pCAG - gapEGFP 플라스미드 박사 S. 맥코넬 (스탠포드, CA)에서 선물했다. pCAG - tdTomato 플라스미드 박사 M. 펠러 (버클리, CA)에서 선물했다. 우리는 기술 지원을위한 시험 연구와 Crair 연구소 회원에 두 개의 플라스미드 Cre 호텔 / loxP 전략을 검증을위한 단일 셀 라벨 앤 Schohl (몬트리올, QC)에 대한 두 플라스미드 전략의 사용을 제안 박사의 에드워드 Ruthazer 감사합니다. R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC)와 NIH P30 EY000785 (MC) 지원.

1. 설정 Electroporation을위한 장비 <ol><li> 전극 : 우리는 더몬트에게 전극으로 사용하기 # 5 포셉을 수정했습니다. <ol><li> 분리와 포셉을 따로 휴식. </li><li> 각 단자의 넓은 끝에 솔더 와이어. 전선 연결 및 절연 테이프와 접지 단자가 노출 접지 단자의 끝에 약 25~30밀리미터 떠나을 바꿈. </li><li> 스프링 동작을 제공하기 위해 두 접지 단자 사이에 적당한 플라스틱 스페이서 (예 : 단추)와 다시 함께 수정된 포셉 놔. </li></ol></li><li> 전기 장비 : 우리는 배달되는 펄스의 파형과 번호를 확인 electroporation과 오실로 스코프 및 오디오 모니터링에 대한 현재 펄스를 전달하기 위해 전기 자극기를 사용합니다. <ol><li> 또한 자극기와 직렬로 연결된 발을 페달에 포셉 중 한 단자에서 와이어를 연결합니다. 발 페달은 스위치 역할을합니다. 언제 우울 그것은 electroporation을 위해 회로를 완료합니다. </li><li> 다른 접지 단자에서 전기 자극기에 와이어를 연결합니다. </li><li> 오실로 스코프 및 오디오 모니터 자극기를 연결합니다. </li></ol></li><li> 설정 Micropipette 및 분사기 : 우리가 직접 망막에 염료 또는 DNA 솔루션의 아주 작은 볼륨을 삽입하는 날카로운 뽑아 유리 pipettes 및 Nanoinject II 연료 분사 시스템을 사용합니다. <ol><li> 3 축 micromanipulator에 마운트 인젝터 시스템. </li><li> 긴 테이퍼 작은 팁과 유리 pipettes을 당기세요. </li><li> 위로 (자세한 내용은 Nanoinect II 지침 설명서를 참조)을 광유 및 주입기 확보로 뽑아 피펫을 입력합니다. </li><li> 날카로운 microdissecting 가위를 사용하여이 작은 오프닝 (~ 2-3 μm의)를 작성, 피펫의 끝을 잘라. </li><li> 피펫의 팁을 통해 사출 솔루션의 원하는 금액으로 피펫을 입력합니다. 마찬가지로 긴 팁의 무결성이 유지로, 그것은 여러 주입과 동물에 사용할 수 있습니다. 참고 : I) 충분한 사출 솔루션 backfilled 미네랄 오일이 눈 안으로 주입되지 않습니다 그러한 조언에로드되어 있는지 확인. II) Nanoinject II 시스템과이 동영상에서 사용되는 특정 전자 장비는 RGCs의 성공 라벨 달성을위한 중요하지 않습니다. 같은 다른 일반적인 stimulators와 picospritzer과 electroporation과 같은 다른 장치로 만든 주사는 레이블 RGCs에도 사용할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. RGC 라벨링에 대한 플라스미드 솔루션 <ol><li> RGCs 작은 클러스터를 라벨의 경우 : 우리는 우리 편대의 편대 장 모터 (CMV 즉시 초기 확장기와 닭고기 β - 굴지 프로 모터)의 제어하에 구조 인코딩 EGFP를 (~ 2-3 μg / μL) 향상된 녹색 형광 단백질)을 사용합니다. EGFP는 세포막 (mut4EGFP) 12 그것을 대상으로 GAP - 43의 palmitoylation 순서 (성장 단백질 - 43 관련) 태그가 있습니다. 이 구조는 pCAG - gapEGFP이라고합니다. </li><li> 단세포 라벨의 경우 : 두 가지 구성의 조합을 사용합니다. 첫 번째 벡터는 Cre 호텔 recombinase (pCAG - Cre 호텔, Addgene [캠브리지, MA] 플라스미드 13775) 13 번째 벡터 EGFP (pCAG - LNL - gapEGFP)를 타겟으로 막 다음 floxed STOP 카세트를 포함 운전 편대의 편대 장 발기인이다. pCAG - Cre 호텔은 (~ 0.15-ng/μL) (의 미덕에 의해 세포의 소수에 강한 EGFP 식을 confining, pCAG - LNL - gapEGFP (~ 1-2 μgμL)보다 약 1,000-10,000 배 낮은 농도에서 사용 상대적으로 낮은 pCAG - Cre 호텔의 농도). </li></ol> 3. 망막 사출 및 Electroporation 프로토콜 <ol><li> P5 세 이상 쥐가 마취제 (4.28 MG / ML), xylazine (0.82 MG / ML)의 칵테일의 intraperitoneal 주사 (0.7 ML / kg)과 anesthetized하는 동안 출생 후의 일 P5의 새끼 0 (P0)는 저체온증으로 anesthetized 아르 하고, acepromazine (0.07mg/ml) 14. </li><li> 뜨거운 비드 살균기의 모든 수술기구 및 전극 팁 소독. 눈에 열 손상을 방지하기 위해 사용하기 전에 멸균 생리에 모두 연속적으로 냉각. </li><li> 절개 범위와 위치에 따라 인젝터 플레이스 마우스. </li><li> P14 (눈 열기 전에)보다 어린 생쥐의 경우, 수술 해부 마이크로 스프링 가위 B와 함께 미래를 여는 눈꺼풀의 전체 길이에 따라 절단하여 눈꺼풀을 엽니다. </li><li> 눈알 부분적으로 부드럽게 포셉 C의 도움말로 눈 주위에 압력을 적용하여 내다합니다. </li><li> 부드럽게 안구 주변의 피부를 곤란하게하여 장소에 시선을 잡아. </li><li> micromanipulator를 조정하고 안구에 가까운 피펫을 가지고. </li><li> 사출 솔루션의 몇 방울을 추방하기 때문에 피펫이 막힌 아니라는 것을 확인 Nanoinject II 시스템에 연결되어 보도 풋 페달. </li><li> 눈알을 안정화 한손으로, 유리 피펫의 끝은 망막 안료 상피를 통해 피어와 망막를 입력 이러한 micromanipulator 이동합니다. </li><li> 데스을 주사Nanoinject II 시스템을위한 발 페달을 눌러 솔루션을 ired 금액입니다. 예를 들어, 우리는 2.3 - 4.6nL의 단일 주사를 단일 RGCs 레이블을합니다. </li><li> 피펫을 접어야 조심스럽게 사출 현장에 직접 전극 팁을 배치하고 회로를 작성하여 눈을 electroporate에 자극기를위한 발 페달을 놓으면 되죠. 우리는 일반적으로 25V 강도, 50msec 기간, 간격 1sec의 설정을 사용하여 사각형 펄스를 사용합니다. 10 펄스 (각 극성의 5 펄스)이 P4보다 오래된 6 펄스 (각 극성 3 펄스)가 P3 마우스로 P0에 대해 적용되는 생쥐에 대해 적용됩니다. </li><li> 부드럽게 소켓에 다시 눈알을 밀고 컷 눈꺼풀 이상 살균 안과 연고를 적용합니다. </li><li> 온도 제어 열 패드 및 적절한 rewarming와 이동성을 포함하여 완벽한 복구에 플레이스 동물은 그들의 어머니 동물을 반환합니다. </li><li> 동물에게 이러한 이동성의 손실, 신랑에 비정상적인 자세 또는 실패로 고통, 고통 또는 불편의 흔적을 위해 매 12 시간 모니터링합니다. 마취, 주사 및 electroporation의 반복 도는이 같은 동물에서 수행해서는 안됩니다. </li></ol> 4. 노트 <ol><li> 이 동영상에서 설명하는 주입의 방법은 &#39;맹인&#39;주입니다. 그것은 흰둥이 마우스 및 색상 솔루션 (DiI 또는 빠른 푸른 미량의와 플라스미드 용액)로 작업할 때 주입의 양과 위치를 시각화 할 수 있습니다. 그러나, 색소 쥐 종자와 함께 사출 위치 직접 시각되지 않을 수 있으며, 따라서 그것은 구두로 한 의도 망막 위치를 도달하거나 얼마나 하나가 특별히 RGC 계층을 대상으로 피펫으로 이동할지 여부를 설명하기가 어렵습니다. 따라서, 우리는 강력하게 이러한 주사는 망막에 즉시 시각 될 수 있기 때문에 첫번째 흰둥이 마우스의 DiI 주사와 함께 시작하는 새 사용자를 조언하고 RGC 망막에 투영 및 두뇌의 상표는 사출의 품질을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 초점 주사에 대한 N에서 10 % DiI, N - Dimethylformamide (100 %)를 준비합니다. 일단이 절차가 마스터는 사용자가 지속적으로 색소 생쥐의 명확한 DNA 플라스미드 솔루션 RGCs를 타겟팅할 수 있어야합니다. </li><li> 이 동영상에서 설명하는 주입의 방법은 retinotopy (4.6nL 라벨 몇 백 RGCS) 14을 공부하고 복합 fluorophores (Alexa555, 488 등)와 함께 대량 레이블 RGCs로하는 세포의 작은 인구를 라벨에 초점 DiI 주사를 만들기 위해 사용할 수 있습니다 콜레라 독소의 subunit B는 위의 10 electroporation 단계 제외한 눈 특정 분리를 연구하기 위해 서요. 모든 솔루션의 P14 미만 마우스에 대한 P14 1 - 2uL보다 나이가 생쥐를위한 2 - 3uL의 최대한의 총 주사 량을 권장합니다. </li><li> Pipettes는 인젝터에 피펫을 장착하고 팁을을 깨고 전에 광유와 backfilling하여 주입을 따라하는 솔루션 backfilled 수 있습니다. 피펫의 팁을에서로드하는 것은 매우 점성하고 어려운 일반적으로 높은 농도의 DNA 솔루션 (~ 6ug/uL), 사용할 때 특히 유용합니다. </li><li> 유리 피펫은 막힌되면, 염료 (DiI) 솔루션을위한 DNA 솔루션과 에탄올 (100 %) 물에 젖었을 면봉으로 피펫 팁을 조심스럽게 닦으십시오. </li><li> 눈에 주입 후 안구의 피펫 팁을 철회하고 다시 삽입하기 위해 발 페달을 누르십시오. 이것은 팁는 사출 과정에서 막힌 못 있는지 확인하는 것입니다. 어떤 해결 방법이 적절하지 않으면, 그것은 분사가 성공적으로 완료되지 않은 것을 매우 가능성이 높습니다. 그러나, 이것은 주사가 성공적으로 완료되지 않은 것을 절대 기호로 이동해서는 안됩니다. 여러 분사 사이트와 세포의 큰 숫자 라벨이 원하는 경우 실험자 다시 같은 눈을 주입 수 있습니다. </li><li> 단일 RGCs을 라벨 들어, Nanoinject 제어 상자에서 속도를 사출 속도를 설정합니다. 이것은 더 이상은 유리 pipettes의 동시 끝에이 안구에서 신속하게 철회하는 동안 시스템이 솔루션을 하는걸이 설정에 더 많은 시간을 소요로 망막에 주입 용액의 양을 줄여줍니다. </li><li> 그것이 (이것은 복구의 몇 일 후에 확실한되고, 눈이 정상보다 명백히 작은 경우) 눈에 손상을 매우 쉽게되어 있기 때문에 출생 후의 오늘의 Electroporation 0으로 3 (P0 P3)을 마우스 추가 관리가 필요합니다. 적용 및 전압 펄스의 수를 줄이는 것은 조기 신생아 생쥐에 대한 것이 좋습니다. P4 후, 눈알은 electroporation 피해에 더 탄력있다. </li><li> EGFP 또는 RFP 우리의 경험을 막 타겟 버전에서는 ( &#39;gapEGFP&#39;가, 12 참조) 뇌로 retinofugal 계획을 조사를 위해 수정되지 않은 GFP보다 훨씬 월등합니다. 그러나, 수정을 대상으로 막을 부족 pCAG - tdTomato는 또한 잘 작동 (그림 1E). 또한, dextran 복합 형광 염료는 위에서 설명한 electroporation 프로토콜을 사용하여 레이블 RGCs하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로, 10 주사 9 밖은 듀얼 플라스미드 방식으로, 표시 RGCs에 주사의 생각만이 약 15 %를 이끌 것이다표시되는 단 하나의 RGC의 결과. 성공적으로 가지 경우의 수는 한 눈에 여러 위치에 DNA를 주사하거나 각각의 눈 안으로 다른 형광 단백질을 인코딩 plasmids 주입을 증가 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 RGC 라벨은 electroporation 후 24 시간에 의해 RGCs에서 EGFP 라벨과 P2에서 P25에 이르기까지 모든 연령대에서 준수하고 transfection 후 최소한 세 주 동안 표정을 유지했다. 찬란 분류 dendrites (그림 1A, B)와 단일 RGCs의 axonal 아보스 (그림 1 층)은 명확하게 시각 및 복원하실 수 있습니다. 외에도 RGCs에서이 기술은 같은 수평 세포, 양극 세포 및 다양한 amacrine 세포 subtypes (그림 1C) 등 다른 망막 세포 유형을 분류하는 데 사용할 수 있습니다 이 방법은 SC (그림 1E)에서 정상 retinotopy에 의해 입증 시각적인지도를 다듬 는다 정상적인 시간 과정을 방해하지 않습니다. 모든 연령대에서에서 가지 경우 90 %, pCAG - gapEGFP의 작은 볼륨 분사 (~ 2.3 - 4.6nL)는 몇 RGCs (그림 1D)에 표현되었다. RGCs (그림 1A, B, D)와 같은 amacrine 같은 다른 세포 유형을 포함하는 하나의 망막 신경 세포의 라벨에 LED pCAG - Cre 호텔과 동물마다 pCAG - LNL - gapEGFP 조합 plasmids의 단일 주사를 사용하여 실험의 약 15 %에 세포 (그림 1C). <img src="/files/ftp_upload/2678/2678fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 - A, EGFP의 B. 예를 게시할 수 - 나탈 일 14 일 (P14)에서 평면 마운트 망막에있는 하나의 망막 신경절 세포를 (애로우 헤드가 축삭을 가리키는) 표시 P8에서 단일 스타 버스트 amacrine 세포의 C. 예 D.. . 오른쪽 눈이 인치 E. 도설 및 복부 RGCs P14에서 평면 마운트 망막에 RGCs 및 amacrine 세포를 포함하여 EGFP 분류 망막 뉴런의 클러스터는 electroporated와 EGFP와 왼쪽 눈 관자놀이와 복부 RGCs으로 표시 전기되었으며되었습니다 P1에서 tdTomato으로 표시. 라벨 RGCs에 의해 형성된 대상 지역 (별표)는 자신의 topographically 정확한 P9에서 SC의 위치 (전체 마운트, 흰색 개요)에서 볼 수 있습니다.에서는 RGC 아버 (2 - D 투영)라는 하나의 EGFP의 F. 예은 SC의 화살 섹션 (250 μm의 두께) (점선). 지혜로움에 대해에 이미지 (D)와 (F) 변환되었습니다 그레이 스케일과 반전합니다. 스케일 바 (μm의) : (A) - (D), (F) : 100, (E) : 500

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 비디오에서 우리는 생체내의 electroporation 프로토콜에을 입증되는 형광 단백질을 인코딩 DNA 구조와 출생 후의 생쥐의 망막 뉴런의 단일 또는 작은 클러스터의 라벨을 초래합니다. 이전 연구 그 electroporation 정상 RGC 축삭 아버 상세 검색을 방해하지 않았 의미, lipophilic 염료와 RGC 라벨을 사용하는 것과 dLGN와 SC에 찬란 분류 RGC 예측의 작은 클러스터는 유사한 프로젝션 패턴을 재현. ?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 자료 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 더몬트 # 5 포셉 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> 전기 자극기 </td><td> 그라스 악기 </td><td> 모델 S4 </td></tr><tr><td> 오실로 스코프 </td><td> 애질런트 </td><td> 모델 54621A </td></tr><tr><td> 오디오 모니터 </td><td> 그라스 악기 </td><td> 모델 AM8B </td></tr><tr><td> 끌어당기는 것 </td><td> 서터 인 스트 루먼트 </td><td> 모델 P - 97 </td></tr><tr><td> Vannas 가위 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 14,003 </td></tr><tr><td> 마이크로 가위 B </td><td> 테드 펠라 </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> 더몬트 AA 집게 C </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> II 시스템 Nanoinject </td><td> 드루먼드 과학 </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> 유리 Pipettes </td><td> 드루먼드 과학 </td><td> 3 - 000-203 - G / X </td></tr><tr><td> 풋 페달 </td><td> 드루먼드 과학 </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> 미네랄 오일 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DiI </td><td> Invitrogen </td><td> D - 383 </td></tr><tr><td> N, N - Dimethylformamide </td><td> 시그마 </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation

midbrain에 RGC 예측의 대상 및 개선 개발하는 동안 신경 연결 양식의 방법은 정확한 패턴을 공부에 대한 인기있는 강력한 모델 시스템입니다. 생쥐에서 retinofugal 전망은 시상 및 우수 Colliculus (SC)의 래터럴 Geniculate 핵의 지형 방식과 양식 눈 특정 레이어 (dLGN)에 정렬됩니다. retinofugal 예측 이러한 정확한 패턴의 개발은 일반적으로 같은 양고추냉이 퍼옥시데이즈 1-4로 형광 염료와 추적기와 RGCs의 인구를 분류하여 연구되었습니다. 그러나 이러한 방법은 retinotopic지도 형성의 기초있는 개별 RGC axonal 아버 형태의 발달 변화에 대한 통찰력을 제공하기 위해 너무 거칠어. 또한 RGCs의 유전자 조작에 대한 허용하지 않습니다. 최근 electroporation은 망막 5-11로 청구 분자의 제공을위한 정확한 공간과 시간적 제어를 제공하는 효과적인 방법이되었다. 현재 망막 electroporation 프로토콜은 유전자 조작을 허용하고 출생 후의 생쥐에 RGCs의 단일 또는 작은 클러스터의 retinofugal 예측을 추적하지 않습니다. 그것은 생체내의 electroporation에 출생 후의이 상표 효율이 매우 낮은이기 때문에 RGCs를 transfecting위한 가능한 방법이 아니므로 그러므로 RGC progenitors가 분화 및 증식 6 겪고 아르 배아 연령 타겟팅에 필요하다는 주장했습니다. 이 비디오에서 우리는 타겟 유전자의 전달, shRNA, 및 postnatally murine RGCs에 형광 dextrans에 대한 생체내의 electroporation 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 분기, 라미네이션, 재생 및 회로 개발의 다양한 단계에서 버렸네 형성, 축삭의 철회를 포함한 신경 발달의 여러 측면에 관련된 후보 유전자의 효율적인 심사를위한 빠르고 효율적인 비용과 상대적으로 쉬운 플랫폼을 제공합니다. 요약 우리는 여기에 감각지도 개발을 기본 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 것입니다 가치있는 도구를 설명합니다.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

우리는를 보여<em&gt; 생체내에</em망막 신경절 세포 (RGCs)과 연령대의 넓은 범위에서 출생 후의 생쥐의 다른 망막 세포 유형의 단일 또는 소규모 클러스터를 transfecting위한&gt; electroporation 프로토콜. 라벨과 유전 출생 후의 RGCs를 조작하는 능력<em&gt; 생체내에</em&gt; 발달 연구를위한 강력한 도구입니다.

마우스 망막 신경절 세포 Transfection로 생체내에 Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

15.4K 조회수.  Yale University. 우리는를 보여 생체내에 electroporation 프로토콜. 라벨과 유전 출생 후의 RGCs를 조작하는 능력 생체내에 발달 연구를위한 강력한 도구입니다.

비디오: Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

연구

신경과학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송<em&gt; VIVO에서</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 생물 발광 상영

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

광학 일관성 단층 촬영: 마우스 망막 신경 절 세포에서 Vivo에서 화상 진 찰

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...