1. Avant de pratiquer la chirurgie, sachez qu&#39;il ya des exigences légales et éthiques autour de l&#39;utilisation des animaux en recherche et en enseignement <ol><li> Toutes les interventions chirurgicales doivent être approuvés par l&#39;autorité locale éthiques ou juridiques (IACUC ou comité d&#39;éthique ou le bureau d&#39;accueil, etc.) </li><li> Assurez-vous que cette approbation est en place avant de commencer. </li><li> S&#39;il ya une question de l&#39;approbation pour une chirurgie ou d&#39;approbation pour l&#39;utilisation des animaux, ne continuez pas. </li></ol> 2. Comprendre les règles d&#39;asepsie <ol><li> Stérilité comme un concept <ol><li> L&#39;objectif de la technique aseptique est de réduire ou d&#39;éliminer autant que possible la charge normale bactériennes présentes sur l&#39;animal et l&#39;environnement avant le début de la chirurgie. Cela signifie que les instruments sont stérilisés, la surface de travail chirurgical est désinfectée, et l&#39;animal et les mains du chirurgien sont désinfectés. </li><li> La chirurgie, réalisée correctement, n&#39;a pas besoin d&#39;antibiotiques à titre prophylactique ou tout autres traitements, autres que le soulagement de douleur. </li><li> Même avec une excellente technique aseptique, les bactéries provenant de la réserve chirurgicale peut encore être introduite dans une plaie chirurgicalement créé. Technique aseptique appropriée limite le risque d&#39;introduction d&#39;agents infectieux, principalement des bactéries, dans des sites chirurgicaux. </li></ol></li><li> Champ stérile <ol><li> Le champ stérile englobe la zone chirurgicale, la zone préparée sur l&#39;animal, et le front du chirurgien. </li></ol></li><li> Ruptures dans la stérilité <ol><li> Ruptures dans la stérilité se produire lorsque le chirurgien touche quelque chose en dehors du champ stérile. C&#39;est peut-être son visage, un luminaire, un espace dépourvu de l&#39;animal, ou un instrument non-stérile. </li><li> C&#39;est la raison antibiotiques prophylactiques peuvent être utilisés. </li><li> Rappelez-vous, une activité spéciale se déroule. Soyez calme, réfléchi et précis. </li></ol></li></ol> 3. Préparation pour la chirurgie <ol><li> La chirurgie des rongeurs ne nécessite pas une suite dédiée chirurgicale. Idéalement, les cabinets doivent être menées dans une zone séparée dans un laboratoire, comme un capuchon ou hotte à flux laminaire. Peu importe, la zone choisie doit être bien rangé, bien éclairé, et hors de la circulation. Chirurgies rongeurs sont souvent menées sur une paillasse de laboratoire. Avant de faire de la zone chirurgicale, nettoyer la paillasse bien avec un désinfectant. </li><li> Il est utile pour le chirurgien d&#39;avoir un assistant. Cet assistant peut aider à l&#39;anesthésie, la préparation des animaux, et suivi du recouvrement. Cela permet au chirurgien de se préparer alors que les animaux sont préparés, raccourcissant ainsi le temps de l&#39;animal sous anesthésie, et peut-être permettant plus de chirurgies à effectuer. </li><li> Disposer de la zone chirurgicale afin qu&#39;il existe trois zones distinctes: la préparation, la chirurgie et la récupération. </li><li> Pour la zone de préparation, d&#39;assembler les fournitures nécessaires: <ol><li> Pommade ophtalmique lubrifiante </li><li> Tondeuses ou rasoirs </li><li> Gaze </li><li> Lavage chirurgical des solutions <ol><li> Lavage chirurgical des solutions couramment utilisés sont les iodophores ou chlorhexidine / </li><li> 70% d&#39;alcool isopropylique est également utilisé dans le cadre du lavage chirurgical. </li></ol></li></ol></li><li> Pour la zone chirurgicale, d&#39;assembler et d&#39;organiser les fournitures nécessaires. <ol><li> Source de chaleur pour garder au chaud le rongeur <ol><li> La source de chaleur idéale est un tampon de recirculation d&#39;eau de chauffage. Coussins chauffants électriques ne sont pas acceptables pour la chirurgie. Les gants chirurgicaux rempli d&#39;eau chaude, ou chauffe-mains chimiques peuvent également être utilisés. Si l&#39;une de ces deux derniers sont utilisés, la température de l&#39;objet doit être soigneusement contrôlée pendant la chirurgie. </li></ol></li><li> Plate-forme de chirurgie <ol><li> Cela peut être une compresse stérile étanche placé au-dessus de la source de chaleur. </li></ol></li><li> Fournitures jetables <ol><li> Ceux-ci peuvent inclure: les draps chirurgicaux stériles, de la gaze, des applicateurs de coton, de fluides pour l&#39;administration à le rongeur, solution d&#39;irrigation des tissus. </li></ol></li><li> Instruments stériles <ol><li> Le complément d&#39;instruments varient en fonction de la chirurgie, mais comprennent généralement des bistouris, des écarteurs tissus, pinces, pinces hémostatiques et ciseaux. </li><li> Stérilisateur à l&#39;instrument ou de la stérilisation solution si les mêmes instruments sont utilisés sur plus d&#39;un sujet de chirurgie <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un stérilisateur à billes chaude pour stériliser les instruments entre les animaux est courante. </li></ol></li></ol></li><li> Matériel pour fermer l&#39;incision chirurgicale. <ol><li> Les matériaux utilisés dépendront du site opératoire et de l&#39;application, mais peuvent inclure: suture et d&#39;aiguilles, des agrafes et un applicateur de base, ou de la colle tissulaire </li></ol></li><li> Tout autre équipement spécial nécessaire (appareil de stéréotaxie, les implants, microscope opératoire) </li></ol></li></ol> 4. Préparer les instruments pour la chirurgie <ol><li> Les instruments doivent être propres etstérile au début de l&#39;intervention. Ceci est souvent accompli par la création de packs complets de chirurgie qui sont autoclavées. </li><li> Les instruments peuvent être utilisés pendant plus d&#39;une chirurgie de rongeurs, sans autoclavage et le remballage, mais devrait être nettoyé et stérilisé entre les rongeurs. <ol><li> Si un stérilisateur à chaud billes est utilisé, assurez-vous de laisser du temps pour les instruments à refroidir après stérilisation. Les instruments peuvent être refroidi par trempage dans de l&#39;eau stérile. </li><li> Stérilisants chimiques peuvent aussi être utilisés, mais ils nécessitent un temps de contact plus long (~ 10 minutes-peut être 30-60 minutes, nécessite un rinçage). L&#39;alcool n&#39;est pas un agent stérilisant. </li></ol></li><li> Disposer d&#39;instruments sur le drapé étanche stérile dans l&#39;ordre dans lequel elles seront utilisées. </li></ol> 5. Préparer l&#39;animal pour la chirurgie <ol><li> Les trois choses qui sont administrés avant la chirurgie sont l&#39;anesthésie, l&#39;analgésie, et des antibiotiques. <ol><li> L&#39;anesthésie est nécessaire pour la chirurgie. Anesthésiques peuvent être administrés par inhalation ou par injection. <ol><li> Anesthésiques inhalés les plus couramment utilisés actuellement l&#39;isoflurane. </li><li> La plupart des communes anesthésique injectable utilisé est une combinaison de kétamine et de xylazine, éventuellement avec un autre sédatif ajouté. </li><li> Consultez votre vétérinaire personnel de l&#39;établissement pour des dosages appropriés. </li></ol></li><li> Préemptive analgésiques sont recommandés et doivent être administrés avant la chirurgie commence. <ol><li> Communément utilisé non-stéroïdiens anti-inflammatoires comprennent flunixine et carprofène. </li><li> Opioïdes disponibles peuvent inclure la buprénorphine, la morphine ou le fentanyl. </li><li> Consultez votre vétérinaire personnel de l&#39;établissement pour des dosages appropriés et les voies d&#39;administration. </li></ol></li><li> Avec la chirurgie est bien menée, les antibiotiques ne sont généralement pas nécessaires, sauf pour certaines chirurgies à haut risque gastro-intestinal. <ol><li> Si les antibiotiques sont utilisés, utilisées fournissent en péri-opératoire (avant la première incision). </li><li> Consultez votre vétérinaire pour le personnel des établissements d&#39;antibiotiques appropriés, les posologies et voies d&#39;administration. </li></ol></li></ol></li><li> La préparation chirurgicale de l&#39;incision <ol><li> Rasez le site d&#39;incision. Généralement raser une zone d&#39;environ 3 fois la taille de l&#39;incision proposée. La taille de la zone rasée et préparée peut être limitée par la taille de l&#39;animal ou de la zone sur l&#39;animal. </li><li> La zone rasée est désinfectée à l&#39;aide de multiples applications de la solution de lavage chirurgical et d&#39;alcool isopropylique. L&#39;application est généralement lavage chirurgical d&#39;abord, puis l&#39;alcool. Terminez par une application finale de la solution de gommage. </li><li> Récurer chirurgicale est effectuée dans un mouvement circulaire, en commençant au centre et en spirale vers l&#39;extérieur, ou sur des animaux plus petits, d&#39;une manière unidirectionnelle. <ol><li> Si frotter unidirectionnelle, placer une gaze stérile à la marge crainial de la zone rasée, qui couvre les cheveux de l&#39;animal. Saisir et stabiliser l&#39;animal doucement à travers la gaze stérile. Appliquer gommage solution et l&#39;alcool unidirectionnellement loin de la gaze stérile. </li></ol></li></ol></li><li> Déplacement à l&#39;animal de la zone chirurgicale <ol><li> Déplacez l&#39;animal avec le site préparé chirurgicale à la hausse, et sans contact avec le site préparé. </li><li> Position de l&#39;animal sur la zone chirurgicale de sorte que le site chirurgical est à la hausse, face au chirurgien. </li></ol></li><li> Drapage l&#39;animal <ol><li> Si l&#39;animal est drapée par l&#39;assistant, l&#39;assistant doit se rappeler que la surface extérieure du drapé est considéré comme une partie du champ stérile et ne doivent pas être manipulés par l&#39;assistant. Drapage est souvent laissé au chirurgien, et le drapé est inclus dans le pack chirurgicale. </li><li> Une norme drapé imperméables jetables en papier est généralement recommandée. </li></ol></li></ol> 6. Préparation du chirurgien pour la chirurgie <ol><li> Préparation du chirurgien doit souligner que d&#39;une activité spéciale aura lieu, celui dans lequel le chirurgien doit être conscient de chacun de leurs mouvements dans et hors du champ stérile. </li><li> Les cheveux et le visage sont généralement couverts par un chapeau et un masque, respectivement. Ces nouvelles devraient être au début de la session chirurgicale, mais n&#39;ont pas besoin d&#39;être changé entre les animaux. </li><li> Les chirurgiens doivent porter une blouse chirurgicale jetable, propre blouse jetable ou tout au moins un sarrau propre. Ceci n&#39;a pas besoin d&#39;être changé entre les animaux, mais doit être changé entre les sessions chirurgie. </li><li> Les mains doivent être bien nettoyés avant la chirurgie. Les gants chirurgicaux ou de gants d&#39;examen doit être utilisé. Si des gants d&#39;examen sont utilisés, ils doivent être lavés avec un désinfectant chirurgicale avant d&#39;être utilisés. Les gants doivent être changés entre les animaux. </li></ol> 7. Pendant la chirurgie <ol><li> Entretien du champ stérile. <ol><li> Une fois que vos mains sont stériles et le champ opératoire est stérile, vous aurez soin de se déplacer et se rappeler de ne pas briser la stérilité. Cette includes ayant un champ stérile sur lequel vous pouvez déposer les instruments, en se rappelant de ne pas vous gratter le nez, et seulement la remise au patient de chirurgie à travers le champ stérile. </li></ol></li><li> La manipulation des tissus <ol><li> Manipuler les tissus en douceur. Gardez tissus humides, surtout si la chirurgie est prolongée. Minimiser la création de poches de tissu et la dissection inutile. </li><li> Une bonne manipulation des tissus réduit opportunité et les risques d&#39;infections post-opératoires, accélère la guérison, et réduit la douleur post-opératoire. </li></ol></li><li> Remplacer les liquides perdus <ol><li> Les voies habituelles de l&#39;administration de liquide chez les rongeurs sont sous-cutanée ou intrapéritonéale. Utilisez de petites quantités d&#39;animaux par voie intrapéritonéale-1-2 ml petite pour les souris, par exemple. </li><li> Réchauffé fluides peut aider à prévenir une baisse de la température du corps. Souris et la température corporelle du rat est plus élevé que les êtres humains, donc les fluides doivent être chauds. </li></ol></li><li> Maintenir la chaleur <ol><li> Placement d&#39;un coussin chauffant dessous de l&#39;animal pendant la chirurgie et la cage lors de la récupération est un moyen standard pour maintenir la température corporelle d&#39;un animal. <ol><li> Attention avec coussins chauffants utiliser seulement ceux marqués pour la chirurgie. D&#39;autres peuvent provoquer des lésions thermiques. </li></ol></li><li> Liquides réchauffés, intrapéritonéale, peut également aider les animaux au chaud. </li></ol></li><li> Microscope opératoire-peut faciliter certaines procédures (chirurgie microvasculaire, plus les chirurgiens, etc Peut également être obtenue par l&#39;utilisation des loupes comme des loupes, etc) </li></ol> 8. Considérations de récupération post-opératoire <ol><li> Les animaux doivent récupérer sur une literie de papier à plat (serviettes en papier stérile, etc) plutôt que la norme la literie de l&#39;élevage. </li><li> Gardez l&#39;animal au chaud. Chaleur contribuera à un prompt rétablissement. Ceci est souvent accompli en plaçant la cage de récupération demi-sur un coussin chauffant afin que les animaux peuvent choisir leur température préférée en tant qu&#39;ils se rétablissent. </li><li> Ne renvoyez pas les animaux ou les cages des animaux à la zone de détention jusqu&#39;à ce que tous les animaux semblent normales. Tout animal qui a subi une intervention chirurgicale doit avoir retrouvé la capacité à se redresser dans la cage et être capable de se déplacer normalement, avant d&#39;être retourné à l&#39;aire d&#39;attente. </li><li> Surveiller les animaux en post-opératoire des signes inattendus de maladie ou d&#39;infection. Les animaux perdent généralement une petite quantité de poids après la chirurgie, mais avec l&#39;analgésie appropriée et la fourniture de nourriture, ils doivent reprendre le poids rapidement. </li></ol> 9. Surveillance post-opératoire est la partie finale de la chirurgie réussie <ol><li> Pour cinq à sept jours après la chirurgie, de surveiller l&#39;état général de l&#39;animal. <ol><li> En postopératoire, les animaux doivent être vif, alerte et actif. Ils doivent être en interaction avec les cagemates normalement, manger et boire, et capable d&#39;atteindre la normale spécifiques à l&#39;espèce des postures. </li><li> Les animaux qui sont déprimés, anorexiques, ou léthargique devraient être examinés quant à la cause de ce changement. Envisager la possibilité d&#39;une douleur non traitée ou une infection. </li></ol></li><li> Alimentation / fluide d&#39;admission est également important de récupération. <ol><li> Il y aura une certaine baisse de la consommation hors-après la chirurgie. Ceci peut être atténué par rendre la nourriture et l&#39;eau facile d&#39;accès. <ol><li> Tubes sipper plus longue pourrait être utile. </li><li> La prestation quotidienne de nourriture humide dans le fond de la cage peut également inciter les animaux à manger. </li></ol></li><li> Certains analgésiques dans le résultat des rats dans le pica, donc être conscients que les animaux peuvent manger les articles inappropriés (tels que la literie) à des blessures. </li></ol></li><li> Surveiller les animaux pour des signes d&#39;infection à l&#39;incision. La période de danger est les 7 premiers jours et les animaux doivent être contrôlés quotidiennement. <ol><li> Les signes d&#39;infection sont la rougeur, enflure, écoulement (purulent ou séreux), la douleur, ou l&#39;ouverture de l&#39;incision (déhiscence). </li></ol></li></ol> 10. Après votre chirurgie est terminée, l&#39;étape finale consiste à évaluer le succès de votre chirurgie <ol><li> Était le modèle induit / pièce retirée / fonctionnalité rétablie? </li><li> Y avait-il tant de douleur possible? </li><li> Y avait-il pas d&#39;infection? </li><li> Succès! </li></ol>

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> American College of Laboratory Animal Medicine Position on Rodent Surgery. , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal Welfare, 9 CFR, Parts 1, 2, and 3. , .</li><li>Bradfield, J. F., Schachtman, T. R., McLaughlin, R. M., Steffen, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+physiologic+effects+of+inapparent+wound+infection+in+rats.">Behavioral and physiologic effects of inapparent wound infection in rats.</a> Lab Anim Sci. 42, 572-578 (1992).</li><li>Brown, M. J., Pearson, P. T., Tomson, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+animal+surgery+in+research+and+teaching.+AVMA+Panel+on+Animal+Surgery+in+Research+and+Teaching,+and+the+ASLAP+(American+Society+of+Laboratory+Animal+Practitioners).">Guidelines for animal surgery in research and teaching. AVMA Panel on Animal Surgery in Research and Teaching, and the ASLAP (American Society of Laboratory Animal Practitioners).</a> Am J Vet Res. 54, 1544-1559 (1993).</li><li>Brown, P. A., Hoogstraten-Miller, S., Reuter, J. D., Suckow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Aseptic+Rodent+Survival+Surgery:+Parts+I+&#38;+2.">Principles of Aseptic Rodent Survival Surgery: Parts I &#38; 2.</a> Laboratory Animal Medicine and Management. , (2004).</li><li>Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 556-570 (1996).</li><li>Popp, M. B., Brennan, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+vascular+access+in+the+rat:+importance+of+asepsis.">Long-term vascular access in the rat: importance of asepsis.</a> Am J Physiol. 241, H606-H612 (1981).</li><li>Rutala, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APIC+guideline+for+selection+and+use+of+disinfectants.">APIC guideline for selection and use of disinfectants.</a> Am J Infect Control. 24, 313-342 (1996).</li></ol>

Tous les auteurs travaillent pour Charles River, un des principaux fournisseurs d&#39;animaux chirurgicalement modifiés pour la recherche.

La chirurgie expérimentale sur des rongeurs est rarement effectuée par les vétérinaires ou les médecins. Au lieu de cela, il est souvent réalisée par des chercheurs biomédicaux avec peu de formation formelle ou pas dans les principes de la chirurgie et la technique aseptique. Dans un contexte de recherche, la chirurgie est généralement appris de ses collègues, eux-mêmes généralement pas formellement formés soit. Chirurgie réalisée dans le laboratoire de recherche peut également être considéré essentiellement comme une méthode de préparation d&#39;un modèle animal dans le but de générer un ensemble d&#39;animaux pour une étude. Alors que toute chirurgie particulier est généralement une question de coordination œil-main et l&#39;habileté technique, les deux pouvant être acquises par la pratique, des principes et des compétences associées à la notion d&#39;une technique aseptique (et donc la chirurgie sans infection) ne peuvent être acquises uniquement par la pratique et sont souvent pas entièrement transmis aux chercheurs. L&#39;absence de formation formelle dans les principes chirurgicaux peuvent conduire à un manque de compréhension de l&#39;importance égale de la chirurgie techniquement correct et les soins pré-et post-opératoire des animaux. Examen de deux la chirurgie elle-même et les soins péri-opératoires des animaux se traduira par une augmentation de bien-être animal et la qualité des données obtenues à partir du modèle chirurgical. Par exemple, subclinique infections post-chirurgicales peuvent brouiller les résultats, comme on peut les changements de comportement et la physiologie vu avec douleur. Comme les espèces proies, la plupart des rongeurs sont étonnamment stoïque et bien souffrant de douleur post-chirurgicale ou une infection peut montrer quelques signes cliniques. Les signes subtils de la douleur ou de détresse chez les rongeurs sont encore obscurcis par un manque général de formation des chercheurs biomédicaux, en reconnaissance de ces signes chez les rongeurs. En outre, les rongeurs sont les plus actifs durant le cycle noir, lorsque le personnel ne sont généralement pas disponibles pour voir les signes cliniques et comportementales de la douleur après la chirurgie. Cette vidéo ne remplace pas la formation chirurgicale proprement dite, qui devrait idéalement être à la fois pratique et fournie par leur institution, mais est conçu pour donner aux chercheurs un aperçu des préoccupations communes et acceptées démonstration visuelle de procédures aseptiques et les techniques nécessaires pour développer une compétence minimale dans l&#39;exercice de la chirurgie de survie chez les rongeurs.

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principles of rodent surgery for the new surgeon

Pour des raisons de bien-être à la fois scientifique et animale, la formation dans les concepts de base et des techniques chirurgicales doivent être entrepris avant que cherche toujours à opérer un rongeur. Les étudiants, post-doctorants, et autres personnes intéressées à pratiquer des interventions chirurgicales sur des rongeurs dans le cadre d&#39;un protocole de recherche peut ne pas avoir eu de formation en chirurgie formelle dans le cadre de leurs cours requis. Chirurgie soi est une compétence technique, et qui va s&#39;améliorer avec la pratique. Les principes de l&#39;asepsie, cependant, restent souvent inexpliquée ou ignorante. Pour la plupart des nouveaux chirurgiens, cette information vitale est présenté de manière fragmentaire ou appris sur le tas, ni de ce qui est idéal. Il peut également faire apprendre à effectuer une chirurgie particulièrement difficile, comme le nouveau chirurgien est d&#39;apprendre à la fois une technique chirurgicale et les principes de l&#39;asepsie au même moment. Cet article résume et fait des recommandations pour les compétences de base en chirurgie et les techniques nécessaires pour la chirurgie des rongeurs réussie. Cet article est destiné à compléter la formation pratique par l&#39;institution de l&#39;utilisateur.

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Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

Avant de tenter la chirurgie, un nouveau chirurgien doit avoir une formation de base en techniques chirurgicales et des concepts. Cet article présente les considérations chirurgicales de base avec un accent sur les rongeurs.

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SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

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Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role in a variety of physiologic and disease processes, including early embryogenesis, wound healing 1, inflammation 2, 3, and host defense 4. PGRN also functions as a neurotrophic factor 5, and mutations in the PGRN gene resulting in partial loss of the PGRN protein cause frontotemporal dementia 6, 7. Our recent studies have led to the isolation of PGRN as an important regulator of cartilage development and degradation 8-11. Although PGRN, discovered nearly two decades ago, plays crucial roles in multiple physiological and pathological conditions, efforts to exploit the actions of PGRN and understand the mechanisms involved have been significantly hampered by our inability to identify its binding receptor(s). To address this issue, we developed a modified yeast two-hybrid (MY2H) approach based on the most commonly used GAL4 based 2-hybrid system. Compared with the conventional yeast two-hybrid screen, MY2H dramatically shortens the screen process and reduces the number of false positive clones. In addition, this approach is reproducible and reliable, and we have successfully employed this system in isolating the binding proteins of various baits, including ion channel 12, extracellular matrix protein 10, 13, and growth factor14. In this paper, we describe this MY2H experimental procedure in detail using PGRN as an example that led to the identification of TNFR2 as the first known PGRN-associated receptor 14, 15.

We have modified the conventional yeast two-hybrid screening, an effective genetic tool in identifying protein interaction. This modification markedly shortens the process, reduces the workload, and most importantly, reduces the number of false positives. In addition, this approach is reproducible and reliable.

Mise à jour de levure-système à deux hybrides pour identifier les protéines qui interagissent avec le facteur de croissance progranuline

Progranulin (PGRN), also known as granulin epithelin precursor (GEP), is a 593-amino-acid autocrine growth factor. PGRN is known to play a critical role ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

En utilisant l&#39;ARN médiée par la stratégie d&#39;alimentation interférences à l&#39;écran pour des gènes impliqués dans le règlement de la taille du corps du nématode<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

L&#39;utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

À haut débit d&#39;analyse de l&#39;image de Sphéroïdes tumorales: Une application logicielle conviviale pour mesurer la taille de Sphéroïdes automatiquement et avec précision

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imagerie réorganisation spatiale d&#39;une voie de signalisation MAPK Utilisation du système d&#39;expression transitoire du tabac

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...