Il pCAG-gapEGFP plasmide era un dono dal Dott. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmide è stato un dono di Feller Dr. M. (Berkeley, CA). Ringraziamo il Dr. Edward Ruthazer per aver suggerito l&#39;utilizzo di due plasmide strategia per l&#39;etichettatura singola cellula e Anne Schohl (Montreal, QC) per la validazione dei due plasmide Cre / loxP strategia in studi pilota e membri laboratorio Crair per il supporto tecnico. Supportato da R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) e NIH P30 EY000785 (MC).

1. Attrezzature Set-up per elettroporazione <ol><li> Elettrodi: Abbiamo modificato Dumont # 5 pinze da utilizzare come elettrodi. <ol><li> Separato e spezzare il forcipe. </li><li> Saldare un filo, alla fine di ogni più ampio polo. Avvolgere il filo attaccato e denti con nastro isolante lasciando circa 25-30 mm della punta dei denti esposti. </li><li> Mettere la pinza modificato di nuovo insieme con qualsiasi distanziatore plastico (ad esempio un pulsante) tra i due poli di fornire molla. </li></ol></li><li> Apparecchiature elettriche: Utilizziamo uno stimolatore elettrico per fornire impulsi di corrente per l&#39;elettroporazione e oscilloscopio e un monitor audio per confermare la forma d&#39;onda e il numero di impulsi di essere consegnati. <ol><li> Collegare il cavo da un polo della pinza ad un pedale che è anche collegata in serie con lo stimolatore. Il comando a pedale agisce come un interruttore. Quando sei depresso si completa il circuito per l&#39;elettroporazione. </li><li> Collegare il cavo dal polo altri allo stimolatore elettrico. </li><li> Collegare lo stimolatore per l&#39;oscilloscopio e monitor audio. </li></ol></li><li> Micropipetta iniettore e set-up: Noi usiamo taglienti pipette di vetro tirata ed il Nanoinject II sistema di iniezione per iniettare volumi molto piccoli di colore o la soluzione di DNA direttamente nella retina. <ol><li> Sistema di montaggio su un iniettore a 3 assi micromanipolatore. </li><li> Tirare pipette di vetro con una candela lunga e piccola mancia. </li><li> Riempire di nuovo la pipetta tirato con olio minerale e sicuro per iniettore (per dettagli vedere Nanoinect manuale di istruzioni II). </li><li> Utilizzando taglienti forbici microdissecting un taglio la punta della pipetta, creando una piccola apertura (~ 2-3 micron). </li><li> Riempire la pipetta con la quantità desiderata di soluzione per iniezione attraverso la punta della pipetta. Finché l&#39;integrità della punta tiene, può essere utilizzato per le iniezioni multiple e gli animali. Nota: i) Assicurare soluzione iniettabile è abbastanza caricata in punta in modo che l&#39;olio minerale riempito non è mai iniettato nell&#39;occhio. ii) Il Nanoinject II sistema e l&#39;attrezzatura elettronica specifica utilizzata in questo video non sono cruciali per il raggiungimento etichettatura successo RGCs. Iniezioni effettuate con altri dispositivi quali un picospritzer ed elettroporazione con altri stimolatori comune può anche essere usato per RGCs etichetta. </li></ol></li></ol> 2. Soluzioni per l&#39;etichettatura plasmide RGC <ol><li> Per l&#39;etichettatura piccoli gruppi di RGCs: Utilizziamo un costrutto codifica EGFP (~ 2-3 mg / mL) migliorato green fluorescent protein) sotto il controllo di un promotore CAG (pollo β-actina promotore di un immediato CMV primi enhancer). EGFP è etichettato con la sequenza palmitoilazione di GAP-43 (proteina associata alla crescita-43) che mira alla membrana cellulare (mut4EGFP) 12. Questo costrutto si riferisce a come pCAG-gapEGFP. </li><li> Per l&#39;etichettatura singola cella: Noi usiamo una combinazione di due costrutti. Il primo vettore è un promotore CAG guida Cre ricombinasi (pCAG-Cre, Addgene [Cambridge, MA] plasmide 13775) 13 e il secondo vettore contiene una cassetta floxed arresto seguito da membrana mirati EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) è utilizzato ad una concentrazione di circa 1.000-10.000 volte inferiore a quella pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL), confinando forte espressione EGFP ad un piccolo numero di cellule (in virtù di il relativamente basso pCAG Cre-concentrazione). </li></ol> 3. Iniezione della retina e il protocollo Elettroporazione <ol><li> Giorno postnatale 0 (P0) per cuccioli P5 sono anestetizzati da ipotermia, mentre i topi di età superiore ai P5 sono anestetizzati con una iniezione intraperitoneale (0,7 ml / kg) di un cocktail di ketamina (4.28 mg / mL), xilazina (0,82 mg / ml) , e acepromazina (0.07mg/ml) 14. </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e le punte degli elettrodi in uno sterilizzatore a caldo tallone. Successivamente fresco sia in soluzione salina sterile prima dell&#39;uso per evitare danni termici per l&#39;occhio. </li><li> Topo luogo sotto una portata dissezione e la posizione degli iniettori. </li><li> Per i topi di età inferiore ai P14 (prima di aprire gli occhi), chirurgicamente aprire la palpebra, tagliando tutta la lunghezza di apertura delle palpebre futuro con b molle micro dissezione forbici. </li><li> Rendere il bulbo oculare in parte sporgere leggermente pressione intorno all&#39;occhio con la punta delle pinze c. </li><li> Tenere l&#39;occhio in posizione da pizzicando delicatamente la pelle intorno al bulbo oculare. </li><li> Regolare micromanipolatore e portare pipetta vicino al bulbo oculare. </li><li> Stampa pedale, che è collegato al II Nanoinject sistema, di espellere alcune gocce di soluzione di iniezione e quindi verificare che la pipetta non sia intasato. </li><li> Con una mano la stabilizzazione del bulbo oculare, spostare il micromanipolatore in modo che la punta della pipetta di vetro penetra attraverso l&#39;epitelio pigmentato retinico ed entra nella retina. </li><li> Iniettare desIRED quantità di soluzione premendo il pedale per il sistema Nanoinject II. Ad esempio, per l&#39;etichetta RGCs singolo facciamo una singola iniezione di 2,3 4.6nL. </li><li> Ritrarre la pipetta e attentamente luogo punte degli elettrodi direttamente sul sito di iniezione e premere il pedale per stimolatore per completare il circuito e electroporate l&#39;occhio. Usiamo tipicamente impulsi quadrati con impostazioni di potenza 25V, 50msec durata, 1sec a parte. 10 impulsi (5 impulsi di ogni polarità) si applicano per i topi vengono applicati impulsi di età superiore ai P4 e 6 (3 impulsi di ogni polarità) per P0 ai topi P3. </li><li> Spingere delicatamente bulbo oculare indietro nella presa e applicare una pomata oftalmica sterile sulle palpebre tagliate. </li><li> Animali posto su un blocco controllato la temperatura e calore per il recupero completo, compreso rewarming adeguata e la mobilità, il ritorno degli animali alla loro madre. </li><li> Monitorare gli animali ogni 12 ore per ogni segno di dolore, angoscia o disagio, come la perdita della mobilità, postura anomala o mancato sposo. Ripetuti giri di anestesia, iniezioni ed elettroporazione non deve essere eseguito sull&#39;animale stesso. </li></ol> 4. Note <ol><li> Il metodo di iniezione descritto in questo video è una iniezione di &#39;cieco&#39;. E &#39;possibile visualizzare la quantità e la posizione di iniezione quando si lavora con i topi albini e soluzioni colorate (DII o soluzione plasmide con tracce di blu veloce). Tuttavia, con ceppi di topi pigmentati la posizione di iniezione non può essere direttamente visualizzati e quindi è difficile da descrivere verbalmente se uno ha raggiunto la posizione desiderata della retina o fino a che punto si dovrebbe spostare la pipetta di indirizzare lo strato RGC specifico. Pertanto, vi consigliamo vivamente di nuovi utenti al primo avvio con iniezioni Dii nei topi albini poiché queste iniezioni possono essere visualizzati immediatamente nella retina e l&#39;etichettatura delle proiezioni RGC alla retina e il cervello può essere utilizzato per valutare la qualità di iniezione. Preparare il 10% Dii in N, N-Dimetilformammide (100%) per preparazioni iniettabili focale. Utenti una volta che questa procedura è padroneggiata dovrebbe essere in grado di indirizzare in modo coerente con le soluzioni RGCs DNA plasmidico chiaro nei topi pigmentati. </li><li> Il metodo di iniezione descritto in questo video può essere usato per fare focale iniezioni DII di etichettare piccole popolazioni di cellule per studiare retinotopy (4.6nL etichette a poche centinaia di RGCS) 14 e RGCs etichetta di massa con fluorofori (Alexa555, 488, ecc), coniugata con subunità B della tossina del colera per studiare occhio specifici segregazione, escluso il passo elettroporazione in # 10. Un volume massimo di iniezione totale di 2-3UL per i topi di età superiore ai P14 e 1-2uL per i topi di età inferiore ai P14 di qualsiasi soluzione è raccomandato. </li><li> Pipette può essere riempito con le soluzioni da iniettare seguita da riempimento con olio minerale prima di montare la pipetta sul iniettore e la rottura della punta. Questo è particolarmente utile quando si utilizzano soluzioni di DNA ad alta concentrazione (~ 6ug/uL), che sono generalmente molto viscoso e difficile da caricare dalla punta della pipetta. </li><li> Se la pipetta di vetro si ostruisce, asciugare con cura la punta della pipetta con un batuffolo di cotone imbevuto di acqua per soluzioni di DNA ed etanolo (100%) per il colorante (DII) soluzioni. </li><li> Dopo aver iniettato negli occhi, ritrarre la punta della pipetta dal bulbo oculare e premere il pedale per iniettare di nuovo. Questo per confermare che la punta non intasarsi durante il processo di iniezione. Se nessuna soluzione è dispensato, è molto probabile che l&#39;iniezione non ha avuto successo. Tuttavia, questo non dovrebbe essere preso come un segno assoluto che l&#39;iniezione non ha avuto successo. Lo sperimentatore può iniettare lo stesso occhio di nuovo se i siti di iniezione multipla e l&#39;etichettatura di un maggior numero di cellule è voluta. </li><li> Per l&#39;etichettatura RGCs singolo, impostare la velocità di iniezione per rallentare la casella di controllo Nanoinject. Ciò riduce ulteriormente la quantità di soluzione iniettata nella retina in quanto il sistema impiega più tempo a questa impostazione di dispensare la soluzione allo stesso tempo la punta di pipette di vetro viene riavvolta velocemente dal bulbo oculare. </li><li> Elettroporazione del giorno postnatale 0 a 3 (P0 a P3) topi richiede una cura ulteriore dato che è molto facile danneggiare l&#39;occhio (questo diventa evidente dopo pochi giorni di recupero, quando l&#39;occhio è palesemente più piccola del normale). Ridurre il numero di impulsi e la tensione applicata è consigliabile per i primi di topo neonato. Dopo P4, i bulbi oculari sono più resistenti ai danni causati dal elettroporazione. </li><li> Nelle versioni nostra esperienza membrana mirata di EGFP o RFP (&#39;gapEGFP&#39;, si veda 12) sono di gran lunga superiore alla GFP non modificato per l&#39;esame delle proiezioni retinofugal al cervello. Tuttavia, pCAG-tdTomato, che manca di una membrana targeting modifica, funziona anche bene (Figura 1E). Inoltre, destrano coniugato coloranti fluorescenti possono essere utilizzati anche per RGCs etichetta utilizzando il protocollo di elettroporazione sopra descritto. </li><li> Tipicamente, 9 su 10 iniezioni porterà a RGCs etichettati, anche se solo circa il 15% delle iniezioni con il duplice approccio plasmide sirisultato in appena un RGC singolo essere etichettati. Il numero di casi di successo può essere aumentato iniettando il DNA in più posizioni di un occhio o iniettando plasmidi codifica diversa proteine ​​fluorescenti in ciascun occhio. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati RGC etichettatura è stata osservata a tutte le età, che vanno dalla P2 alla P25, con etichettatura EGFP in RGCs da 24 ore dopo l&#39;elettroporazione e mantenuto espressione per almeno tre settimane dopo la trasfezione. Dendriti fluorescente (Figura 1A, B) e pergole assonale (Figura 1F) di RGCs singoli possono essere visualizzati in modo chiaro e ricostruito. Oltre a RGCs, questa tecnica può essere usata per etichettare gli altri tipi di cellule retiniche come le cellule orizzontali, cellule bipolari e vari sottotipi di cellule amacrine (Figura 1C) Questo metodo non interferire con il corso normale orario di raffinatezza mappa visiva come dimostra retinotopy normale nel SC (figura 1E). A tutte le età, in circa il 90% dei casi, una iniezione di piccolo volume (~ 2,3 4.6nL) di pCAG-gapEGFP portato ad espressione in una RGCs pochi (Figura 1D). In circa il 15% delle prove utilizzando una singola iniezione di pCAG-Cre e pCAG-LNL-gapEGFP plasmidi combinazione per animale, ha portato alla singola etichettatura dei neuroni della retina compresa RGCs (Figura 1A, B, D) e altri tipi di cellule, come amacrine cellule (Figura 1C). <img src="/files/ftp_upload/2678/2678fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 - A, B. Esempi di EGFP etichettati singole cellule gangliari della retina (testa di freccia che punta a assone) in un appartamento-mount retina a livello post-natale giorno 14 (P14) C. Esempio di singole cellule amacrine starburst a P8 D.. . Un gruppo di EGFP neuroni della retina etichettati compresi RGCs e le cellule amacrine in un appartamento-mount retina nella P14. RGCs E. dorsale e ventrale nell&#39;occhio destro erano elettroporate ed etichettato con EGFP e RGCs temporale e ventrale nell&#39;occhio sinistro sono stati elettrolitica e etichettati con tdTomato in P1. Le zone di destinazione (asterischi) formata dalla RGCs etichettati possono essere visti nella loro posizione topograficamente corretta nel SC a P9 (intero-mount, contorno bianco). Esempio F. di una singola etichetta EGFP RGC pergolato (2-D di proiezione) in una sezione sagittale (250 micron di spessore) della SC (linea tratteggiata). Per chiarezza, le immagini in (D) e (F) sono stati convertiti in scala di grigi e invertita. Barre di scala (micron): (A) - (D), (F): 100; (E): 500

<ol>
	<li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields.">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li><li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinotopic+map+refinement+requires+spontaneous+retinal+waves+during+a+brief+critical+period+of+development.">Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development.</a> Neuron. 40, 1147-1160 (2003).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinogeniculate+and+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse.</a> J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).</li><li>Jaubert-Miazza, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+composition+of+the+developing+retinogeniculate+pathway+in+the+mouse.">Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse.</a> Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-+lapse+imaging+of+neuronal+development.">In vivo time- lapse imaging of neuronal development.</a> Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .</li><li>Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+ocular+gene+transfer.">Nonviral ocular gene transfer.</a> Gene Ther. 12, 843-851 (2005).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Plas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+proteins,+eye+patterning,+and+retinocollicular+map+formation+in+the+mouse.">morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse.</a> J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo video ci mostrano un protocollo di elettroporazione in vivo che si traduce in etichettatura dei singoli cluster o piccolo di neuroni della retina nei topi postnatale con costrutti di DNA codifica proteine ​​fluorescenti. Piccoli gruppi di fluorescente proiezioni RGC al dLGN e SC riprodotti schemi di proiezione simile a quello degli studi precedenti utilizzando l&#39;etichettatura RGC con coloranti lipofilici, indicando che elettroporazione non interferire con le normali raffinatezza RGC assone per...

<table border="1"><tbody><tr><th> Materiale </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinze </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Stimolatore elettrico </td><td> Erba Instruments </td><td> Modello S4 </td></tr><tr><td> Oscilloscopio </td><td> Agilent </td><td> Modello 54621A </td></tr><tr><td> Monitor audio </td><td> Erba Instruments </td><td> Modello AM8B </td></tr><tr><td> Puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> Modello P-97 </td></tr><tr><td> Vännäs Forbici uno </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 14003 </td></tr><tr><td> Micro forbici b </td><td> Ted Pella </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> Dumont AA Pinza c </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> Nanoinject II Sistema </td><td> Drummond scientifico </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Pipette di vetro </td><td> Drummond scientifico </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Pedale </td><td> Drummond scientifico </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> Olio minerale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> Dii </td><td> Invitrogen </td><td> D-383 </td></tr><tr><td> N, N-Dimetilformammide </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation

Il targeting e la raffinatezza di proiezioni RGC al mesencefalo è un sistema modello popolare e potente per studiare come schemi precisi di forma connettività neurale durante lo sviluppo. Nei topi, proiezioni retinofugal sono disposti in modo topografico e la forma degli occhi-specifica i livelli del nucleo genicolato laterale (dLGN) del talamo e il collicolo superiore (SC). Lo sviluppo di tali schemi precisi di proiezioni retinofugal è generalmente stata studiata mediante l&#39;etichettatura popolazioni di RGCs con tinture fluorescenti e traccianti, come la perossidasi di rafano 1-4. Tuttavia, questi metodi sono troppo grossolana per fornire la visibilità delle modifiche di sviluppo nei singoli RGC morfologia assonale pergolato che sono alla base della formazione di mappa retinotopica. Inoltre non consentono la manipolazione genetica di RGCs. Recentemente, elettroporazione è diventato un metodo efficace per fornire un controllo preciso spaziale e temporale per la consegna di molecole cariche nella retina 5-11. Attuali protocolli di elettroporazione della retina non consentono la manipolazione genetica e la rintracciabilità di proiezioni retinofugal di un singolo cluster o piccole RGCs nei topi postnatale. Si è sostenuto che dopo la nascita in elettroporazione in vivo non è un metodo praticabile per trasfezione RGCs poiché l&#39;efficienza di etichettatura è estremamente bassa e, quindi, richiede targeting in età embrionale quando progenitori RGC sono in fase di differenziazione e la proliferazione 6. In questo video possiamo descrivere un protocollo di elettroporazione in vivo per la somministrazione mirata di geni, shRNA e destrani fluorescenti a RGCs murino dopo la nascita. Questa tecnica fornisce una soluzione efficace, veloce e relativamente facile piattaforma efficace per lo screening di geni candidati coinvolti in diversi aspetti dello sviluppo neurale tra cui retrazione assone, ramificazione, laminazione, rigenerazione e formazione di sinapsi nelle varie fasi di sviluppo del circuito. In sintesi descriviamo qui un prezioso strumento che fornirà ulteriori approfondimenti sui meccanismi molecolari alla base dello sviluppo sensoriale mappa.

Watch this Scientific Journal Video about Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation at JoVE.com

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Ci mostrano un<em&gt; In vivo</em&gt; Protocollo di elettroporazione per trasfezione singoli o piccoli gruppi di cellule gangliari della retina (RGCs) e altri tipi di cellule della retina nei topi postnatale in un ampio intervallo di età. La capacità di etichetta e manipolare geneticamente RGCs postnatale<em&gt; In vivo</em&gt; È un potente strumento per gli studi di sviluppo.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

transfection-mouse-retinal-ganglion-cells-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

15.4K Views.  Yale University. Ci mostrano un In vivo Protocollo di elettroporazione per trasfezione singoli o piccoli gruppi di cellule gangliari della retina (RGCs) e altri tipi di cellule della retina nei topi postnatale in un ampio intervallo di età. La capacità di etichetta e manipolare geneticamente RGCs postnatale In vivo È un potente strumento per gli studi di sviluppo.

Video: Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Ricerca

Neuroscienze

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Gene Transfer per l&#39;orecchio del mouse Sviluppo Inner<em&gt; In Vivo</em&gt; Elettroporazione

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Implementazione morsetto dinamico con conduttanze sinaptiche e artificiale nel topo cellule gangliari della retina

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina in Zebrafish adulti con coloranti fluorescenti

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In Vivo Gene Transfer di cellule di Schwann nel nervo sciatico roditori da elettroporazione

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia a coerenza ottica: Imaging Mouse ganglionari cellule In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Inquirenti rigenerazione dell'assone dei mammiferi: In Vivo elettroporazione del ganglio di radice dorsale del topo adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

In Vivo Targeting di cellule progenitrici neurali in Ferret Neocortex di In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Allineamento del fibrogramma OCT della retina del topo con immagini confocali

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Autore in primo piano: Progressi nell'imaging retinico in vivo ed ex vivo per migliorare la diagnosi e il trattamento del glaucoma 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...