合があります。 </li><li>剃毛面積は、手術スクラブ液とイソプロピルアルコールの複数のアプリケーションを使用して消毒されています。アプリケーションは、アルコールその後、最初に一般的に手術スクラブです。スクラブソリューションの最終的なアプリケーションで終わり。 </li><li>外科スクラブは中央で始まり、外側に、または小動物、単方向のファッションに螺旋状に、円形のパターンで実行されます。 <ol><li>一方向にスクラブした場合、動物の毛をカバーする、剃毛面積のcrainialマージンで滅菌ガーゼを置く。滅菌ガーゼで軽く動物をつかんで安定。一方向に離れて滅菌ガーゼからソリューションとアルコールをスクラブ適用する。 </li></ol></li></ol></li><li>外科領域への動物の移動<ol><li>上向きの準備手術部位に動物を移動し、準備したサイトに連絡することなく。 </li><li>手術部位が上向きになるように外科医が直面している、外科領域に動物を配置します。 </li></ol></li><li>動物をドレープ<ol><li>動物がアシスタントで覆われている場合、アシスタントは、ドレープの外面を滅菌フィールドの一部とみなされており、アシスタントによって処理されてはならないことを覚えておく必要があります。ドレーピングはしばしば外科医に任されている、とドレープは、手術パックに含まれています。 </li><li>標準防水使い捨ての紙のドレープは一般に推奨されます。 </li></ol></li></ol> 6。手術のために外科医の準備<ol><li>外科医の準備は特別な活動は、外科医は、滅菌野に出入りするすべての動きを認識でなければならないものを行われることを強調すべきである。 </li><li>髪の毛と顔は一般的にそれぞれ、キャップとマスクで覆われている。これらは外科的セッションの開始時に新しいはずですが、動物間で変更する必要はありません。 </li><li>外科医は使い捨て手術用ガウン、清潔な使い捨て白衣または少なくとも清潔な白衣を着用してください。これは動物の間で変更する必要はありませんが、手術のセッション間で変更する必要があります。 </li><li>手は、手術前によく洗浄してください。手術用手袋や試験の手袋を使用する必要があります。試験の手袋が使用されている場合、それらは、使用される前に外科的消毒剤で洗浄する必要があります。手袋は、動物との間で変更する必要があります。 </li></ol> 7。手術中<ol><li>滅菌野のメンテナンス。 <ol><li>あなたの手は無菌であり、術野が滅菌したら、慎重に移動し、無菌性を壊さないように覚えておく必要があります。この合わせたもの含めるDESは、あなたの鼻を傷つけないように覚えて、あなたが楽器を下に置く可能性があるの滅菌フィールドを有し、そして唯一の滅菌ドレープを介して外科患者を渡す。 </li></ol></li><li>組織の取り扱い<ol><li>そっとティッシュを扱う。手術が長引く場合は特に、組織の潤いを保つ。ティッシュポケットや不必要な解剖の作成を最小限に抑える。 </li><li>適切な組織の扱いは、機会と術後感染症、速度の治癒のリスクを軽減し、術後の痛みを軽減。 </li></ol></li><li>失われた体液を交換してください<ol><li>げっ歯類における流体管理の通常の経路は、皮下または腹腔内です。たとえば、マウス用の小動物- 1 - 2 mlの腹腔内には小さなボリュームを使用してください。 </li><li>温められた液体は体温の低下を防ぐことができる。マウスとラットの体温は人間よりも高くなっていますので、体液は暖かくでなければなりません。 </li></ol></li><li>暖かさを維持する<ol><li>手術中の動物の下に加熱パッドとリカバリ時にケージの配置は、動物の体温を維持するために標準的な方法です。 <ol><li>手術することが指定されている唯一のパッドは、使い加熱には注意。その他には、熱による損傷を誘発する可能性があります。 </li></ol></li><li>温められた流体、腹腔内には、また暖かい動物を助けるかもしれない。 </li></ol></li><li>顕微鏡は、可能性があるいくつかの手続き円滑に動作（微小血管外科、旧外科医、などともルーペのような拡大鏡を使用すること、等によって達成することができます） </li></ol> 8。術後の回復に関する考慮事項<ol><li>動物は、平坦な紙の寝具（滅菌ペーパータオルなど）ではなく、標準的な畜産の寝具に回復する必要があります。 </li><li>動物を保温。暖かさは、迅速な復旧に役立ちます。これは多くの場合、回復のケージの半分を - に置く加熱パッドは回復として、動物が自分の好みの温度を選択できるようにすることによって達成される。 </li><li>すべての動物が正常に表示されるまで、動物の保管領域に動物やケージを返すしないでください。手術をしたすべての動物は、ケージに右自体に能力を回復し、保持領域に返される前に約正常に動くことができなければ持っている必要があります。 </li><li>病気や感染症の予想外の徴候がないか、術後の動物を監視する。動物は一般的に手術後の重量の少量を失うことになるが、適切な鎮痛と食料の供給と、彼らはすぐに体重を回復する必要があります。 </li></ol> 9。術後のモニタリングは、手術の成功の最後の部分です。 <ol><li>手術後5〜7日の場合は、動物の一般状態を監視する。 <ol><li>手術後、動物は、明るい警告、およびアクティブにする必要があります。彼らは食べたり飲んだり、cagematesと正常に相互作用し、正常な種特異的な姿勢を達成することができるはずです。 </li><li>抑うつ、食欲抑制、または緩慢な動物はこの変化の原因として検討されるべきである。未治療の痛みや感染の可能性を考慮してください。 </li></ol></li><li>食品/水分摂取にも回復に重要である。 <ol><li>手術後の消費にいくつかのドロップオフが存在します。これは、アクセスするための食料と水を容易にすることで軽減されることがあります。 <ol><li>長いシッパーチューブが有用かもしれません。 </li><li>ケージの底部に接液食品の日常整備も食べるために動物を誘うことができる。 </li></ol></li><li> PICAのラットの結果の一部の鎮痛薬は、その動物が負傷する不適切な項目（寝具など）を食べる可能性があることに注意してください。 </li></ol></li><li>切開での感染の徴候のために動物を監視します。危険期間は最初の7日間であり、動物は、毎日チェックする必要があります。 <ol><li>感染の徴候は発赤、腫脹、放電（化膿性または漿液性）、痛み、または切開（裂開）の開口部が含まれています。 </li></ol></li></ol> 10。あなたの手術が終了した後、最後のステップでは、手術の成功を測るれる<ol><li> /機能をモデル誘導/一部を回復削除された？ </li><li>できるだけ少ない苦痛としてなかった？ </li><li>も感染はなかった？ </li><li>成功！ </li></ol>

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American College of Laboratory Animal Medicine Position on Rodent Surgery. , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Welfare, 9 CFR, Parts 1, 2, and 3. , .</li><li>Bradfield, J. F., Schachtman, T. R., McLaughlin, R. M., Steffen, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+physiologic+effects+of+inapparent+wound+infection+in+rats.">Behavioral and physiologic effects of inapparent wound infection in rats.</a> Lab Anim Sci. 42, 572-578 (1992).</li><li>Brown, M. J., Pearson, P. T., Tomson, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+animal+surgery+in+research+and+teaching.+AVMA+Panel+on+Animal+Surgery+in+Research+and+Teaching,+and+the+ASLAP+(American+Society+of+Laboratory+Animal+Practitioners).">Guidelines for animal surgery in research and teaching. AVMA Panel on Animal Surgery in Research and Teaching, and the ASLAP (American Society of Laboratory Animal Practitioners).</a> Am J Vet Res. 54, 1544-1559 (1993).</li><li>Brown, P. A., Hoogstraten-Miller, S., Reuter, J. D., Suckow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Aseptic+Rodent+Survival+Surgery:+Parts+I+&#38;+2.">Principles of Aseptic Rodent Survival Surgery: Parts I &#38; 2.</a> Laboratory Animal Medicine and Management. , (2004).</li><li>Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 556-570 (1996).</li><li>Popp, M. B., Brennan, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+vascular+access+in+the+rat:+importance+of+asepsis.">Long-term vascular access in the rat: importance of asepsis.</a> Am J Physiol. 241, H606-H612 (1981).</li><li>Rutala, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APIC+guideline+for+selection+and+use+of+disinfectants.">APIC guideline for selection and use of disinfectants.</a> Am J Infect Control. 24, 313-342 (1996).</li></ol>

すべての著者は、チャールズ川、研究のための外科的に改変された動物の主要なサプライヤーのために働く。

げっ歯類の実験的手術はほとんどの獣医師や医師によって実施されていません。その代わりに、それはしばしば手術の原理と無菌操作にほとんど、あるいはまったく正式なトレーニングと生物医学の研究者によって実行されます。研究の場では、手術が一般的に同僚から学習される、それ自体は通常、正式にどちらかの訓練を受けていません。研究室で行われる手術は、主に研究用の動物のセットを生成することを目的とした動物モデルの作製方法と見なすことができる。特定の手術は通常practiceを介して取得することができますどちらも手と目の協調や技術スキルの問題、ですが、無菌テクニック（その結果、感染なしの手術）の概念に関連する原則とスキルは、単にpracticeを介して取得することができず、多くの場合、完全に研究者に伝達されていません。 外科手術の原則の正式な訓練の欠如は、技術的に正しい手術や動物のプレおよび術後ケアの両方の等しい重要性の理解の欠如につながることができます。手術自体と動物の周術期のケアの両方の考慮は、動物福祉の増加と外科的モデルから得られたデータの品質になります。例えば、不顕性の外科手術後の感染は、動作と痛みで見られる生理学の変更が可能、結果を混乱させることができる。餌生物として、ほとんどのげっ歯類は、驚くほどストイックであり、外科手術後の痛みや感染症を患っているものの、いくつかの臨床的徴候を示すことができる。げっ歯類では痛みや苦痛の微妙な兆候は、さらにげっ歯類のような兆候の認識の生物医学研究者の訓練の一般的な不足に隠れています。スタッフは一般的に手術後の痛みの臨床的および行動の兆候を表示するには、利用できないときまた、げっ歯類は、明暗サイクルの間に最も活発です。このビデオでは、適切な外科手術のトレーニングに代わるものではない理想的に両手オンされるであろうし、それらの機関によって提供されているが、研究者に共通の関心事と最小限の能力を開発するために必要な受け入れ無菌手順やテクニックの視覚的なデモンストレーションの概要を示すために設計されています。げっ歯類の生存の手術の性能インチ

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principles of rodent surgery for the new surgeon

科学的および動物の両方の福祉上の理由から、基本的な外科的な概念とテクニックの訓練はこれまでにげっ歯類の手術を実行しようとする前に実施すべきである。学生、ポスドク研究者、および研究プロトコルの一部として、げっ歯類の手術を行うことに関心のある人々は彼らの必須の授業の一環として、正式な手術のトレーニングを受けていない可能性があります。手術自体は技術的なスキル、そして実践と改善されるものです。無菌操作の原則は、しかし、しばしば原因不明または無教育のままです。最も新しい外科医の場合は、この重要な情報は断片的に提示されるか、または仕事上で学習、理想的ですどちらも。また、新たな外科医が同時に手術手技と無菌状態の原理の両方を学んでいるように、困難な特定の手術を実行する方法を学習することがあります。この記事で要約し、成功したげっ歯類の手術のために必要な基本的な外科的なスキルとテクニックのための提言を行う。この記事は、ユーザの機関で実地研修を補完するために設計されています。

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Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

手術を試みる前に、新たな外科医は、基本的な手術手技や概念のトレーニングが必要です。この記事では、げっ歯類に重点を置いた基本的な手術の考慮事項を紹介します。

新外科医のための齧歯類の外科の原則

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

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Research

JoVE Journal

Biology

112.0K ビュー.  Research Models and Services. 手術を試みる前に、新たな外科医は、基本的な手術手技や概念のトレーニングが必要です。この記事では、げっ歯類に重点を置いた基本的な手術の考慮事項を紹介します。

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Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson gives a concise overview of Parkinsons's disease, its causes, therapeutic strategies, and advances in Parkinson's research.

オレIsacson：パーキンソン病に対する新しい治療法の開発

生物学

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

部位特異的リコンビナーゼ（SSR）技術の原理

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

免疫シナプスとKinapseの研究の形成のためのサポートされている平面二重層

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

腱板断型ボトルの培養システムを使用してげっ歯類全胚培養の方法

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

成長因子Progranulinと相互作用するタンパク質を識別するように変更酵母ツーハイブリッドシステム

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

微生物システム生物学のケモスタットの使用

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

腫瘍球の高スループット画像解析：自動的かつ正確にスフェロイドのサイズを測定するための使いやすいソフトウェアアプリケーション

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

心筋パフォーマンスと酸素消費量の研究のための齧歯類のワーキングハートモデル

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Methods Article

新外科医のための齧歯類の外科の原則