1. Antes de realizar la cirugía, tenga en cuenta que existen requisitos legales y éticos en el uso de animales en la investigación y la enseñanza <ol><li> Todos los procedimientos quirúrgicos deben ser aprobados por la autoridad local de ética o legal (IACUC o comité de ética o del Ministerio del Interior, etc.) </li><li> Asegúrese de que esta aprobación está en su lugar antes de comenzar. </li><li> Si hay alguna duda de la aprobación de la cirugía o la aprobación para el uso de los animales, no proceda. </li></ol> 2. Comprensión técnica aséptica <ol><li> La esterilidad como un concepto <ol><li> El objetivo de la técnica aséptica es reducir o eliminar en lo posible la carga bacteriana normal presente en el animal y en el medio ambiente antes de comenzar la cirugía. Esto significa que los instrumentos se esterilizan, la superficie de trabajo quirúrgico se desinfecta, y el animal y las manos del cirujano son desinfectados. </li><li> La cirugía, se realiza correctamente, no necesita antibióticos profilácticos o de cualquier otro tratamiento, que no sean el alivio del dolor. </li><li> Incluso con una técnica aséptica excelente, las bacterias procedentes de la materia quirúrgica todavía pueden introducirse en una herida hecha quirúrgicamente. Una técnica aséptica apropiada limita el riesgo de introducción de agentes infecciosos, principalmente bacterias, en los sitios quirúrgicos. </li></ol></li><li> Campo estéril <ol><li> El campo estéril abarca el área quirúrgica, el área preparada en el animal, y el frente del cirujano. </li></ol></li><li> Las interrupciones de la esterilidad <ol><li> Las interrupciones de la esterilidad se producen cuando el cirujano toca algo que está fuera del campo estéril. Esto puede ser la cara, una lámpara, un área de preparación de los animales, o un instrumento que no sea estéril. </li><li> Esta es la razón por la profilaxis con antibióticos se pueden utilizar. </li><li> Recuerde, una actividad especial se lleva a cabo. Estar tranquilo, reflexivo y preciso. </li></ol></li></ol> 3. Preparativos para la operación <ol><li> La cirugía de roedores no requiere un quirófano especializado. Idealmente, las cirugías deben realizarse en un área separada dentro de un laboratorio, tal como una campana o cabina de flujo laminar. En cualquier caso, la zona elegida debe ser ordenado y bien iluminado, y con el flujo de tráfico. Cirugías de los roedores a menudo se realizan en una mesa de trabajo de laboratorio. Antes de organizar el área quirúrgica, limpiar la mesa de trabajo y con un desinfectante. </li><li> Es útil para el cirujano tener un asistente. Este asistente puede ayudar con la anestesia, la preparación de los animales, y la recuperación de monitoreo. Esto permite al cirujano para que se preparen los animales mientras están preparados, lo que acorta el tiempo de los animales bajo anestesia general, y tal vez lo que permite más operaciones a realizar. </li><li> Organizar el área de la cirugía por lo que hay tres zonas distintas: la preparación, la cirugía y la recuperación. </li><li> Para el área de preparación, montaje de los suministros necesarios: <ol><li> Lubricantes pomada oftálmica </li><li> Tijeras o navaja </li><li> Gasa </li><li> Las soluciones quirúrgicas matorrales <ol><li> Las soluciones quirúrgicas matorrales comúnmente utilizados son los yodóforos o clorhexidina / </li><li> 70% de alcohol isopropílico también se utiliza como parte del lavado quirúrgico. </li></ol></li></ol></li><li> Para el área quirúrgica, montar y organizar los suministros necesarios. <ol><li> Fuente de calor para mantener caliente el roedor <ol><li> La fuente de calor ideal es una almohadilla de calentamiento de agua de recirculación. Almohadillas de calefacción eléctrica no son aceptables para la cirugía. Guantes quirúrgicos llena de agua tibia, o calentadores químicos mano también puede ser utilizado. Si cualquiera de estas dos últimas se utilizan, la temperatura del objeto deben ser cuidadosamente monitoreados durante la cirugía. </li></ol></li><li> Plataforma quirúrgica <ol><li> Esto puede ser una gasa estéril impermeable colocada sobre la fuente de calor. </li></ol></li><li> Materiales desechables <ol><li> Estas pueden incluir: paños quirúrgicos estériles, gasas, aplicadores de algodón, líquidos para la administración a los roedores, la solución de irrigación de los tejidos. </li></ol></li><li> Los instrumentos estériles <ol><li> El complemento de los instrumentos puede variar dependiendo de la cirugía, pero generalmente incluyen bisturíes, los retractores de tejidos, pinzas, pinzas hemostáticas y tijeras. </li><li> Instrumento de esterilización o esterilización de solución si los mismos instrumentos que se van a utilizar en más de un tema quirúrgico <ol><li> El uso de un esterilizador de cuentas en caliente para esterilizar los instrumentos entre los animales es común. </li></ol></li></ol></li><li> Material para cerrar la incisión quirúrgica. <ol><li> Los materiales utilizados dependerá del lugar de la cirugía y la aplicación, pero pueden incluir: sutura y agujas, grapas y un aplicador de grapas o adhesivo tisular </li></ol></li><li> Cualquier otro equipo especial que se necesita (aparato estereotáxico, implantes, microscopio quirúrgico) </li></ol></li></ol> 4. Preparación de los instrumentos para la cirugía <ol><li> Los instrumentos deben estar limpias yestéril en el inicio de la cirugía. Esto se logra a menudo mediante la creación de completos paquetes quirúrgicos que se esterilizan en autoclave. </li><li> Los instrumentos pueden ser utilizados para la cirugía de roedores más de uno sin autoclave y reempaque, sino que debe ser limpiado y esterilizado entre los roedores. <ol><li> Si un esterilizador de cuentas en caliente se utiliza, asegúrese de dejar tiempo para que los instrumentos que se enfríe después de la esterilización. Instrumentos se pueden enfriar por inmersión en agua estéril. </li><li> Esterilizantes químicos también se pueden utilizar, pero requieren un tiempo de contacto (~ 10 minutos, podría ser de 30-60 minutos, requiere enjuague). El alcohol no es un esterilizante. </li></ol></li><li> Organizar los instrumentos de cortina a prueba de agua estéril con el fin de que se van a utilizar. </li></ol> 5. Preparación de los animales para la cirugía <ol><li> Las tres cosas que se administran antes de la cirugía son la anestesia, analgesia y antibióticos. <ol><li> Se necesita anestesia para la cirugía. Los anestésicos pueden ser administrados a través de la inhalación o la inyección. <ol><li> Anestésicos inhalados más comunes en uso actualmente isoflurano. </li><li> Inyectables más comunes que se utilizan anestésicos es una combinación de ketamina y xilazina, posiblemente con otro añadido sedante. </li><li> Consulte a su veterinario personal de la instalación de las dosis apropiadas. </li></ol></li><li> Preventivo se recomiendan analgésicos y debe ser administrada antes de comenzar la operación. <ol><li> De uso común no esteroides anti-inflamatorios incluyen flunixina y carprofeno. </li><li> Opioides disponibles pueden incluir la buprenorfina, morfina, fentanilo o. </li><li> Consulte a su veterinario personal de la instalación de las dosis apropiadas y vías de administración. </li></ol></li><li> Con la cirugía se realiza correctamente, los antibióticos no son necesarios por lo general, a excepción de algunas cirugías gastrointestinales de alto riesgo. <ol><li> Si se utilizan antibióticos, utilizados ofrecen peri-operatorio (antes de la primera incisión). </li><li> Consulte a su veterinario personal de la instalación de los antibióticos adecuados, dosis y vías de administración. </li></ol></li></ol></li><li> Preparación quirúrgica del sitio de la incisión <ol><li> Afeitar el sitio de la incisión. Por lo general afeitarse un área de aproximadamente 3 veces el tamaño de la incisión propuesta. El tamaño de la zona de afeitado y preparado puede ser limitado por el tamaño del animal o del área en el animal. </li><li> El área afeitada se desinfecta con múltiples aplicaciones de la solución de lavado quirúrgico y el alcohol isopropílico. Aplicación suele lavado quirúrgico primero, y luego alcohol. Terminar con una aplicación final de la solución de lavado. </li><li> Lavado quirúrgico se lleva a cabo en un patrón circular, comenzando en el centro y en espiral hacia el exterior, o en los animales más pequeños, de manera unidireccional. <ol><li> Si el lavado de forma unidireccional, coloque una gasa estéril en el margen crainial de la zona de afeitado, que cubre el pelo del animal. Captar y estabilizar al animal suavemente a través de la gasa estéril. Aplique una solución de alcohol y matorrales unidireccional lejos de la gasa estéril. </li></ol></li></ol></li><li> Mover al animal en el área quirúrgica <ol><li> Mover al animal con el sitio quirúrgico preparado hacia arriba, y sin ponerse en contacto con el área excavada. </li><li> La posición del animal en el área de la cirugía por lo que el lugar de la cirugía es hacia arriba, hacia el cirujano. </li></ol></li><li> Cubriendo el animal <ol><li> Si el animal está cubierta por el asistente, el asistente debe recordar que la superficie exterior de la cortina se considera parte de la zona estéril y no debe ser manejada por el asistente. Cubriendo a menudo se deja para el cirujano, y la caída está incluido en el paquete quirúrgico. </li><li> Un estándar de cortina a prueba de agua desechables de papel se recomienda generalmente. </li></ol></li></ol> 6. Preparación del cirujano para la cirugía <ol><li> Preparación del cirujano debe hacer hincapié en que una actividad especial se llevará a cabo, en la que el cirujano debe ser consciente de todos sus movimientos dentro y fuera del campo estéril. </li><li> El pelo y la cara son generalmente cubiertos por una tapa y una máscara, respectivamente. Estos deben ser nuevos en el inicio de la sesión quirúrgica, pero no es necesario cambiar entre los animales. </li><li> Los cirujanos deben usar una bata quirúrgica desechable, limpia bata desechable o por lo menos una bata limpia. Esto no es necesario cambiar entre los animales, sino que debe ser cambiado entre las sesiones de la cirugía. </li><li> Debe lavarse las manos antes de la cirugía. Guantes quirúrgicos o guantes de examen debe ser utilizado. Si se utilizan guantes de examen, se deben lavar con un desinfectante quirúrgico antes de ser utilizado. Deben cambiarse los guantes entre los animales. </li></ol> 7. Durante la cirugía <ol><li> Mantenimiento del campo estéril. <ol><li> Una vez que tus manos son estériles y el campo de operaciones es estéril, usted tendrá que moverse con cuidado y recordar que no debe romper la esterilidad. Esta inclusióndes con un campo estéril en la que se puede establecer los instrumentos, recordando que no rascarse la nariz, y sólo se entrega al paciente quirúrgico a través del campo estéril. </li></ol></li><li> Manejo de los tejidos <ol><li> Manejar los tejidos con suavidad. Mantener húmedos los tejidos, especialmente si la cirugía se prolonga. Minimizar la generación de bolsas de tejido y disección innecesarios. </li><li> La manipulación de tejidos adecuado reduce la oportunidad y el riesgo de infecciones postoperatorias, acelera la curación, y reduce el dolor post-operatorio. </li></ol></li><li> Reemplazar los líquidos perdidos <ol><li> Las rutas habituales de administración de líquidos en los roedores son subcutánea o intraperitoneal. El uso de pequeños volúmenes de pequeños animales por vía intraperitoneal-1-2 ml para los ratones, por ejemplo. </li><li> Líquidos calentados pueden ayudar a prevenir una caída en la temperatura corporal. Ratón y la temperatura corporal de ratas es superior a los seres humanos, por lo que los líquidos deben ser más cálido. </li></ol></li><li> Mantener el calor <ol><li> La colocación de una almohadilla eléctrica por debajo del animal durante la cirugía y la jaula durante la recuperación es una forma estándar para mantener la temperatura corporal de un animal. <ol><li> Cuidado con la calefacción almohadillas de usar sólo los que están marcados para la cirugía. Otros pueden provocar lesiones térmicas. </li></ol></li><li> Líquidos calentados, por vía intraperitoneal dado, también puede ayudar a los animales caliente. </li></ol></li><li> Funcionamiento del microscopio puede facilitar algunos procedimientos (cirugía microvascular, mayores cirujanos, etc también se puede lograr mediante el uso de lentes de aumento, como lupas, etc) </li></ol> 8. Post-operatorio Consideraciones sobre la recuperación <ol><li> Los animales deben recuperar en una cama plana de papel (toallas de papel estéril, etc) en lugar de ropa de cama estándar de la cría de animales. </li><li> Mantener al animal caliente. El calor va a ayudar en la recuperación rápida. Esto se logra a menudo mediante la colocación de la jaula de recuperación media de una almohadilla eléctrica para que los animales pueden elegir la temperatura que prefieran, ya que se recuperan. </li><li> No devolver los animales o las jaulas de los animales a la zona de explotación hasta que todos los animales parecen normales. Cualquier animal que se ha sometido a una cirugía debe haber recuperado la capacidad de derecho en sí mismo en la jaula y ser capaz de moverse con normalidad antes de ser devuelto a la zona de espera. </li><li> Observar a los animales después de la operación de signos inesperados de la enfermedad o infección. Animales en general se pierde una pequeña cantidad de peso después de la cirugía, pero con analgesia adecuada y la provisión de alimentos, se debe recuperar el peso rápidamente. </li></ol> 9. Post-operatorio El monitoreo es la parte final de la cirugía con éxito <ol><li> De cinco a siete días después de la cirugía, controlar el estado general del animal. <ol><li> Después de la cirugía, los animales deben ser brillante, alerta y activo. Deben estar en contacto normalmente con cagemates, comiendo y bebiendo, y capaz de lograr lo normal especie posturas. </li><li> Los animales que sufren de depresión, anorexia, o lento deben ser examinados en cuanto a la causa de este cambio. Considere la posibilidad de que el dolor no tratado o una infección. </li></ol></li><li> Alimentos / ingesta de líquidos es también importante para la recuperación. <ol><li> Puede haber algo de caída en el consumo después de la cirugía. Esto puede ser mitigado por la toma de alimentos y el agua de más fácil acceso. <ol><li> Tubos más largos pueden ser útiles para sorber. </li><li> Provisión diaria de comida mojada en la parte inferior de la caja también puede atraer a los animales para comer. </li></ol></li><li> Algunos analgésicos, en consecuencia las ratas en la pica, por lo que ser conscientes de que los animales pueden comer cosas inadecuadas (tales como ropa de cama) a una lesión. </li></ol></li><li> Observar a los animales para detectar signos de infección en la incisión. El período de peligro es de los primeros 7 días y los animales deberá ser comprobado diariamente. <ol><li> Señales de infección incluyen enrojecimiento, inflamación, secreción (pus o serosa), dolor, o la apertura de la incisión (dehiscencia). </li></ol></li></ol> 10. Después de la operación ha terminado, el paso final es evaluar el éxito de su cirugía <ol><li> Fue inducida por el modelo / pieza extraída / funcionalidad restaurado? </li><li> Estaba allí el menor dolor posible? </li><li> No hubo infección? </li><li> Éxito! </li></ol>

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Todos los autores el trabajo de Charles River, un importante proveedor de animales quirúrgicamente alterados para la investigación.

Cirugía experimental en roedores es rara vez se llevan a cabo por veterinarios o médicos. En su lugar, se realiza a menudo por los investigadores biomédicos con poca capacitación formal o no en los principios de la cirugía y la técnica aséptica. En un entorno de investigación, la cirugía suele ser aprendido de sus colegas, por lo general no se han recibido capacitación formal tampoco. La cirugía realizada en el laboratorio de investigación también puede ser visto principalmente como un método de preparación de un modelo animal con el objetivo de generar un conjunto de animales para el estudio. Aunque cualquier cirugía en particular suele ser una cuestión de la coordinación mano-ojo y la habilidad técnica, los cuales pueden ser adquiridos a través de la práctica, los principios y técnicas relacionados con el concepto de técnica aséptica (y por lo tanto la cirugía sin infección) no se puede adquirir únicamente a través de la práctica y con frecuencia no se transmite a los investigadores. La ausencia de educación formal en los principios quirúrgicos puede llevar a una falta de comprensión de la importancia de la igualdad tanto de la cirugía técnicamente correcta y la atención pre-y post-operatorio de los animales. Consideración tanto de la propia cirugía y el cuidado perioperatorio de los animales se traducirá en un aumento en el bienestar animal y la calidad de los datos obtenidos a partir del modelo quirúrgico. Por ejemplo, subclínica post-quirúrgica infección se puede confundir los resultados, así como los cambios en el comportamiento y la fisiología visto con dolor. Como las presas, la mayoría de los roedores son sorprendentemente estoico y, aunque sufren de dolor post-quirúrgico o una infección pueden mostrar pocos signos clínicos. Los sutiles signos de dolor o malestar en los roedores son más oscurecido por una falta general de formación de investigadores biomédicos en el reconocimiento de estos signos en los roedores. Además, los roedores son más activos durante el ciclo de oscuridad, cuando el personal generalmente no están disponibles para ver los signos clínicos y conductuales del dolor tras la cirugía. Este video no es un sustituto para el entrenamiento quirúrgico adecuado, lo que lo ideal sería a la vez práctico y proporcionado por la institución, pero está diseñado para dar a los investigadores una visión general de las preocupaciones comunes y la demostración visual de aceptar los procedimientos asépticos y las técnicas necesarias para desarrollar una competencia mínima en el desempeño de la cirugía de la supervivencia en los roedores.

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principles of rodent surgery for the new surgeon

Por razones de bienestar tanto científicos como de los animales, la formación en los conceptos básicos y técnicas quirúrgicas deben ser realizadas antes en busca siempre de realizar la cirugía en un roedor. Estudiantes, académicos post-doctorado, y otras personas interesadas en la realización de una cirugía en roedores como parte de un protocolo de investigación no han tenido entrenamiento quirúrgico formal como parte de sus cursos requeridos. La cirugía en sí es una habilidad técnica, y que mejorará con la práctica. Los principios de la técnica aséptica, sin embargo, a menudo permanecen sin explicación o ignorantes. Para la mayoría de los nuevos cirujanos, esta información vital se presenta en un modo poco sistemático o aprendido en el trabajo, ninguno de los cuales es ideal. También puede hacer que el aprendizaje de cómo realizar una cirugía en particular difícil, ya que el nuevo cirujano está aprendiendo tanto de una técnica quirúrgica y los principios de asepsia, al mismo tiempo. Este artículo resume y hace recomendaciones para técnicas quirúrgicas básicas y las técnicas necesarias para la cirugía de roedores éxito. Este artículo está diseñado para complementar la formación práctica por la entidad del usuario.

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Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

Antes de intentar la cirugía, un nuevo cirujano debería tener una formación básica en las técnicas quirúrgicas y los conceptos. Este artículo presenta consideraciones básicas quirúrgica con énfasis en los roedores.

Principios de la cirugía de roedores para el cirujano de Nueva

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

112.1K vistas.  Research Models and Services. Antes de intentar la cirugía, un nuevo cirujano debería tener una formación básica en las técnicas quirúrgicas y los conceptos. Este artículo presenta consideraciones básicas quirúrgica con énfasis en los roedores.

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Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson gives a concise overview of Parkinsons's disease, its causes, therapeutic strategies, and advances in Parkinson's research.

Ole Isacson: desarrollo de nuevas terapias para la enfermedad de Parkinson

Investigación

Biología

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

Principios de la recombinasa específica de sitio (RSS) Tecnología

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

El método de cultivo de embriones de roedores enteros utilizando el sistema de tipo de botella rotador Cultura

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

Modificado levadura sistema híbrido de dos para identificar proteínas que interactúan con el factor de crecimiento progranulina

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

El uso de quimiostatos en Microbiana Biología de Sistemas

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

De alto rendimiento de imagen Análisis de esferoides tumorales: una aplicación de software fácil de usar para medir el tamaño de esferoides forma automática y precisa

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

La formación de imágenes reorganización espacial de una vía de señalización MAPK Usando el sistema de expresión transitoria del Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Roedor de Trabajo Modelo del corazón para el estudio sobre los resultados de miocardio y el consumo de oxígeno

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...