1. Antes de realizar a cirurgia, saiba que existem requisitos legais e éticas em todo o Uso de Animais em Pesquisa e Ensino <ol><li> Todos os procedimentos cirúrgicos devem ser aprovados pela autoridade local ético ou legal (IACUC ou Comitê de Ética ou Home Office, etc.) </li><li> Certifique-se que esta aprovação está no lugar antes de começar. </li><li> Se houver qualquer dúvida de aprovação para a cirurgia ou a aprovação para o uso de animais, não prossiga. </li></ol> 2. Compreensão de uma técnica asséptica <ol><li> Esterilidade como um conceito <ol><li> O objetivo da técnica asséptica é reduzir ou eliminar sempre que possível a carga bacteriana normal presente no animal e no ambiente antes de iniciar a cirurgia. Isto significa que os instrumentos são esterilizados, a superfície de trabalho cirúrgico é desinfetada, eo animal e as mãos do cirurgião são desinfectados. </li><li> Cirurgia, realizada corretamente, não precisa de antibióticos profiláticos ou quaisquer outros tratamentos, que não seja o alívio da dor. </li><li> Mesmo com uma excelente técnica asséptica, bactérias provenientes do assunto cirúrgico pode ainda ser introduzido em uma ferida, criado cirurgicamente. Técnica asséptica apropriada limita o risco de introdução de agentes infecciosos, principalmente bactérias, em locais cirúrgicos. </li></ol></li><li> Campo estéril <ol><li> O campo estéril abrange a área cirúrgica, a área preparada para o animal, e à frente do cirurgião. </li></ol></li><li> Quebras de esterilidade <ol><li> Quebras de esterilidade ocorrer quando o cirurgião toca em algo fora do campo estéril. Este pode ser o rosto dela, uma luminária, uma área despreparados do animal, ou um instrumento não esterilizado. </li><li> Esta é a razão antibióticos profiláticos podem ser usados. </li><li> Lembre-se, uma atividade especial está acontecendo. Fique calmo, atencioso e preciso. </li></ol></li></ol> 3. Preparação para Cirurgia <ol><li> Cirurgia de roedores não requer um conjunto dedicado cirúrgico. Idealmente, as cirurgias devem ser realizadas em uma área separada dentro de um laboratório, como um capuz ou câmara de fluxo laminar. Independentemente disso, a área escolhida deve ser arrumado, bem iluminado, e fora do fluxo de tráfego. Cirurgias de roedores são muitas vezes realizados em uma bancada de laboratório. Antes de organizar a área cirúrgica, limpar a bancada bem com um desinfectante. </li><li> É útil para o cirurgião de ter um assistente. Este assistente pode ajudar com a anestesia, preparando os animais, e recuperação de monitoramento. Isso permite que o cirurgião para preparar-se enquanto os animais são preparados, encurtando assim o tempo do animal sob anestesia, e, talvez, permitindo cirurgias mais para ser realizada. </li><li> Organizar a área cirúrgica, para que existem três zonas distintas: preparação, cirurgia e recuperação. </li><li> Para a área de preparação, montar os suprimentos necessários: <ol><li> Pomada oftálmica lubrificante </li><li> Clippers ou navalha </li><li> Gaze </li><li> Cirúrgicos soluções matagal <ol><li> Soluções matagal cirúrgicos comumente utilizados são iodóforos ou clorexidina / </li><li> 70% de álcool isopropílico também é usado como parte do matagal cirúrgico. </li></ol></li></ol></li><li> Para a área cirúrgica, montar e organizar os materiais necessários. <ol><li> Fonte de calor para manter o roedor quentes <ol><li> A fonte de calor ideal é uma almofada de aquecimento de recirculação de água. Almofadas de aquecimento eléctrico não são aceitáveis ​​para a cirurgia. Luvas cirúrgicas cheia de água quente, ou aquecedores de mão química também podem ser usados. Se qualquer um dos dois últimos são usados, a temperatura do objeto devem ser cuidadosamente monitorizados durante a cirurgia. </li></ol></li><li> Plataforma cirúrgica <ol><li> Esta pode ser uma almofada estéril impermeável colocada sobre a fonte de calor. </li></ol></li><li> Material descartável <ol><li> Estas podem incluir: campos cirúrgicos estéreis, gaze, algodão aplicadores, fluidos para a administração para o roedor solução de irrigação, o tecido. </li></ol></li><li> Instrumentos esterilizados <ol><li> O complemento de instrumentos pode variar dependendo da cirurgia, mas geralmente incluem bisturis, afastadores de tecidos, fórceps, hemostats e tesoura. </li><li> Esterilizador de instrumento ou de esterilização solução se os mesmos instrumentos devem ser usados ​​em mais de um assunto cirúrgico <ol><li> O uso de um esterilizador quente talão para esterilizar instrumentos entre animais é comum. </li></ol></li></ol></li><li> Material para fechar a incisão cirúrgica. <ol><li> Os materiais utilizados dependerá do sítio cirúrgico e aplicação, mas podem incluir: sutura e agulhas, grampos e um aplicador de grampo, ou cola de tecido </li></ol></li><li> Qualquer outro equipamento especial necessário (aparelho estereotáxico, implantes, microscópio cirúrgico) </li></ol></li></ol> 4. Preparar os instrumentos de cirurgia <ol><li> Instrumentos devem estar limpos eestéril no início da cirurgia. Isso é muitas vezes feito através da criação de pacotes completos cirúrgicos que são autoclavados. </li><li> Instrumentos podem ser usados ​​para mais de uma cirurgia de roedores sem autoclave e reembalagem, mas devem ser limpos e esterilizados entre roedores. <ol><li> Se um esterilizador talão quente é usado, certifique-se de dar tempo para que os instrumentos para esfriar após a esterilização. Instrumentos podem ser arrefecidas por imersão em água estéril. </li><li> Esterilizantes químicos também podem ser usadas, mas requerem um maior tempo de contato (~ 10 minutos, poderia ser de 30-60 minutos, requerem limpeza). O álcool não é um esterilizante. </li></ol></li><li> Organizar instrumentos em drape impermeável estéril na ordem em que eles serão usados. </li></ol> 5. Preparar o animal para a cirurgia <ol><li> As três coisas que são administrados antes da cirurgia são a anestesia, analgesia, e antibióticos. <ol><li> A anestesia é necessário para a cirurgia. Anestésicos podem ser administrados por inalação ou injeção. <ol><li> Anestésicos inalantes mais comuns em uso atualmente isoflurano. </li><li> Mais comum injetável anestésico utilizado é uma combinação de ketamina e xilazina, possivelmente com outro acrescentou sedativo. </li><li> Consulte seu veterinário para a equipe do local doses adequadas. </li></ol></li><li> Preventiva analgésicos são recomendados e devem ser administradas antes da cirurgia começa. <ol><li> Comumente usados ​​não-esteróides anti-inflamatórios incluem flunixin e carprofeno. </li><li> Opióides disponíveis podem incluir buprenorfina, morfina ou fentanil. </li><li> Consulte seu veterinário para a equipe do local doses adequadas e vias de administração. </li></ol></li><li> Com a cirurgia realizada adequadamente, os antibióticos não são geralmente necessários, com exceção de algumas cirurgias de alto risco gastrointestinal. <ol><li> Se os antibióticos são usados, fornecer peri-operatório (antes da primeira incisão). </li><li> Consulte seu veterinário para a equipe do local antibióticos apropriados, dosagens e vias de administração. </li></ol></li></ol></li><li> Preparação cirúrgica do local da incisão <ol><li> Raspar o local da incisão. Geralmente raspar uma área de aproximadamente 3 vezes o tamanho da incisão proposta. O tamanho da área raspada e preparada pode ser limitado pelo tamanho do animal ou na área animal. </li><li> A área depilada é desinfectados com múltiplas aplicações de solução matagal cirúrgicas e álcool isopropílico. Aplicação é tipicamente matagal cirúrgica primeiro, depois o álcool. Terminar com uma aplicação final de solução matagal. </li><li> Esfregando cirúrgico é realizado em um padrão circular, começando no centro e em espiral para fora, ou em animais de pequeno porte, de forma unidirecional. <ol><li> Se esfregar unidirecionalmente, coloque gaze esterilizada na margem crainial da área raspada, cobrindo o cabelo do animal. Segure e estabilizar o animal delicadamente através da gaze estéril. Aplicar solução de álcool e esfregue unidirecionalmente longe da gaze estéril. </li></ol></li></ol></li><li> Mover o animal para a área cirúrgica <ol><li> Mover o animal com o local preparado cirúrgica para cima, e sem contato com o local preparado. </li><li> A posição do animal na área cirúrgica para o local da cirurgia é para cima, de frente para o cirurgião. </li></ol></li><li> Draping o animal <ol><li> Se o animal é coberto pelo assistente, o assistente deve se lembrar que a superfície exterior da cortina é considerado parte do campo estéril e não deve ser tratado pelo assistente. Draping é muitas vezes deixada para o cirurgião, e armar é incluído no pacote cirúrgico. </li><li> A cortina de papel padrão à prova de água disponível é geralmente recomendado. </li></ol></li></ol> 6. Preparar o cirurgião para a cirurgia <ol><li> Preparação do cirurgião deve enfatizar que uma atividade especial terá lugar, no qual o cirurgião deve estar ciente de todos os seus movimentos dentro e fora do campo estéril. </li><li> O cabelo eo rosto são geralmente cobertos por um gorro e máscara, respectivamente. Estes devem ser novo no início da sessão cirúrgica, mas não precisam ser alteradas entre os animais. </li><li> Cirurgiões devem usar um vestido cirúrgica descartável, jaleco descartável e limpa ou, pelo menos um jaleco limpo. Este não precisa ser alterada entre animais, mas deve ser alterado entre as sessões de cirurgia. </li><li> As mãos devem ser bem limpos antes da cirurgia. Luvas cirúrgicas e luvas de exame deve ser usado. Se as luvas de exame são utilizados, eles devem ser lavadas com desinfetante cirúrgico antes de ser usado. As luvas devem ser mudadas entre os animais. </li></ol> 7. Durante a cirurgia <ol><li> Manutenção do campo estéril. <ol><li> Uma vez que suas mãos são estéreis eo campo operacional é estéril, você terá que se mover com cuidado e lembre-se para não quebrar a esterilidade. Esta inclusãodes ter um campo estéril na qual você pode estabelecidos instrumentos, lembrando para não arranhar seu nariz, e só entregando o paciente cirúrgico através da cortina estéril. </li></ol></li><li> Manipulação de tecidos <ol><li> Lidar com tecidos delicadamente. Mantenha tecidos úmidos, especialmente se a cirurgia for prolongada. Minimizar a criação de bolsas de tecido e dissecção desnecessária. </li><li> Manuseio adequado dos tecidos reduz oportunidade e risco de infecções pós-operatório, a cura velocidades, e reduz a dor pós-operatória. </li></ol></li><li> Repor os líquidos perdidos <ol><li> As rotas usuais de administração de fluidos em roedores são subcutânea ou intraperitoneal. Use pequenas quantidades de animais por via intraperitoneal-1-2 ml para pequenos ratos, por exemplo. </li><li> Líquidos aquecidos podem ajudar a evitar uma queda na temperatura do corpo. Mouse e temperatura corporal de ratos é maior do que os seres humanos, de modo fluidos devem ser mais quentes. </li></ol></li><li> Manter o calor <ol><li> Colocação de uma almofada de aquecimento abaixo do animal durante a cirurgia e da gaiola durante a recuperação é uma maneira padrão para manter a temperatura corporal de um animal. <ol><li> Cuidado com almofadas de aquecimento de usar apenas aqueles que estão marcados para a cirurgia. Outros podem induzir lesão térmica. </li></ol></li><li> Líquidos aquecidos, por via intraperitoneal dado, também pode ajudar os animais quente. </li></ol></li><li> Operacional microscópio pode facilitar alguns procedimentos (cirurgia microvascular, os cirurgiões mais velhos, etc, podem também ser alcançados através do uso de lentes de aumento, como lupas, etc) </li></ol> 8. Pós-operatório Considerações sobre recuperação <ol><li> Animais deve se recuperar em uma cama de papel plana (toalhas de papel estéreis, etc) ao invés de cama criação padrão animal. </li><li> Manter o animal aquecido. Calor vai ajudar na recuperação rápida. Isso é muitas vezes acompanhada da colocação da gaiola de recuperação metade em uma almofada de aquecimento, para que os animais podem escolher a sua temperatura preferida como recuperar. </li><li> Não retornam animais ou gaiolas para a área de animais exploração até que todos os animais aparecem normal. Qualquer animal que teve a cirurgia deve ter recuperado a capacidade de direito próprio na gaiola e ser capaz de mover-se normalmente antes de ser devolvido para a área de exploração. </li><li> Monitorar os animais no pós-operatório para os sinais inesperados de doença ou infecção. Animais geralmente perdem uma pequena quantidade de peso após a cirurgia, mas com analgesia adequada e fornecimento de alimentos, eles devem recuperar o peso rapidamente. </li></ol> 9. Pós-operatório de monitoramento é a parte final da cirurgia bem sucedida <ol><li> Por cinco a sete dias após a cirurgia, monitorar a condição geral do animal. <ol><li> Pós-operatório, os animais devem ser brilhante, alerta e ativo. Eles devem estar interagindo normalmente com cagemates, comendo e bebendo, e capaz de atingir normais espécie-específicos posturas. </li><li> Animais que estão deprimidas, anorexígenos, ou lento deve ser examinado quanto à causa dessa mudança. Considere a possibilidade de dor não tratada ou infecção. </li></ol></li><li> Alimentos / hídrica também é importante para a recuperação. <ol><li> Haverá alguma queda no consumo após a cirurgia. Isto pode ser mitigado fazendo comida e água mais fácil acesso. <ol><li> Tubos mais sipper pode ser útil. </li><li> Fornecimento diário de comida molhada no fundo da gaiola também pode atrair animais para comer. </li></ol></li><li> Alguns analgésicos em ratos resultar em pica, então estar ciente de que os animais podem comer itens inadequados (como cama) a lesões. </li></ol></li><li> Monitor de animais para sinais de infecção na incisão. O período de perigo é os primeiros 7 dias e os animais devem ser verificadas diariamente. <ol><li> Sinais de infecção incluem vermelhidão, inchaço, secreção (purulenta ou serosa), dor, ou a abertura da incisão (deiscência). </li></ol></li></ol> 10. Após sua cirurgia for concluída, o passo final é avaliar o sucesso de sua cirurgia <ol><li> Foi o modelo induzido parte / removido / funcionalidade restaurado? </li><li> Estava lá como pequena dor possível? </li><li> Não houve infecção? </li><li> Sucesso! </li></ol>

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American College of Laboratory Animal Medicine Position on Rodent Surgery. , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Welfare, 9 CFR, Parts 1, 2, and 3. , .</li><li>Bradfield, J. F., Schachtman, T. R., McLaughlin, R. M., Steffen, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+physiologic+effects+of+inapparent+wound+infection+in+rats.">Behavioral and physiologic effects of inapparent wound infection in rats.</a> Lab Anim Sci. 42, 572-578 (1992).</li><li>Brown, M. J., Pearson, P. T., Tomson, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+animal+surgery+in+research+and+teaching.+AVMA+Panel+on+Animal+Surgery+in+Research+and+Teaching,+and+the+ASLAP+(American+Society+of+Laboratory+Animal+Practitioners).">Guidelines for animal surgery in research and teaching. AVMA Panel on Animal Surgery in Research and Teaching, and the ASLAP (American Society of Laboratory Animal Practitioners).</a> Am J Vet Res. 54, 1544-1559 (1993).</li><li>Brown, P. A., Hoogstraten-Miller, S., Reuter, J. D., Suckow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Aseptic+Rodent+Survival+Surgery:+Parts+I+&#38;+2.">Principles of Aseptic Rodent Survival Surgery: Parts I &#38; 2.</a> Laboratory Animal Medicine and Management. , (2004).</li><li>Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 556-570 (1996).</li><li>Popp, M. B., Brennan, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+vascular+access+in+the+rat:+importance+of+asepsis.">Long-term vascular access in the rat: importance of asepsis.</a> Am J Physiol. 241, H606-H612 (1981).</li><li>Rutala, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APIC+guideline+for+selection+and+use+of+disinfectants.">APIC guideline for selection and use of disinfectants.</a> Am J Infect Control. 24, 313-342 (1996).</li></ol>

Todos os autores trabalham para Charles River, um grande fornecedor de animais cirurgicamente alterado para a pesquisa.

Cirurgia experimental em roedores raramente é realizada por veterinários ou médicos. Em vez disso, é freqüentemente realizada por pesquisadores da área biomédica com pouco ou nenhum treinamento formal nos princípios da cirurgia e técnica asséptica. Em um ambiente de pesquisa, a cirurgia é normalmente aprendemos com os colegas, se geralmente não formalmente treinados também. Cirurgia realizada no laboratório de pesquisa também pode ser visto principalmente como um método de preparação de um modelo animal com o objetivo de gerar um conjunto de animais para um estudo. Enquanto toda a cirurgia particular, é geralmente uma questão de coordenação olho-mão e habilidade técnica, sendo que ambos podem ser adquiridos através da prática, princípios e habilidades associadas com o conceito de técnica asséptica (e, portanto, a cirurgia sem infecção) não pode ser adquirido exclusivamente através da prática e muitas vezes não são plenamente transmitidas para os pesquisadores. A ausência de treinamento formal em princípios cirúrgicos podem levar a uma falta de compreensão do significado igual de ambos cirurgia tecnicamente correcta e cuidados pré e pós-operatória dos animais. Consideração de ambos a cirurgia em si e no cuidado peri-operatório de animais resultará em um aumento no bem-estar animal ea qualidade dos dados obtidos a partir do modelo cirúrgico. Por exemplo, a infecção pós-cirúrgica subclínicas podem confundir os resultados, como podem as mudanças no comportamento e fisiologia visto com dor. Como espécies de presas, a maioria dos roedores são surpreendentemente estóica e, embora sofrendo de dor pós-operatória ou infecção podem mostrar poucos sinais clínicos. Os sinais sutis de dor ou angústia em roedores são ainda mais obscurecido por uma falta geral de formação de pesquisadores biomédicos em reconhecimento desses sinais em roedores. Além disso, os roedores são mais ativos durante o ciclo escuro, quando o pessoal geralmente não estão disponíveis para ver os sinais clínicos e comportamentais de dor após a cirurgia. Este vídeo não substitui a formação cirúrgica adequada, que seria idealmente ambos os hands-on e é fornecido por sua instituição, mas é projetado para dar aos pesquisadores uma visão geral das preocupações comuns e demonstração visual da aceitas assepsia e técnicas necessárias para desenvolver uma competência mínima no desempenho da cirurgia de sobrevivência em roedores.

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Erratum: Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.

principles of rodent surgery for the new surgeon

Por razões de bem-estar tanto científico e animal, a formação em conceitos básicos e técnicas cirúrgicos devem ser realizados antes mesmo de tentar realizar a cirurgia em um roedor. Estudantes, pós-doutorado acadêmicos e outros interessados ​​em realizar a cirurgia em roedores como parte de um protocolo de pesquisa pode não ter tido treinamento cirúrgico formal como parte de seu curso exigido. Cirurgia em si é uma habilidade técnica, e que irá melhorar com a prática. Os princípios da técnica asséptica, no entanto, muitas vezes permanecem inexplicados ou ignorantes. Para a maioria dos novos cirurgiões, esta informação vital é apresentado em forma fragmentada ou aprendido no trabalho, nenhum dos quais é o ideal. Pode também tornar o aprendizado como realizar uma cirurgia em particular difícil, como o cirurgião está aprendendo novas tanto uma técnica cirúrgica e os princípios de assepsia, ao mesmo tempo. Este artigo resume e faz recomendações para habilidades básicas e técnicas cirúrgicos necessários para a cirurgia de roedores bem sucedida. Este artigo é projetado para complementar treinamento hands-on por instituição do usuário.

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Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

Antes de tentar a cirurgia, um cirurgião novo deve ter uma formação básica em técnicas cirúrgicas e conceitos. Este artigo apresenta considerações básicas cirúrgica com ênfase em roedores.

Princípios de Cirurgia de roedores para o Cirurgião Nova

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

principles-of-rodent-surgery-for-the-new-surgeon

Research

JoVE Journal

Biology

112.0K visualizações.  Research Models and Services. Antes de tentar a cirurgia, um cirurgião novo deve ter uma formação básica em técnicas cirúrgicas e conceitos. Este artigo apresenta considerações básicas cirúrgica com ênfase em roedores.

Vídeo: Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson gives a concise overview of Parkinsons's disease, its causes, therapeutic strategies, and advances in Parkinson's research.

Ole Isacson: desenvolvimento de novas terapias para a doença de Parkinson

Biologia

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

Princípios do site-specific Recombinase (SSR) Tecnologia

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

Suportados Bicamadas Planar para a Formação do Estudo da Sinapses imunológicas e Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

Modificado Sistema Yeast-Two-Hybrid para identificar proteínas Interagindo com o Fator de Crescimento progranulina

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Usando RNA mediada estratégia de alimentação Interferência em tela para genes envolvidos na regulação do tamanho corporal na Nemátodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

De alta capacidade Análise de Imagem de esferóides tumorais: uma aplicação de software de fácil utilização para medir o tamanho de esferóides automaticamente e com precisão

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roedor Trabalho Modelo do coração para o estudo do desempenho do miocárdio eo consumo de oxigênio

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Methods Article

Princípios de Cirurgia de roedores para o Cirurgião Nova