Le plasmide pCAG-gapEGFP était un don du Dr. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmide a été un cadeau du Dr M. Feller (Berkeley, Californie). Nous remercions le Dr Edward Ruthazer pour suggérer l&#39;utilisation d&#39;une stratégie à deux plasmides pour l&#39;étiquetage seule cellule et Anne Schohl (Montréal, QC) pour la validation des deux plasmides Cre / loxP stratégie dans des études pilotes et membres du laboratoire Crair pour le soutien technique. Soutenu par R01 MH62639 (MC), le NIH R01 EY015788 (MC) et NIH P30 EY000785 (MC).

1. Installation des équipements pour l&#39;électroporation <ol><li> Electrodes: Nous avons modifié Dumont # 5 pinces pour servir d&#39;électrodes. <ol><li> Séparés et se briser la pince. </li><li> Soudez un fil à l&#39;extrémité plus large de chaque dent. Enroulez le fil attaché et broches avec du ruban isolant en laissant environ 25-30 mm de la pointe des branches exposées. </li><li> Mettez la pince modifiés retour ainsi que tout entretoise en plastique approprié (par exemple un bouton) entre les deux branches de fournir d&#39;action au printemps. </li></ol></li><li> L&#39;équipement électrotechnique: Nous utilisons un stimulateur électrique pour fournir des impulsions de courant pour l&#39;électroporation et un moniteur d&#39;oscilloscope et audio pour confirmer la forme d&#39;onde et le nombre d&#39;impulsions étant livrés. <ol><li> Connectez le fil d&#39;une broche de la pince à une pédale qui est également connecté en série avec le stimulateur. La pédale agit comme un interrupteur. Lorsqu&#39;il est enfoncé il complète le circuit pour l&#39;électroporation. </li><li> Connectez le fil de l&#39;autre volet au stimulateur électrique. </li><li> Connectez le stimulateur à l&#39;oscilloscope et moniteur audio. </li></ol></li><li> Micropipette et l&#39;injecteur de configuration: Nous utilisons forte pipettes en verre tiré et les Nanoinject II Le système d&#39;injection pour injecter de très petits volumes de colorant ou de solution d&#39;ADN directement dans la rétine. <ol><li> Mont système d&#39;injection sur un micromanipulateur à 3 axes. </li><li> Tirez pipettes en verre avec un cône long et petite astuce. </li><li> Retour remplir la pipette tiré avec de l&#39;huile minérale et sécurisé à l&#39;injecteur (pour plus de détails voir le manuel d&#39;instruction Nanoinect II). </li><li> En utilisant des ciseaux pointus microdissecting une coupe de la pointe de la pipette, en créant une petite ouverture (~ 2-3 um). </li><li> Remplir la pipette avec la quantité désirée de la solution d&#39;injection à travers la pointe de la pipette. Tant que l&#39;intégrité de la pointe est titulaire, il peut être utilisé pour les injections multiples et les animaux. Remarque: i) Assurer assez de solution pour injection est chargé dans les conseils tels que l&#39;huile minérale remblayé n&#39;est jamais injecté dans l&#39;œil. ii) Le Nanoinject II du système et l&#39;équipement électronique spécifique utilisé dans cette vidéo ne sont pas essentiels à la réalisation réussie d&#39;étiquetage des CGR. Les injections faites avec d&#39;autres appareils comme une picospritzer et l&#39;électroporation avec d&#39;autres stimulateurs commune peut également être utilisé pour CGR étiquette. </li></ol></li></ol> 2. Solutions de plasmide pour l&#39;étiquetage du CJR <ol><li> Pour l&#39;étiquetage des petits amas de CGR: Nous utilisons une construction codant pour l&#39;EGFP (~ 2-3 pg / pl) améliorée protéine fluorescente verte) sous le contrôle d&#39;un promoteur CAG (poulet β-actine avec un promoteur CMV précoce immédiat Enhancer). EGFP est étiqueté avec la séquence palmitoylation de GAP-43 (protéine associée à la croissance-43), il cible à la membrane cellulaire (mut4EGFP) 12. Cette construction est appelée pCAG-gapEGFP. </li><li> Pour l&#39;étiquetage cellule unique: Nous utilisons une combinaison de deux concepts. Le premier vecteur est un promoteur CAG conduire recombinase Cre (pCAG-Cre, Addgene [Cambridge, MA] plasmidique 13 775) 13 et le deuxième vecteur contient une cassette d&#39;arrêt floxés suivie par la membrane cible EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) est utilisé à une concentration d&#39;environ 1,000-10,000 fois plus faible que pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL), confinant expression de l&#39;EGFP fort à un petit nombre de cellules (en vertu de relativement faible de la pCAG-Cre concentration). </li></ol> 3. Injection de la rétine et du Protocole d&#39;électroporation <ol><li> Jour postnatal 0 (P0) pour chiots P5 sont anesthésiés par l&#39;hypothermie, tandis que les souris âgées de P5 sont anesthésiés par une injection intrapéritonéale (0,7 ml / kg) d&#39;un cocktail de kétamine (4,28 mg / mL), la xylazine (0,82 mg / ml) , et l&#39;acépromazine (0.07mg/ml) 14. </li><li> Stériliser tous les instruments chirurgicaux et des conseils d&#39;électrode dans un stérilisateur à chaleur perle. Par la suite refroidir à la fois dans une solution saline stérile avant utilisation pour éviter les dommages thermiques à l&#39;œil. </li><li> Placez la souris dans un champ de dissection et la position de l&#39;injecteur. </li><li> Pour les souris plus jeunes que P14 (avant l&#39;ouverture des yeux), une intervention chirurgicale de la paupière ouverte en coupant sur ​​toute la longueur de l&#39;ouverture de la paupière avenir avec des ciseaux à ressort micro b dissection. </li><li> Faire partie du globe oculaire saillir par un léger appliquant une pression autour de l&#39;œil avec le bout des pinces à c. </li><li> Tenir l&#39;œil en place en pinçant doucement la peau autour du globe oculaire. </li><li> Ajustez micromanipulateur et apporter une pipette à proximité du globe oculaire. </li><li> Pédale de presse, qui est relié au système Nanoinject II, d&#39;expulser quelques gouttes de solution d&#39;injection et donc de vérifier que la pipette n&#39;est pas bouché. </li><li> Avec une main stabiliser le globe oculaire, déplacer le micromanipulateur de telle sorte que la pointe de la pipette en verre perce à travers l&#39;épithélium pigmentaire de la rétine et pénètre dans la rétine. </li><li> Injecter desIRED montant de la solution en appuyant sur la pédale pour le système Nanoinject II. Par exemple, pour l&#39;étiquette CGR seule que nous faisons une injection unique de 2,3 4.6nL. </li><li> Rétracter la pipette et placer soigneusement extrémités des électrodes directement sur le site d&#39;injection et à déprimer pédale pour stimulateur pour compléter le circuit et électroporation de l&#39;œil. Nous utilisons généralement des impulsions carrées avec des réglages de puissance 25V, 50 ms durée, en dehors 1sec. 10 impulsions (5 impulsions de chaque polarité) sont appliqués pour les souris impulsions de plus de P4 et 6 (3 impulsions de chaque polarité) sont appliquées pour P0 à P3 souris. </li><li> Poussez doucement globe oculaire en arrière dans la douille et appliquer une pommade ophtalmique stérile sur les paupières coupées. </li><li> Animaux Placer sur un pad thermique à température contrôlée et sur le rétablissement complet, y compris le réchauffement adéquats et la mobilité, le retour des animaux à leur mère. </li><li> Surveiller les animaux toutes les 12 heures pour tout signe de douleur, de détresse ou d&#39;inconfort, comme la perte de mobilité, une posture anormale ou l&#39;échec de toiletter. Plusieurs cycles de l&#39;anesthésie, des injections et l&#39;électroporation ne doit pas être effectuée sur le même animal. </li></ol> 4. Remarques <ol><li> La méthode d&#39;injection décrite dans cette vidéo est un «aveugle» d&#39;injection. Il est possible de visualiser la quantité et l&#39;emplacement de l&#39;injection lorsque l&#39;on travaille avec des souris albinos et des solutions colorées (DII ou solution de plasmide avec des traces de bleus rapide). Cependant, avec des souches de souris pigmentée l&#39;emplacement d&#39;injection ne peuvent être directement visualisées et donc il est difficile de décrire verbalement que l&#39;on a atteint l&#39;emplacement prévu rétinienne ou combien il faut déplacer la pipette pour cibler spécifiquement la couche CJR. Par conséquent, nous conseillons vivement aux utilisateurs de nouvelles de commencer d&#39;abord avec les injections DiI chez des souris albinos car ces injections peuvent être immédiatement visualisées dans la rétine et l&#39;étiquetage des projections CJR à la rétine et le cerveau peuvent être utilisés pour évaluer la qualité de l&#39;injection. Préparer 10% DiI dans le N, N-diméthylformamide (100%) pour des injections focales. Utilisateurs Une fois cette procédure est maîtrisée doit être capable de cibler systématiquement CGR avec des solutions d&#39;ADN plasmidique évident chez les souris pigmentées. </li><li> La méthode d&#39;injection décrite dans cette vidéo peut être utilisé pour faire des injections de focale DiI à l&#39;étiquette de petites populations de cellules à étudier rétinotopie (4.6nL étiquettes à quelques centaines de CGR) 14 et au CGR étiquette en vrac avec des fluorophores (Alexa555, 488, etc), conjugué à B du choléra sous-unité de toxine pour étudier yeux ségrégation spécifique, à l&#39;exclusion de l&#39;étape d&#39;électroporation dans # 10 ci-dessus. Un volume d&#39;injection maximale totale de 2-3UL pour les souris de plus de P14 et 1-2UL pour des souris plus jeunes que P14 de toute solution est recommandée. </li><li> Pipettes peut être remblayée avec des solutions à injecter suivie par remblayage avec de l&#39;huile minérale avant le montage de la pipette sur l&#39;injecteur et de briser la pointe. Ceci est particulièrement utile lors de l&#39;utilisation des solutions à forte concentration de l&#39;ADN (~ 6ug/uL), qui sont en général très visqueux et difficile à charger à partir de la pointe de la pipette. </li><li> Si la pipette en verre devient bouché, essuyez soigneusement la pipette avec un coton tige trempé dans de l&#39;eau pour des solutions d&#39;ADN et de l&#39;éthanol (100%) pour le colorant (DII) de solutions. </li><li> Après l&#39;injection dans l&#39;oeil, rétracter la pointe de la pipette du globe oculaire et appuyez sur la pédale d&#39;injecter à nouveau. Ceci est pour confirmer que la pointe ne sont pas obstruées durant le processus d&#39;injection. Si aucune solution n&#39;est dispensé, il est fort probable que l&#39;injection n&#39;a pas été couronnée de succès. Toutefois, cela ne devrait pas être pris comme un signe absolu que l&#39;injection n&#39;a pas été couronnée de succès. L&#39;expérimentateur peut injecter le même œil nouveau si les sites d&#39;injection multiples et l&#39;étiquetage des plus grand nombre de cellules est souhaitée. </li><li> Pour l&#39;étiquetage des CGR seule, régler la vitesse d&#39;injection pour ralentir sur le boîtier de commande Nanoinject. Cela réduit encore la quantité de solution injectée dans la rétine comme le système prend plus de temps à ce paramètre pour passer la solution tout en l&#39;extrémité de la pipette en verre est rentré rapidement à partir du globe oculaire. </li><li> Electroporation de jour postnatal 0 à 3 (P0 à P3) souris nécessite des soins supplémentaires car il est très facile d&#39;endommager l&#39;oeil (cela devient évident après quelques jours de la reprise, quand l&#39;œil est manifestement inférieure à la normale). Réduire le nombre d&#39;impulsions et de la tension appliquée est conseillé pour le début de souris néonatales. Après P4, les globes oculaires sont plus résistants aux dommages causés par l&#39;électroporation. </li><li> Dans notre expérience de la membrane versions ciblées de EGFP ou DDP («gapEGFP &#39;, voir 12) sont de loin supérieures à la GFP non modifiée pour examiner les projections retinofugal au cerveau. Toutefois, pCAG-tdTomato, qui manque d&#39;une membrane cible de modification, fonctionne aussi bien (figure 1E). En outre, le dextran conjugué colorants fluorescents peuvent également être utilisés pour CGR étiquette en utilisant le protocole d&#39;électroporation décrit ci-dessus. </li><li> Typiquement, 9 des 10 injections mènera à CGR étiquetés, bien que seulement environ 15% des injections avec la double approche plasmiderésultat en seulement une seule CJR être étiquetés. Le nombre de cas de succès peut être augmentée par l&#39;injection d&#39;ADN dans de multiples endroits dans un œil ou par injection de plasmides codant pour différentes protéines fluorescentes dans chaque œil. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs RGC étiquetage a été observée à tous les âges, allant de la P2 à P25, avec un étiquetage EGFP dans CGR par les 24 heures après l&#39;électroporation et maintenu l&#39;expression d&#39;au moins trois semaines après la transfection. Dendrites marqué par fluorescence (figure 1A, B) et tonnelles axonale (figure 1F) du CGR unique peut être clairement visualisées et reconstruit. En dehors de CGR, cette technique peut être utilisé pour étiqueter les autres types de cellules rétiniennes telles que les cellules horizontales, les cellules bipolaires et divers sous-types de cellules amacrines (figure 1C) Cette méthode ne pas interférer avec le cours du temps normal de raffinement carte visuelle comme démontré par rétinotopie normale dans le SC (figure 1E). À tous les âges, dans environ 90% des cas, une injection de petit volume (~ 2,3 4.6nL) de pCAG-gapEGFP conduit à l&#39;expression dans un CGR quelques (figure 1D). Dans environ 15% des essais en utilisant une injection unique de l&#39;pCAG-Cre et plasmides combinaison pCAG-LNL-gapEGFP par animal, conduit à l&#39;étiquetage seul neurone rétinien dont CGR (figure 1A, B, D) et d&#39;autres types cellulaires comme les amacrines cellules (figure 1C). <img src="/files/ftp_upload/2678/2678fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1 - A, B. Exemples de EGFP étiquetés seule cellules ganglionnaires de la rétine (tête de flèche pointant vers l&#39;axone) dans une rétine à plat à montage en post-natal de 14 jours (P14) C. Exemple de cellule amacrines seule Starburst au P8 D.. . Un groupe de neurones rétiniens EGFP étiquetés, y compris CGR et les cellules amacrines dans la rétine, une plate-monture au P14 CGR E.. dorsale et ventrale de l&#39;œil droit ont été électroporés et étiquetés avec EGFP et CGR temporelle et ventrale de l&#39;œil gauche était galvanisé et étiquetés avec tdTomato en P1. Les zones cibles (astérisques) formée par le CGR marquées peuvent être vus à leur emplacement topographique correct dans le SC à P9 (toute monture, contour blanc). F. Exemple d&#39;une seule étiquette EGFP CJR Arbor (2-D de projection) dans une coupe sagittale (250 um d&#39;épaisseur) de la SC (ligne pointillée). Pour plus de clarté, les images en (D) et (F) ont été converties en niveaux de gris et inversée. Barres d&#39;échelle (um): (A) - (D), (F): 100; (E): 500

<ol>
	<li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields.">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li><li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. 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Dans cette vidéo, nous démontrons une électroporation in vivo dans le protocole que les résultats en matière d&#39;étiquetage des grappes simples ou peu de neurones rétiniens chez les souris postnatale avec des constructions d&#39;ADN codant pour des protéines fluorescentes. De petits groupes de marquage fluorescent des projections de la CJR dLGN et SC reproduit les modèles de projection similaires que les études précédentes utilisant l&#39;étiquetage RGC avec les colorants lipophiles, ce qui indiq...

<table border="1"><tbody><tr><th> Matériaux </th><th> Société </th><th> Le numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Dumont # 5 forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Stimulateur électrique </td><td> Instruments Herbe </td><td> Model S4 </td></tr><tr><td> Oscilloscope </td><td> Agilent </td><td> Modèle 54621A </td></tr><tr><td> Monitor Audio </td><td> Instruments Herbe </td><td> Modèle AM8B </td></tr><tr><td> Tireur </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modèle P-97 </td></tr><tr><td> Ciseaux Vannas une </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 14003 </td></tr><tr><td> Micro Ciseaux b </td><td> Ted Pella </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> Dumont AA forceps c </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> Nanoinject System II </td><td> Drummond scientifique </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Pipettes en verre </td><td> Drummond scientifique </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Pédale </td><td> Drummond scientifique </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> Huile minérale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen </td><td> D-383 </td></tr><tr><td> N, N-diméthylformamide </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation

Le ciblage et le raffinement des projections de la CJR mésencéphale est un système modèle populaire et puissant pour étudier comment les schémas précis de la forme de connectivité neuronale pendant le développement. Chez les souris, les projections sont retinofugal disposés de manière topographique et la forme des yeux spécifique des couches dans le corps genouillé latéral (dLGN) du thalamus et le colliculus supérieur (CS). Le développement de ces modèles précis de prévisions retinofugal a généralement été étudié par marquage des populations de CGR avec des colorants fluorescents et les traceurs, comme la peroxydase de raifort 1-4. Cependant, ces méthodes sont trop grossiers pour donner un aperçu des changements développementaux dans les différents morphologie tonnelle CJR axonale qui sont la base de la formation Plan rétinotopiques. Ils ne permettent pas de la manipulation génétique des CGR. Récemment, l&#39;électroporation est devenue une méthode efficace pour fournir un contrôle précis spatiale et temporelle pour la livraison de molécules chargées dans la rétine 5-11. Les protocoles actuels électroporation rétine ne permettent pas de manipulation génétique et le traçage des projections retinofugal d&#39;un cluster unique ou petite des CGR chez la souris postnatale. Il a été soutenu que postnatale chez électroporation in vivo n&#39;est pas une méthode viable pour la transfection CGR car l&#39;efficacité de l&#39;étiquetage est extrêmement faible et donc nécessite de cibler à l&#39;âge embryonnaire, lorsque les progéniteurs CJR sont en cours de différenciation et la prolifération 6. Dans cette vidéo, nous décrivons une électroporation in vivo dans le protocole d&#39;administration ciblée de gènes, shRNA, et dextranes fluorescents au CGR murin après la naissance. Cette technique fournit une solution rentable, rapide et relativement facile pour la plate-forme de dépistage efficace de gènes candidats impliqués dans plusieurs aspects du développement neural, y compris la rétraction des axones, ramification, le laminage, la régénération et la formation des synapses à différents stades de développement des circuits. En résumé, nous décrivons ici un outil précieux qui permettra de mieux appréhender les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le développement carte sensorielle.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Nous démontrons une<em&gt; In vivo</emProtocole d&#39;électroporation&gt; pour la transfection des grappes simples ou petites des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) et d&#39;autres types de cellules rétiniennes chez les souris postnatale sur un large éventail d&#39;âges. La capacité d&#39;étiqueter et de manipuler génétiquement CGR postnatale<em&gt; In vivo</em&gt; Est un outil puissant pour les études de développement.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

15.3K vues.  Yale University. Nous démontrons une In vivo

Vidéo: Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Recherche

Neurosciences

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Transfert de gènes à l&#39;oreille de souris en développement intérieur par<em&gt; In Vivo</em&gt; Électroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

La mise en œuvre Clamp dynamique avec conductances synaptiques et artificielle chez la souris cellules ganglionnaires rétiniennes

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marquage rétrograde des cellules ganglionnaires de la rétine à l&#39;âge adulte de poisson zèbre avec des colorants fluorescents

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In Vivo Transfert de gènes à des cellules de Schwann dans le nerf sciatique Rongeur par électroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomographie par cohérence optique : Imagerie souris ganglionnaires rétiniennes cellules In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Chargée de l’enquête la régénération axonale mammifères : In Vivo électroporation du Ganglion de la racine dorsale de souris adulte

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

In Vivo Ciblage des cellules progénitrices neuronales dans le néocortex de Ferret par In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Alignement du fibergramme OCT de la rétine de la souris avec des images confocales

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès de l’imagerie rétinienne in vivo et ex vivo pour améliorer le diagnostic et le traitement du glaucome 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Alignement de fibrogrammes de tomographie par cohérence optique en lumière visible avec des images confocales de la même rétine de souris

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...