PCAG-gapEGFP הפלסמיד היה מתנה ד&quot;ר ס מקונל (סטנפורד, קליפורניה). pCAG-tdTomato פלסמיד הייתה מתנה מ ד&quot;ר פלר (ברקלי, CA). אנו מודים ד&quot;ר אדוארד Ruthazer עבור מציע את השימוש באסטרטגיה של שתי פלסמיד תיוג תא בודד ואן Schohl (Montreal, QC) עבור אימות שני פלסמיד Cre / loxP אסטרטגיה בלימודי טייס וחברי Crair מעבדה לקבלת תמיכה טכנית. נתמך על ידי R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) ו-NIH P30 EY000785 (MC).

1. ציוד הקמה עבור electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות: אנו שונה דומון # 5 מלקחיים שישמש אלקטרודות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד להתפרק מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוט הלחמה בקצה הרחב של כל שן. עוטפים את החוט המצורף חודי עם סרט בידוד להשאיר כ 25-30 מ&quot;מ של קצה חודי חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את מלקחיים שונה בחזרה יחד עם spacer כלשהו פלסטיק מתאים (למשל כפתור) בין שתי שיני לספק פעולה האביב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד חשמלי: אנו משתמשים ממריץ חשמל כדי לספק פולסים הנוכחית electroporation ועל צג האוסילוסקופ ושמע לאשר את waveform ומספר פולסים מועבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הכבל של שן אחת מלקחיים אל דוושת רגל אשר מחובר גם בסדרה עם ממריץ. דוושת רגל משמש מתג. מדוכא כאשר הוא משלים את המעגל עבור electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הכבל של שיניים אחרות ממריץ החשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את ממריץ את האוסילוסקופ לפקח אודיו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipette ו מזרק הגדרת: אנו משתמשים חדה pipettes זכוכית משך ומערכת השנייה Nanoinject מזרק כדי להזריק כמויות קטנות מאוד של צבע או פתרון ה-DNA ישירות לתוך הרשתית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר על מערכת ההזרקה micromanipulator 3-ציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך pipettes זכוכית עם להתחדד ארוך טיפ קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרה למלא את משך פיפטה עם שמן מינרלי מאובטחת ההזרקה (לפרטים ראה Nanoinect ידני II הוראה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים microdissecting חדה חתך את קצה פיפטה, יצירת פתח קטן (~ 2-3 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את פיפטה עם כמות הרצויה של פתרון באמצעות הזרקה קצה פיפטה. עוד על שלמות קצה מחזיקה, היא יכולה לשמש עבור זריקות ובעלי חיים רבים. הערה: i) ודא פתרון הזרקת דיו טעון את הטיפים כזה שמן מינרלי backfilled לא מוזרק לתוך העין. ii) II Nanoinject המערכת ואת ציוד אלקטרוני מסוים בשימוש וידאו זה לא קריטי להשגת תיוג מוצלח של RGCs. זריקות עשה עם התקנים אחרים כגון picospritzer ו electroporation עם לגירוי נפוצים אחרים יכולים לשמש גם כדי RGCs התווית. </li></ol></li></ol> 2. פתרונות פלסמיד עבור תיוג RGC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תיוג אשכולות קטנים של RGCs: אנו משתמשים בקידוד EGFP לבנות (~ 2-3 מיקרוגרם / μL) משופרת חלבון פלואורסצנטי ירוק) תחת שליטה של מקדם החטיבה (β-אקטין עוף עם האמרגן מיידית CMV משפר מוקדם). EGFP מתויג רצף palmitoylation של GAP-43 (גידול הקשורים חלבון 43) מיקוד אותו קרום התא (mut4EGFP) 12. לבנות זה נקרא pCAG-gapEGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תיוג תא בודד: אנו משתמשים בשילוב של שני המבנים. וקטור הראשון הוא מקדם החטיבה נהיגה Cre recombinase (pCAG-Cre, Addgene [Cambridge, MA] פלסמיד 13,775) 13 ואת וקטור השני מכיל קלטת STOP floxed ואחריו קרום ממוקד EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) משמש בריכוז כ 1,000-10,000 פי נמוך יותר pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL), כליאת ביטוי EGFP חזקה במספר קטן של תאים (מכוח הנמוך יחסית pCAG-Cre ריכוז). </li></ol> 3. הזרקת הרשתית ואת פרוטוקול electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחרי לידה 0 (P0) כדי גורים P5 מורדמים באמצעות היפותרמיה, ואילו עכברים מבוגרים מאשר P5 מורדמים עם זריקה intraperitoneal (0.7 מ&quot;ל / ק&quot;ג) של קוקטייל של קטמין (4.28 מ&quot;ג / מ&quot;ל), xylazine (0.82 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו acepromazine (0.07mg/ml) 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את כל מכשירי ניתוח וטיפים אלקטרודה מעקר חרוז חם. מגניב בהמשך הן מלוחים סטריליים לפני השימוש כדי למנוע נזק תרמי לעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום העכבר תחת בהיקף לנתיחה ומיקום ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עכברים צעירים יותר P14 (לפני פתיחת העין), בניתוח לפתוח את העפעף על ידי חיתוך לאורך כל אורכו של פתיחת העפעף עתידי עם מיקרו ב באביב מספריים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את גלגל העין באופן חלקי לבלוט על ידי הפעלת לחץ בעדינות סביב העין בקצות מלקחיים ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את העין במקום על ידי צובט בעדינות את העור סביב העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם micromanipulator ולהביא פיפטה קרוב גלגל העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על דוושת רגל, אשר מחובר אל השני Nanoinject המערכת, לגרש כמה טיפות של תמיסת הזרקת ובכך לוודא כי פיפטה לא סתומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם יד אחת מייצבת את גלגל העין, הזז את micromanipulator כזה קצה פיפטה זכוכית חודרת דרך אפיתל הפיגמנט ברשתית ונכנס הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק desכמות ired של פתרון על ידי לחיצה על דוושת רגל למערכת Nanoinject השנייה. לדוגמה, כדי תווית RGCs אחד שאנחנו עושים זריקה אחת של 2.3-4.6nL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת פיפטה ובזהירות מקום טיפים אלקטרודה ישירות על הזריקה ומדכאים הדוושה ברגל ממריץ כדי להשלים את המעגל ואת electroporate את העין. אנו משתמשים בדרך כלל פולסים מרובע עם הגדרות של כוח 25V, משך 50msec, 1sec מזה. 10 פולסים (5 פולסים של הקוטביות אחד) מוחלים על עכברים פולסים מבוגר P4 ו - 6 (3 פולסים של הקוטביות אחד) מוחלים עבור P0 לעכברים P3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף בעדינות בחזרה לשקע העין וליישם משחת עיניים סטריליות מעל העפעפיים לחתוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיות מניחים על משטח חום מבוקר טמפרטורה על התאוששות מלאה, כולל rewarming ניידות נאותה, לחזור חיה לאמא שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג בעלי חיים כל 12 שעות לכל סימן של מצוקה וכאב, או אי נוחות, כגון אובדן ניידות, יציבה כשל לא נורמלי או החתן. סיבובים חוזרים ונשנים של, זריקות הרדמה electroporation לא צריך להיות מבוצע על החיה אותו. </li></ol> 4. הערות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטת הזרקה המתואר וידאו זה הוא הזרקה &quot;עיוורת&quot;. אפשר לדמיין את כמות ומיקום הזרקה כשעובדים עם עכברים לבקנים ופתרונות בצבע (DiI או פתרון פלסמיד עם כמויות זעירות של כחול מהיר). עם זאת, עם זני עכברים פיגמנט המיקום זריקה לא ניתן דמיינו ישירות ומכאן שקשה לתאר מילולית אם אחד הגיע המיקום המיועד רשתית או כמה רחוק צריך להזיז את פיפטה למקד את השכבה RGC במיוחד. לכן, אנו ממליצים למשתמשים חדשים קודם להתחיל עם זריקות DiI בעכברים לבקנים מאז הזרקות אלה ניתן דמיינו מיד ברשתית ואת תיוג התחזיות RGC אל הרשתית והמוח ניתן להשתמש כדי להעריך את איכות הזריקה. הכן DiI 10% N, N-Dimethylformamide (100%) זריקות מוקד. משתמשים לאחר הליך זה הוא שולט צריכים להיות מסוגלים בעקביות היעד RGCs עם פתרונות ה-DNA ברור פלסמיד בעכברים פיגמנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השיטה של הזרקת המתואר וידאו זה יכול לשמש כדי להפוך מוקד זריקות DiI לתייג אוכלוסיות קטנות של תאים ללמוד retinotopy (4.6nL תוויות כמה מאות RGCS) 14 ו RGCs תווית בתפזורת עם fluorophores (Alexa555, 488 וכו &#39;) כדי מצומדות למקטע כולרה ב רעלן ללמוד העין ספציפי הפרדה, למעט השלב electroporation ב # 10 לעיל. נפח מקסימלי הזריקה סך של 2-3uL לעכברים מבוגר P14 ו 1-2uL לעכברים צעירים יותר P14 של כל פתרון מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes ניתן backfilled עם פתרונות להיות מוזרק ואחריו למלא את משבצות עם שמן מינרלי לפני הרכבה פיפטה על מזרק ושבירת קצה. זה שימושי במיוחד בעת השימוש ריכוז גבוה DNA פתרונות (~ 6ug/uL), אשר כללי צמיגה וקשה לטעון מקצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם פיפטה זכוכית הופך סמיך, לנגב היטב את קצה פיפטה במקלון צמר גפן טבול במים פתרונות דנ&quot;א אתנול (100%) עבור צבע (DiI) פתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקת בעיניים, לסגת קצה פיפטה של ​​גלגל העין ולחץ על דוושת רגל להזריק שוב. זה כדי לאשר את קצה לא מקבל סתומים במהלך תהליך ההזרקה. אם לא הפתרון הוא לוותר, זה סביר כי הזריקה לא הייתה מוצלחת. עם זאת, זה לא צריך לקחת כסימן מוחלט כי הזריקה לא הייתה מוצלחת. הנסיין יכול להזריק את העין שוב אם אתרי הזרקה מרובות וסימון של מספר גדול יותר של תאים הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תיוג RGCs יחיד, קבע את מהירות הזריקה להאט על קופסת השליטה Nanoinject. עוד דבר זה מפחית את כמות פתרון מוזרק לתוך הרשתית כמערכת לוקח יותר זמן הגדרה זו כדי לוותר על הפתרון ובמקביל קצה pipettes זכוכית מתבצע חזר מהר מן העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporation של יום הלידה 0-3 (P0 ל P3) עכברים דורש טיפול נוסף מאז קל מאוד לפגוע בעין (זה הופך להיות ברור אחרי כמה ימים של התאוששות, כאשר העין היא במופגן קטן יותר מהרגיל). צמצום מספר פעימות מתח להחיל מומלץ לעכברים בילוד מוקדם. לאחר P4, העיניים הם עמידים יותר נזק electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרום הניסיון שלנו גרסאות ממוקד של EGFP או RFP (&quot;gapEGFP&quot;, ראה 12) עדיפים בהרבה על ה-GFP ללא שינוי לבחינת תחזיות retinofugal למוח. עם זאת, pCAG-tdTomato, שאין לה קרום שינוי המיקוד, גם עובד היטב (איור 1E). בנוסף, צבעי ניאון dextran מצומדות יכול לשמש גם כדי RGCs התווית באמצעות פרוטוקול electroporation שתוארו לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, 9 מתוך 10 זריקות תוביל RGCs שכותרתו, אם כי רק כ -15% של זריקות עם הגישה הפלסמיד יהיה כפולהתוצאה RGC רק אחד להיות מתויג. מספר מקרים מוצלח יכול להיות מוגברת על ידי הזרקת DNA במקומות רבים בעין אחת או על ידי הזרקת פלסמידים קידוד חלבוני ניאון שונים לתוך כל עין. </li></ol> 5. נציג תוצאות RGC תיוג נצפתה בכל הגילאים, החל P2 ל P25, עם תיוג EGFP ב RGCs על ידי 24 שעות לאחר electroporation ומתוחזק ביטוי במשך לפחות שלושה שבועות לאחר transfection. דנדריטים שכותרתו fluorescently (איור 1 א &#39;, ב&#39;) סוכות axonal (איור 1F) של RGCs יחיד ניתן דמיינו בבהירות משוחזר. מלבד RGCs, טכניקה זו יכולה לשמש תווית אחרים סוגי תאים ברשתית כגון תאים אופקיים, תאים דו קוטבית שונים תת תא amacrine (תרשים 1C) שיטה זו אינה מפריעה כמובן הזמן הרגיל של עידון מפה ויזואלית כפי שעולה retinotopy נורמלי SC (איור 1E). בכל גיל, בערך 90% מהמקרים, זריקת נפח קטן (~ 2.3-4.6nL) של pCAG-gapEGFP הביא לידי ביטוי RGCs מעטים (איור 1D). ב 15% של הניסויים באמצעות זריקה אחת של pCAG-Cre pCAG ו-LNL-gapEGFP פלסמידים שילוב לכל חיה, הוביל תיוג נוירון יחיד ברשתית כולל RGCs (איור 1A, B, D) סוגי תאים אחרים כגון amacrine תאים (תרשים 1C). <img src="/files/ftp_upload/2678/2678fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 - א &#39;, ב&#39; דוגמאות של EGFP שכותרתו אחד התאים הגנגליון ברשתית (ראש החץ מצביע על האקסון) ברשתית שטוח הר ביום שלאחר הלידה 14 (P14) C. דוגמה של תא אחד מהספרים amacrine P8 ב ד.. . מקבץ של נוירונים EGFP רשתית שכותרתו כולל RGCs ותאי amacrine ברשתית שטוח הר ב P14. RGCs א הגבי ו הגחון בעין ימין היו electroporated ומסומן עם EGFP ו RGCs הזמני הגחון בעין שמאל היו electroplated ו שכותרתו עם tdTomato ב P1. אזורי היעד (כוכביות) שיצרו RGCs שכותרתו ניתן לראות את המיקום הנכון טופוגרפית שלהם SC ב P9 (כל הר, מתאר לבן). דוגמה של פ EGFP בודד שכותרתו RGC סוכת (2-D הקרנה) בבית קטע sagittal (250 מיקרומטר עבה) של SC (קו מקווקו). לשם הבהירות, תמונות (ד) ו - (F) הומרו לגווני אפור ו הפוכה. סולם ברים (מיקרומטר): (א) - (ד), (F): 100: (E): 500

<ol>
	<li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields.">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li><li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinotopic+map+refinement+requires+spontaneous+retinal+waves+during+a+brief+critical+period+of+development.">Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development.</a> Neuron. 40, 1147-1160 (2003).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinogeniculate+and+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse.</a> J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).</li><li>Jaubert-Miazza, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+composition+of+the+developing+retinogeniculate+pathway+in+the+mouse.">Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse.</a> Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-+lapse+imaging+of+neuronal+development.">In vivo time- lapse imaging of neuronal development.</a> Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .</li><li>Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+ocular+gene+transfer.">Nonviral ocular gene transfer.</a> Gene Ther. 12, 843-851 (2005).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Plas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+proteins,+eye+patterning,+and+retinocollicular+map+formation+in+the+mouse.">morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse.</a> J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בסרטון הזה אנחנו מדגימים בפרוטוקול electroporation vivo כי התוצאות תיוג של אשכולות יחיד או קטן של נוירונים ברשתית אצל עכברים לאחר הלידה עם בונה DNA קידוד חלבוני ניאון. אשכולות קטנים של תחזיות RGC שכותרתו fluorescently את dLGN ו SC לשכפל דפוסי השלכה דומה כמו במחקרים קודמים באמצעו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> חומרים </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> דומון # 5 מלקחיים </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> חשמל ממריץ </td><td> גראס מכשירים </td><td> דגם S4 </td></tr><tr><td> אוסצילוסקופ </td><td> Agilent </td><td> דגם 54621A </td></tr><tr><td> אודיו לפקח </td><td> גראס מכשירים </td><td> דגם AM8B </td></tr><tr><td> חולץ </td><td> סאטר מכשירים </td><td> דגם P-97 </td></tr><tr><td> Vannas מספריים </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> 14003 </td></tr><tr><td> מיקרו מספריים ב </td><td> טד פלה </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> דומון AA מלקחיים ג </td><td> המדע כלים פיין </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> Nanoinject II מערכת </td><td> דראמונד מדעי </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> זכוכית pipettes </td><td> דראמונד מדעי </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> דוושת רגל </td><td> דראמונד מדעי </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> שמן מינרלי </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen </td><td> D-383 </td></tr><tr><td> N, N-Dimethylformamide </td><td> סיגמא </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation

מיקוד ועידון של תחזיות RGC אל המוח התיכון, היא מערכת מודל פופולרי ורב עוצמה ללימוד כיצד דפוסים מדויקים של טופס קישוריות עצבית במהלך ההתפתחות. בעכברים, תחזיות retinofugal מסודרים בצורה טופוגרפית ובצורה ספציפית עין שכבות בגרעין הברכיתי הרוחב (dLGN) של התלמוס ואת Colliculus מעולה (SC). הפיתוח של דפוסים אלה המדויק של תחזיות retinofugal יש בדרך כלל נחקרה על ידי תיוג אוכלוסיות RGCs עם צבעים קליעים נותבים ניאון, כגון peroxidase חזרת 1-4. עם זאת, שיטות אלו גס גם כדי לספק תובנה לגבי שינויים התפתחותיים אצל אדם מורפולוגיה RGC סוכת axonal כי הם הבסיס של היווצרות המפה retinotopic. הם גם אינם מאפשרים מניפולציה גנטית של RGCs. לאחרונה, electroporation הפכה שיטה יעילה עבור מתן שליטה במרחב ובזמן מדויק עבור משלוח של מולקולות טעונים לתוך הרשתית 5-11. שוטפים ופרוטוקולים electroporation ברשתית אינם מאפשרים מניפולציה גנטית מעקב אחר תחזיות retinofugal מקבץ קטן של יחיד או RGCs בעכברים לאחר הלידה. נטען כי לאחר הלידה ב electroporation vivo אינה שיטה מעשית עבור transfecting RGCs מאז יעילות תיוג הוא נמוך ביותר, ולכן דורש מיקוד בגילאים עובריים, כאשר אבות RGC עוברים בידול ריבוי 6. בסרט זה אנו מתארים בפרוטוקול electroporation vivo למסירה ממוקד של גנים, shRNA ו dextrans ניאון RGCs Murine אחרי הלידה. טכניקה זו מספקת חסכוני, מהיר פלטפורמה קלה יחסית לסינון יעיל של גנים מועמדים מעורב בכמה היבטים של ההתפתחות העצבית כולל נסיגת האקסון, מסתעפת, למינציה, התחדשות היווצרות הסינפסה בשלבים שונים של פיתוח מעגל. לסיכום נתאר כאן כלי רב ערך אשר יספקו תובנות נוספות המנגנונים המולקולריים שבבסיס פיתוח המפה חושית.

Watch this Scientific Journal Video about Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation at JoVE.com

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

אנו מדגימים<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation פרוטוקול transfecting אשכולות יחיד או קטן של תאים הגנגליון ברשתית (RGCs) ושאר סוגי תאים ברשתית אצל עכברים לאחר הלידה על פני טווח רחב של גילאים. היכולת התווית גנטית לתפעל RGCs לאחר הלידה<em&gt; In vivo</em&gt; הוא כלי רב עוצמה למחקרים התפתחותיים.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

transfection-mouse-retinal-ganglion-cells-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

15.3K Views.  Yale University. אנו מדגימים In vivo Electroporation פרוטוקול transfecting אשכולות יחיד או קטן של תאים הגנגליון ברשתית (RGCs) ושאר סוגי תאים ברשתית אצל עכברים לאחר הלידה על פני טווח רחב של גילאים. היכולת התווית גנטית לתפעל RGCs לאחר הלידה In vivo הוא כלי רב עוצמה למחקרים התפתחותיים.

Video: Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

תיוג מדרדר של תאים ברשתית גנגליון מבוגרים דג הזברה עם צבעי ניאון

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In vivo ג&#39;ין העברה בתאי שוואן בעצב מכרסמים Sciatic ידי Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית: הדמיה העכבר גנגליון תאים In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

יישור פיברגרם OCT של רשתית העכבר עם תמונות קונפוקליות

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

מחבר זרקור: התקדמות בהדמיית הרשתית In Vivo ו- Ex Vivo לשיפור אבחון וטיפול בגלאוקומה 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

יישור של טומוגרפיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה עם תמונות קונפוקליות של אותה רשתית עכבר

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...