El plásmido pCAG-gapEGFP fue un regalo del doctor S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plásmido fue un regalo del doctor Feller M. (Berkeley, CA). Agradecemos al Dr. Edward Ruthazer por sugerir el uso de una estrategia de dos plásmidos para el etiquetado de células individuales y Schohl Anne (Montreal, QC) para validar los dos plásmidos Cre / loxP estrategia en los estudios piloto y los miembros de Crair de laboratorio para soporte técnico. Con el apoyo de R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) y NIH P30 EY000785 (MC).

1. Instalación del equipo de electroporación <ol><li> Electrodos: Hemos modificado Dumont # 5 pinzas para su uso como electrodos. <ol><li> Separado y se separan las pinzas. </li><li> Soldar un cable en el extremo más ancho de cada diente. Envuelva el cable conectado y puntas con cinta aislante dejando aproximadamente 25-30 mm de la punta de los dientes expuestos. </li><li> Ponga las pinzas modificado de nuevo junto con los espaciadores plásticos adecuados (por ejemplo un botón) entre las dos puntas para proporcionar una acción de resorte. </li></ol></li><li> Equipo eléctrico: Utilizamos un estimulador eléctrico para entregar pulsos de corriente de electroporación y un monitor de osciloscopio y de audio para confirmar la forma de onda y el número de pulsos que se entregó. <ol><li> Conecte el cable de una punta de la pinza de un pedal de pie que también está conectado en serie con el estimulador. El pedal actúa como un interruptor. Cuando se pulsa se cierra el circuito para la electroporación. </li><li> Conecte el cable de la otra punta del estimulador eléctrico. </li><li> Conecte el estimulador en el osciloscopio y el monitor de audio. </li></ol></li><li> Micropipeta y el inyector de configuración: Usamos fuerte tiró pipetas de vidrio y el sistema de Nanoinject II inyector para inyectar volúmenes muy pequeños de tinte o solución de ADN directamente en la retina. <ol><li> Monte sistema de inyección en un micromanipulador de 3 ejes. </li><li> Tire de pipetas de vidrio con una vela larga y pequeña propina. </li><li> Volver llenar la pipeta tiró con aceite mineral y seguro a los inyectores (para más detalles véase el manual de instrucciones Nanoinect II). </li><li> Utilizando unas tijeras afiladas microdissecting un corte de la punta de la pipeta, la creación de una pequeña abertura (~ 3.2 m). </li><li> Llenar la pipeta con la cantidad deseada de la solución de inyección a través de la punta de la pipeta. Siempre y cuando la integridad de la punta se mantiene, se puede utilizar para múltiples inyecciones y los animales. Nota: i) Velar por la solución de inyección de suficiente carga en la punta de tal manera que el aceite mineral rellenadas no se inyecta en el ojo. ii) El Nanoinject II del sistema y el equipo específico electrónicos que se utilizan en este video no son críticos para lograr el éxito de etiquetado de la CGR. Inyecciones realizadas con otros dispositivos, como un picospritzer y electroporación con otros estimuladores común también se puede utilizar para CGR etiqueta. </li></ol></li></ol> 2. Soluciones para el etiquetado plásmido RGC <ol><li> Para el etiquetado de pequeños grupos de la CGR: Utilizamos una construcción codificación EGFP (~ 3.2 g / l) la mejora de la proteína fluorescente verde) bajo el control de un promotor CAG (β-actina de pollo con un promotor de CMV inmediata principios potenciador). EGFP está marcado con la secuencia palmitoilación de GAP-43 (el crecimiento de la proteína asociada a-43) dirigidas a la membrana celular (mut4EGFP) 12. Esta construcción se conoce como pCAG-gapEGFP. </li><li> Para el etiquetado sola célula: Utilizamos una combinación de dos construcciones. El primer vector es un promotor CAG de conducción de la recombinasa Cre (Cre-pCAG, Addgene [Cambridge, MA] plásmido 13775) 13 y el segundo vector contiene una cinta de parada floxed seguido por una membrana dirigidos EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) se utiliza a una concentración de aproximadamente 1.000-10.000 veces más bajos que pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL), limitando la expresión EGFP fuerte a un pequeño número de células (en virtud de la relativamente baja concentración pCAG-Cre). </li></ol> 3. Inyección de la retina y el Protocolo de electroporación <ol><li> Después del día 0 (P0) a los cachorros P5 son anestesiados por hipotermia, mientras que los ratones de más de P5 se anestesian con una inyección intraperitoneal (0,7 ml / kg) de un cóctel de ketamina (4,28 mg / ml), la xilazina (0,82 mg / ml) , y acepromacina (0.07mg/ml) 14. </li><li> Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y puntas de los electrodos en un esterilizador de cuentas en caliente. Posteriormente, tanto fresco en solución salina estéril antes de su uso para evitar daños térmicos en los ojos. </li><li> Coloque el ratón en un ámbito de la disección y la posición del inyector. </li><li> Para los ratones más jóvenes que P14 (antes de abrir los ojos), cirugía del párpado abierto cortando a lo largo de toda la longitud de la apertura de los párpados futuro con micro primavera disección b tijeras. </li><li> Hacer que el globo ocular sobresale parcialmente ejerciendo una suave presión alrededor de los ojos con la punta de unas pinzas c. </li><li> Mantener el ojo en su lugar con cuidado pellizcar la piel alrededor del ojo. </li><li> Ajuste micromanipulador y llevar la pipeta cerca del globo ocular. </li><li> Presione el pedal, el cual está conectado al sistema de Nanoinject II, para expulsar a unas pocas gotas de solución de la inyección y por lo tanto verificar que la pipeta no esté obstruido. </li><li> Con una mano la estabilización del globo ocular, mueva el micromanipulador de tal manera que la punta de la pipeta de vidrio atraviesa el epitelio pigmentario de la retina y entra en la retina. </li><li> Inyectar desired cantidad de solución presionando el pedal de pie para el sistema de Nanoinject II. Por ejemplo, para etiquetar CGR solo hacemos una sola inyección de 2,3 4.6nL. </li><li> Retractarse de la pipeta y se coloca cuidadosamente puntas de los electrodos directamente sobre el sitio de la inyección y presione el pedal de estimulador para completar el circuito y electroporar el ojo. Por lo general usan pulsos cuadrados con la configuración de la fuerza de 25V, 50msec duración, 1 segundo de diferencia. 10 pulsos (5 pulsos de cada polaridad) se aplican a ratones pulsos mayores de P4 y 6 (3 pulsos de cada polaridad) se aplican a ratones para P0 P3. </li><li> Empuje suavemente ojo de nuevo en el zócalo y aplicar el ungüento oftálmico estéril sobre los párpados cortados. </li><li> Animales a cabo en una plataforma de temperatura controlada de calor y en la recuperación completa, incluyendo el recalentamiento adecuado y la movilidad, el retorno de los animales a su madre. </li><li> Observar a los animales cada 12 horas para detectar cualquier signo de dolor, angustia o malestar, como la pérdida de la movilidad, postura anormal o falta de preparación. Ciclos repetidos de la anestesia, las inyecciones y la electroporación no se debe realizar en el mismo animal. </li></ol> 4. Notas <ol><li> El método de la inyección se describe en este video es un &quot;ciego&quot; de la inyección. Es posible visualizar la cantidad y localización de la inyección cuando se trabaja con ratones albinos y soluciones de color (DII o solución de plásmido con trazas de azul más rápido). Sin embargo, con las cepas de ratones pigmentados el lugar de inyección no pueden verse directamente y por lo tanto es difícil de describir verbalmente si se ha llegado a la ubicación de retina previsto o hasta dónde se debe mover la pipeta para orientar la capa de CGR en particular. Por lo tanto, le recomendamos los nuevos usuarios a empezar primero con inyecciones de DII en ratones albinos ya que estas inyecciones pueden ser visualizados inmediatamente en la retina y el etiquetado de las proyecciones de RGC a la retina y el cerebro se puede utilizar para evaluar la calidad de la inyección. Prepare un 10% en DII N, N-dimetilformamida (100%) para inyección de actividad. Una vez que los usuarios de este procedimiento es dominado debe ser capaz de dirigirse constantemente CGR con las soluciones de ADN plásmido en claro los ratones pigmentados. </li><li> El método de la inyección se describe en este vídeo se puede utilizar para hacer focal inyecciones DII para etiquetar pequeñas poblaciones de células para estudiar retinotopy (4.6nL etiquetas de unos pocos cientos de CGR) 14 y CGR etiqueta a granel con fluoróforos (Alexa555, 488, etc) conjugado con la toxina del cólera subunidad B para el estudio del ojo específicos de la segregación, la exclusión de la etapa de la electroporación en el # 10. Un volumen máximo de inyección total de 2-3UL para los ratones mayores de P14 y un 2UL-de los ratones más jóvenes que P14 de cualquier solución es recomendable. </li><li> Pipetas pueden ser rellenados con las soluciones a inyectar seguido por el relleno con aceite mineral antes de montar la pipeta en el inyector y romper la punta. Esto es especialmente útil cuando se utilizan soluciones de alta concentración de ADN (~ 6ug/uL), que son en general muy viscoso y difícil de cargar desde la punta de la pipeta. </li><li> Si la pipeta de vidrio se tapa, limpie cuidadosamente la punta de la pipeta con un algodón empapado en agua para las soluciones de ADN y el etanol (100%) para el tinte (DII) soluciones. </li><li> Después de inyectar en el ojo, retirar la punta de la pipeta del globo ocular y pulse el pedal para inyectar de nuevo. Esto es para confirmar que la punta no se obstruyen durante el proceso de inyección. Si no hay solución se dispensa, es muy probable que la inyección no tuvo éxito. Sin embargo, esto no debe ser tomado como una señal absoluta de que la inyección no se ha realizado correctamente. El experimentador puede inyectar el ojo mismo de nuevo si los sitios de inyección múltiple y el etiquetado de un mayor número de células que se desea. </li><li> Para el etiquetado de CGR solo establece la velocidad de inyección para reducir en la caja de control Nanoinject. Esto reduce aún más la cantidad de solución se inyecta en la retina como el sistema tarda más tiempo en esta opción para prescindir de la solución y al mismo tiempo la punta de las pipetas de vidrio se retractó rápidamente del globo ocular. </li><li> Electroporación de días después del parto 0 a 3 (P0 a P3) los ratones requiere un cuidado adicional, ya que es muy fácil dañar el ojo (esto se hace evidente a los pocos días de recuperación, cuando el ojo se puede demostrar más pequeñas de lo normal). Reducir el número de pulsos y la tensión aplicada es aconsejable para principios de ratones recién nacidos. Después de P4, los globos oculares son más resistentes a los daños de la electroporación. </li><li> En nuestra experiencia de versiones específicas de la membrana EGFP o RFP (&quot;gapEGFP, véase 12) son muy superiores a las buenas prácticas agrarias sin modificaciones para el examen de las proyecciones retinofugal al cerebro. Sin embargo, pCAG-tdTomato, que carece de una membrana objetivo modificación, también funciona bien (Figura 1). Además, el dextrano conjugado fluorescente colorantes también se puede utilizar para CGR etiqueta utilizando el protocolo de electroporación descrito anteriormente. </li><li> Por lo general, 9 de cada 10 inyecciones llevará a CGR etiqueta, aunque sólo el 15% de las inyecciones con el enfoque de doble plásmido sellegar en cuestión de RGC solo se está etiquetando. El número de casos de éxito se puede aumentar mediante la inyección de ADN en múltiples lugares en un ojo o mediante la inyección de plásmidos que codifican distintas proteínas fluorescentes en cada ojo. </li></ol> 5. Resultados representante RGC etiquetado se observó en todas las edades, que van desde P2 a P25, con el etiquetado de EGFP en CGR por 24 horas después de la electroporación y mantenido la expresión de al menos tres semanas después de la transfección. Dendritas marcados con fluorescencia (Figura 1 A, B) y pérgolas axonal (Figura 1 F) de la CGR solo se puede visualizar claramente y reconstruido. Aparte de la CGR, esta técnica puede ser utilizada para etiquetar otros tipos de células de la retina, como las células horizontales, células bipolares y diversos subtipos de células amacrinas (fig. 1C) Este método no interfiere con el transcurso del tiempo normal de refinamiento mapa visual, como lo demuestra retinotopy normal en el SC (Figura 1). En todas las edades, en un 90% de los casos, una inyección de pequeño volumen (~ 2,3 4.6nL) de pCAG-gapEGFP llevado a su expresión en una pocas CGR (Figura 1D). En aproximadamente el 15% de los ensayos con una sola inyección de la pCAG-Cre y pCAG-LNL-gapEGFP plásmidos combinación por animal, dirigido al etiquetado individual de neuronas retinianas incluyendo CGR (Figura 1 A, B, D) y otros tipos de células como amacrinas las células (fig. 1C). <img src="/files/ftp_upload/2678/2678fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 - A, B. Ejemplos de EGFP etiqueta solo las células ganglionares de la retina (cabeza de flecha apuntando al axón) en una retina plana de montaje en el post-natal el día 14 (P14) C. Ejemplo de célula amacrinas estelar en P8 D.. . Un grupo de EGFP etiqueta neuronas de la retina incluyendo CGR y las células amacrinas de la retina plana de montaje en P14. CGR E. dorsal y ventral en el ojo derecho se electroporated y etiquetados con EGFP y CGR temporal y ventral en el ojo izquierdo galvanizado y se etiquetados con tdTomato en P1. Las zonas de destino (asteriscos) formado por la CGR etiqueta se puede ver en su ubicación topográficamente correcta en el SC en P9 (todo el montaje, esquema de color blanco). F. Ejemplo de una sola etiqueta EGFP RGC cenador (2-D de proyección) en un corte sagital (250 micras de espesor) de la SC (línea punteada). Para mayor claridad, las imágenes en (D) y (F) ha sido convertida a escala de grises y se invierte. Las barras de escala (m): (A) - (D), (F): 100 (E): 500

<ol>
	<li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields.">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li><li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinotopic+map+refinement+requires+spontaneous+retinal+waves+during+a+brief+critical+period+of+development.">Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development.</a> Neuron. 40, 1147-1160 (2003).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinogeniculate+and+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse.</a> J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).</li><li>Jaubert-Miazza, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+composition+of+the+developing+retinogeniculate+pathway+in+the+mouse.">Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse.</a> Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-+lapse+imaging+of+neuronal+development.">In vivo time- lapse imaging of neuronal development.</a> Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .</li><li>Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+ocular+gene+transfer.">Nonviral ocular gene transfer.</a> Gene Ther. 12, 843-851 (2005).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Plas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+proteins,+eye+patterning,+and+retinocollicular+map+formation+in+the+mouse.">morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse.</a> J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).</li></ol>

En este video se demuestra un protocolo de electroporación in vivo que se traduce en el etiquetado de los grupos individuales o pequeños de las neuronas de la retina en ratones postnatales, con construcciones de ADN que codifican las proteínas fluorescentes. Pequeños grupos de marcado con fluorescencia proyecciones CGR a la dLGN SC y reproduce patrones similares de proyección ya que estudios previos con el etiquetado de CGR con colorantes lipofílicos, lo que indica que la electroporación no inte...

<table border="1"><tbody><tr><th> Materiales </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinzas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Estimulador eléctrico </td><td> Grass Instruments </td><td> Modelo S4 </td></tr><tr><td> Osciloscopio </td><td> Agilent </td><td> Modelo 54621A </td></tr><tr><td> Monitor de audio </td><td> Grass Instruments </td><td> Modelo AM8B </td></tr><tr><td> Extractor </td><td> Sutter Instrumentos </td><td> Modelo P-97 </td></tr><tr><td> Vannas Tijeras una </td><td> Mundial de Instrumentos de Precisión </td><td> 14003 </td></tr><tr><td> Micro Tijeras b </td><td> Ted Pella </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> Dumont AA Pinzas c </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> Nanoinject II del Sistema </td><td> Drummond Científico </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Pipetas de vidrio </td><td> Drummond Científico </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Pedal </td><td> Drummond Científico </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> Aceite mineral </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DII </td><td> Invitrogen </td><td> D-383 </td></tr><tr><td> N, N-dimetilformamida </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation

La selección y el refinamiento de las proyecciones de RGC para el cerebro medio es un sistema modelo popular y de gran alcance para el estudio de cómo los patrones precisos de la forma de conectividad neuronal durante el desarrollo. En los ratones, las proyecciones retinofugal están dispuestos de una manera topográfica y la forma del ojo específicos de las capas del núcleo geniculado lateral (dLGN) del tálamo y el colículo superior (SC). El desarrollo de estos patrones precisos de proyecciones retinofugal típicamente ha sido estudiado por el etiquetado las poblaciones de la CGR con tintes fluorescentes y marcadores, como la peroxidasa de rábano picante 1-4. Sin embargo, estos métodos son demasiado gruesas para dar una idea de los cambios de desarrollo en cada morfología axonal RGC cenador que son la base de la formación del mapa retinotópica. Asimismo, no permitir la manipulación genética de la CGR. Recientemente, la electroporación se ha convertido en un método eficaz para proporcionar un control preciso espacial y temporal para la entrega de las moléculas cargadas en la retina 05.11. Los protocolos actuales de electroporación retina no permiten la manipulación genética y la localización de las proyecciones de retinofugal de un solo grupo o pequeño de la CGR en ratones postnatales. Se ha argumentado que después del parto en la electroporación in vivo no es un método viable para la transfección CGR desde el etiquetado de eficiencia es muy baja y por lo tanto requiere dirigidos a edades embrionarias cuando los progenitores RGC están experimentando la diferenciación y la proliferación de 6. En este video se describe un protocolo de electroporación in vivo para la entrega selectiva de genes, shRNA, y dextranos fluorescentes para CGR murino después del nacimiento. Esta técnica proporciona una solución eficaz, rápida y relativamente fácil de plataforma para la detección eficaz de los genes candidatos involucrados en varios aspectos del desarrollo neural como la retracción del axón, la ramificación, la laminación, la regeneración y la formación de sinapsis en las distintas etapas del desarrollo del circuito. En resumen, como se describe aquí una valiosa herramienta que ofrecerá nuevas perspectivas sobre los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo del mapa sensorial.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Se demuestra una<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporación protocolo para la transfección de grupos individuales o pequeños grupos de células ganglionares de la retina (CGR) y otros tipos de células de la retina en ratones postnatales en un amplio rango de edades. La capacidad de etiquetar y manipular genéticamente CGR postnatal<em&gt; In vivo</em&gt; Es una poderosa herramienta para los estudios de desarrollo.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

transfection-mouse-retinal-ganglion-cells-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

15.4K vistas.  Yale University. Se demuestra una In vivo Electroporación protocolo para la transfección de grupos individuales o pequeños grupos de células ganglionares de la retina (CGR) y otros tipos de células de la retina en ratones postnatales en un amplio rango de edades. La capacidad de etiquetar y manipular genéticamente CGR postnatal In vivo Es una poderosa herramienta para los estudios de desarrollo.

Video: Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Investigación

Neurociencias

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Transferencia de genes a la oreja del ratón en desarrollo por el interior<em&gt; En Vivo</em&gt; La electroporación

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Implementar Clamp dinámico con conductancias sinápticas y artificiales en células de ratón ganglionares retinianas

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etiquetado retrógrada de células ganglionares retinianas en adultos de pez cebra con tintes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

En Vivo Transferencia de genes a células de Schwann en el nervio ciático de roedores mediante electroporación

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografía de coherencia óptica: Proyección de imagen de ratón ganglionares de la retina las células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

Investigadora de axón mamífero de regeneración: En Vivo electroporación de ganglio de raíz Dorsal de ratón adulto

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Alineación de Fibergram OCT de Retina de Ratón con Imágenes Confocales

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Autor destacado: Avances en imágenes de retina in vivo y ex vivo para mejorar el diagnóstico y tratamiento del glaucoma 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Alineación de figramas de tomografía de coherencia óptica en luz visible con imágenes confocales de la misma retina de ratón

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Methods Article

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación