DOD W81XWH-1023年10月1日（ZJG）、システムおよび合成生物学のためのUCSFのセンター（ZJG）、NIH 5R21EB015088-02（YJ）およびNIH 1R21EB018044（ZJG＆YJ）からの助成金のP50のGM081879提供された資金。 DSはヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラムによる索引懲戒ポスドク研究フェローシップによってサポートされていました。

一価量子ドットの1。生産<ol><li>水相への有機からQDの相間移動<ol><li> 5ミリリットルのガラスバイアル中のクロロホルム400μlの有機相QDの1μMの溶液200μlに希釈する。 </li><li>きちんとしたmPEGチオール（CH 3 O（CH 2 CH 2 O）6、C 2 H 5 SH）の36μlの0.3 Mテトラブチルアンモニウムブロマイド（TBAB）クロロホルム溶液を400μlを混合し、/ NとOを振る。 </li><li> 0.2MのNaOH水溶液800μlを加え、30秒間振る。相間移動は、より密度の高い有機相上記の水相への着色粒子の移動によって示され、数分以内に起こる。 </li><li>粒子は、水相と有機相との間の第三相中で凝集した場合、のmPEGチオールとのインキュベーション時間を増加させる。水相が透明なままである場合、QDは、相間移動（ 図3Aを参照）しなかった。または、コンセントを増やす貧しい相間移動を緩和するステップ2でのmPEGチオールの比。 </li><li> （着色）水相を回復した後、1mlにセントリコンスピンカラム（30kDaの分子量カットオフ）で収集された量子ドットを集中。 </li><li> 30mMのNaClの液（pH8.0）を含む10mMトリス緩衝液で予め平衡化したセファデックスNAP10カラムに濃縮されたQD溶液を添加する。重力流によって溶出緩衝液1.5mlを持つ量子ドットを溶出する。 </li><li> 350nmでの吸収分光法と量子ドットの濃度を測定します。 </li></ol></li><li> MQDSの調製<ol><li>購入（または合成）ptDNA。このプロトコルは、シーケンスを使用して5&#39;-S 50（CT）10（ACTG）5 -3 &#39;（ 表1参照）。 </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> DNA </td><td> シーケンス </td></tr><tr><td> 5&#39;-S 50（CT）10（ACTG）5 </sub&gt; -3 &#39; </td><td> S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A、S S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A、S S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A、S CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACTGACTGACTGACTGACTG </td></tr><tr><td> 5&#39;-NH 2 - （CT）10（CAGT）5 -3 &#39; </td><td> NH 2 - / C6spacer / CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT </td></tr><tr><td> BG-DNA </td><td> BG-/ C6spacer / CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT </td></tr></tbody></table> 表1のDNA配列が生成し、ターゲットMQDSするために使用される。 <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> 30のNaCl（pH8の）を含む10 mMトリス緩衝液中で100 nMのQD溶液1mlを準備します。 </li><li>激しく撹拌しながら1分間水のQDに100 nMのptDNA液の賢明な500μlのドロップ追加。かき混ぜるまたは追加の9時間、シェーカー上に置きます。 注：ptDNAの2の比率：QDこれは理論的には1を生成する必要があります。しかし、実際の化学量論は完璧になることはありません - 通常の結果は1に近い。1.5。 1 ptDNAの比：1製造するために、QDを、ゲル電気泳動後、デンシトメトリーは、上記使用される既知の容積与えられたコンジュゲートの正確な比率を定量化することが必要である。 </li><li>分析用アガロースゲル上で実行するようにQD混合物の〜10μlのを削除します。また、（ステップ1.2.1）から水相中非抱合型QDの同様の濃度を削除します。 <ol><li> 〜2μを追加; 6×フィコールローディングバッファーのlは（溶液の密度を増加させる）と、近くに移行非共役対照レーンにおいて150 Vで15分間、ホウ酸ナトリウム緩衝液中の0.8％重量/容量アガロースゲル上で一緒に単一のバンドを、これらの二つのサンプルを実行するよく、共役量子ドットとレーン内の2つのバンドは（ 図2Bのジェルを参照）が見られる。 </li></ol></li><li>二つのバンドの相対強度を用いて非共役QD分率を算出する（ 図2Bの式を参照）。その後、量子ドットの数と一致するのに必要な100 nMのptDNA液の追加の体積を計算するために、その一部を使用しています。 </li><li>繰り返しますが、この計算されたボリュームまたはすべてのQDの完全な結合を示すゲル上の単一バンドに共役量子ドットの崩壊まで、もう一度1.2.5 1.2.3を繰り返します。 </li><li>共同10mMのトリス緩衝液中10mM（CO 2 H）CH 2 O（CH 2 CH 2 O）6 C 11 H 23 SH（カルボキシPEG6アルカンチオール）を100μlを追加上記で作製した共役MQDSに30のNaCl（pH8の）をntaining、10分間振とうする。 注：これらのPEGリガンドは、量子ドットの表面を不動態化する。より長いPEGは、量子ドットをより良い不動態化、しかし、それはまた、それらのサイズが大きくなります。疎水性アルカンチオール官能性相間移動のための疎水性の低いPEG-チオール使用されるよりも、合計で、量子ドットのために非常に高い親和性を有する。そのため、このステップは長すぎるかptDNAを続行することはできませんアルカン-PEG-チオールに置き換えられます。 〜30分間のインキュベーション後、DNAのかなりの部分は、量子ドット（ 図3B）から変位されているであろう。 </li><li>過剰なアルカンPEG-チオールを除去するために、溶出緩衝液（30mMのNaClを含有する10mM Tris緩衝液）で予め平衡化したセファデックスNAP5カラムにQD溶液0.5mlを加える。重力流によって溶出緩衝液1.0mlとMQDSを収集します。 </li><li>セントリコンスピンカラム（30 kDa）ので収集された量子ドットを濃縮する。ヶ月間、4℃で、これらのMQDS保管してください。 FRしないでくださいそれらをeeze。 注：チューブの底における着色ペレットが見られた場合、ドットが集約され、もはや使用可能性が高いしている。 </li></ol>ターゲティング（Benzylguanine-）DNAの2。生産<ol><li>アミン末端のDNAを生成したり購入してください。このプロトコルは、シーケンスを使用して5&#39;-NH 2 - （CT）10 - （CAGT）5 -3 &#39;（ 表1参照）。ポリ-CTリンカーは、糖衣の奥深くに埋もれ機能へのアクセス性を向上しますが、すべてのアプリケーションのために必要とされない場合があります。 DNA合成へのアクセスがある場合は、適切な5 &#39;アミノ修飾剤（5&#39;アミノ修飾因子C6）を使用してアミノ修飾DNAを産生する。 </li><li> 10 mg / mlの濃度で、乾燥ジメチルスルホキシド（DMSO）中のBG-N-ヒドロキシスクシンイミド（BG-NHS）を溶解する。 注：BG-NHSは、空気から水を吸収し、反応性NHS-エステルの加水分解につながり、特に、DMSO、ジメチルホルムアミド（DMF）のような吸湿性の溶媒中であろう。 BG-NHSは、最高のお店です乾燥剤を含む第2の容器内に、独自のバイアル内の粉末として-80℃でのD。バイアルを開く前に室温に温まる。代わりに、すぐに使い捨て用乾燥極性溶媒中にBG-NHSエステルをアリコートし、-80℃で凍結、あるいはステップ2.2におけるアミンDNAと完全に反応する。 </li><li> HEPES中でアミン末端DNA（4 - （2 - ヒドロキシエチル）-1 - ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液（pH 8.5）、水、ステップ2.1からDMSO中BG-NHSとを混合することによって反応する。 （CT）10 - - 20μlの0.5MのHEPES pHが8.5で緩衝化（CAGT）5 58μlの脱イオン水に典型的には2 mMのNH 2の2μlのDMSOに10 mg / mlのBG-NHSを20μl反応する。 1.5mlのマイクロチューブ内で反応を行う。反応が急速に進行し、NHS-エステル加水分解と競合しなければならないように素早く混ぜる。 </li><li>完全な混合を確実にするために5〜10分間超音波処理。 RTで〜1時間インキュベートする。 BGの化学量論比：DNAは、反応を完了させるために変更することができる。 </li><li&gt;は100mMトリエチルアミンアセテート（TEAA、pH7）でに標準NAP5カラムを用いて反応を脱塩。 </li><li> 30分かけて8％と95％のアセトニトリルの間でアセトニトリル（ACN）勾配：100mMのTEAAを実行して、逆相HPLCによって未反応アミン-DNAからBG-DNAを精製する。未反応のアミン-DNAはBG-DNAの前に溶出します。コニカルチューブ中のBG-DNA画分を収集する。 <ol><li>標準のオリゴヌクレオチド精製用のC 18のZORBAXカラムと、以下の勾配を使用します。 0→15分：8→30％ACN; 15→21分：30から90パーセントACN; 21→25分：90→8％ACN; 25→30分：8％ACN; </li></ol></li><li>液体窒素中で凍結し、収集したフラクションを凍結乾燥。脱イオン水中にDNAを再懸濁。残留TEAAを除去するためにさらに2回凍結乾燥、余分な注意が必要になります。残留TEAAは、より高い濃度では細胞に対して毒性であり得る。 </li><li>目の側面を洗って確認しながら、水中で凍結乾燥したBG-DNAを再懸濁電子管、および〜25μMの原液に希釈する。 4℃で分注し店。サンプルは、顕著な劣化なし〜9ヶ月間保存した。 </li></ol>一価量子ドットと3ラベリング生細胞<ol><li>任意に、カゼイン（0.5％）またはウシ血清アルブミン（BSA、1〜3％）のような試薬を用いた撮像実験に直前MQDSを不動態化する。 </li><li>全反射蛍光（TIRF）-qualityガラス上のSNAP-タグ付きタンパク質を発現する細胞をプレート。この実験では、SNAP-タグ付きNotch1受容体と高品質のガラス表面に発現するU2OS細胞株を使用しています。 </li><li>細胞はガラス（〜24時間）に装着した後、増殖培地を除去し、PBSで洗浄し、PBSの〜100〜150μlあるいは〜1μMのBG-を含む細胞培地で室温で10〜30分間、細胞をインキュベート上記のステップ2.6からのDNA。 </li><li> BGとのインキュベーション後、慎重にPBSまたは細胞培地で細胞を洗浄。目で〜5〜10分間細胞をインキュベート電子化MQDSは、ステップ1.2.9で生産（および必要に応じてステップ3.1で不動態化）。 </li><li>必要に応じて、結合していないMQDSを洗浄し、画像化と文化の両方のための適切な緩衝液/メディアに細胞を返す。溶液中の未結合のMQDSが分析中に検出できないようにバウンドMQDSに比べて非常に急速に拡散したとしてTIRFモードで画像化されるべきであった細胞については、最終洗浄段階は、多くの場合、不要であった。 </li></ol> 4。顕微鏡と分析<ol><li>画像TIRF顕微鏡を用いて細胞。 注：スコープは、分離可能な励起および発光フィルター、またはカスタムのQDフィルターキューブを持っている必要があります。 QDは、低波長レーザー（405または488 nm）を持つ最高の興奮している。異なる直径の量子ドットは、典型的には、大きなストークスシフトに関連した、特徴的な発光波長を持っている。 </li><li>生細胞の基底面を画像化しつつあるためMQDSの明るさ、TIRFの高いフレームレートで画像を収集。 注：別の方法として、単一分子ダイナミクスはFolloのことができますスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して他の焦点面で結婚。自動化された単一粒子追跡ソフトウェアを正確に明るく光安定MQDSを追跡する時、一般的に成功している。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

MQD設計のモジュール性は、実験的な柔軟性の度合いの増加を可能にする。例えば、MQDS各種の迅速複数の標的の同時イメージングを可能にする独特な色で製造することができる。一本鎖DNA標的配列は、タンパク質に糖12、脂質をMQDSを指揮し、13面ができます。酵素タグの数は、複数のターゲットが差をターゲットMQDSと同時に画像化することができるように、直交反応性を用意しています。 SNAPタグと標的化することに加えて、CLIPタグ、HALOタグを使用してMQDSおよびビオチン化タンパク質と標的タンパク質の標識化も成功した。このプロトコルは、これらのMQDSと生細胞上の表面受容体の特異的標識を示したが、プロトコルは簡単に​​別のコンテキストの数に適合させることができた。 定義された原子価でMQDSを製造する際に重要な方法論的な洞察が〜50ホスホロチオエート連結されていること塩基は量子ドットをラップ（したがって同時に結合する二つの分子を防ぐ）する必要があります。ポリ-S 50シーケンスは、再現可能かつ安定ライフテクノロジーズから605 nmの量子ドットを結合した。この製品は廃止されているが、立体排除戦略は異なるサイズ、形状、スペクトル特性を有する他のベンダーの同様の製品に一般化である。 ptDNA包装されたQDの効率および安定性は、QDの表面の化学的性質および構造に大きく依存する。そのため、プロトコルの成功は、量子ドットの商業的供給源や化学構造に依存する。このプロトコルの目的のために、差の三つの主要な点は、QDのさまざまな商業的供給源との間に存在する：相間移動のために必要な条件の違い;最初のPEG-チオールリガンドの強さの差はptDNAによる変位を妨げる可能性が、結合;露出したCdSeコアの量の差、どの缶ルのmPEGチオール相間移動条件下によるQDのクエンチング広告。 出版物のように、MQDSの生産のための最良の構造を持つQDは4-10 nmの545、585、605＆625 nmの（ 図2A）の発光スペクトルとライフテクノロジーズ社から購入したCdSe / ZnSのコア/シェル量子ドットである。 「ビビッド」製剤（545、605、 等 ）に基づいて、量子ドットは、MPEGチオールの添加によりクエンチし、この用途には適していません。アルドリッチ·海洋ナノテクからのQDはうまく動作しますが、より長い相間移動工程およびトリオクチルホスフィンオキシドによる前処理を必要とする。このプロトコルは、ライフ·テクノロジーズからのQDに最適化されています。 量子ドットをラップするために使用されるポリホスホロチオエート配列が標的に鎖がハイブリダイズしうる先の（ACTG）5の配列を含む、ネイティブ20-merのDNAテールで終了します。このシーケンスは、それが二次構造をほとんど有して、便利で、hybridiz残るPBS中で37℃でエド。 DNA合成へのアクセスがある場合、ptDNAはC 8カラムを使用して合成し、次いで逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により精製することができる。 ptDNAは、ネイティブ骨格と同等のオリゴヌクレオチドよりもHPLC上で、後に溶出する。私たちは通常、5 &#39;、DMTは精製後に私たちのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド上の保護基を残す。 ptDNA包装された量子ドットの不動態化は、通常、量子ドットのコロイド安定性を向上させ、大部分の実験的なアプリケーションのためにバックグラウンド結合を減少させるために必要とされる。プロトコルは、量子ドットを不動態化するPEG-レイヤーを使用しています。より長いPEGは両方とも大きいけれども、追加のPEGユニットを有するカルボキシPEGアルカンチオール（（CO 2 H）CH 2 O（CH 2 CH 2 O）12 C 11 H 23 SH は 、カルボキシ-PEG12アルカンチオール）は、有意に減少し、バックグラウンドを提供一般的に、より高価。カルボキシPEGアルカでコーティングMQDSねチオールリガンドは、例えば、リン酸緩衝食塩液および培養培地などの生理的緩衝液中で非常に安定している。 4℃でMQDSの長期保存（&gt; 8ヶ月）の有意な凝集またはptDNA剥離11を示さなかった。実験によっては、単独のQDのPEGの不動態化は必ずしも十分MQDSの非特異的結合を減らすことはありません。それは〜50％MQDSの見かけの流体力学的半径を増大しても、実質的に、使用前に20分間、3％BSAを含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で細胞とMQDS両方をインキュベートすると、細胞への非特異的結合を減少させる。 0.5％のカゼイン不動態化はさらに、非特異的結合を減少させるが、それは、BSAよりも大きい程度には明らかにサイズが大きくなります。 MQDSに相補的なDNA鎖の5 &#39;末端は、異なる生体分子の数の標的化可能にするために改変することができる。共有結合的にタンパク質を修飾するために利用可能確立された技術の数、lはあり一本鎖DNA（一本鎖DNA）とipids＆糖類。一本鎖DNAが細胞外に提示されている限り、それは、可溶性MQDSにアクセス可能である。上記の配列とMQDSは急速に細胞培養条件下でその相補的DNA鎖とハイブリダイズする。セルの厚さであり、負に帯電した糖衣上記の結合配列を高めるようにptDNAとターゲティング配列との間10-20xポリ - （CT）スペーサーは、標的に効果的に行うために必要とされる場合がある。このプロトコルのために、私たちは両方のMQDSにハイブリダイズし、共有結合的に迅速かつ特異的標識のためにSNAP-タグタンパク質に自分自身をリンクします（CAGT）5の相補配列とBG-DNAを作製することにしました。よくアミノ修飾オリゴヌクレオチドに他のNHS-エステルを結合するための同様のプロトコル機能。 単一分子イメージングのための標識の低密度は、典型的には、個別の分子を解決するために必要とされる。不動態化剤を含むPBS中〜0.5nmの最終的なMQD濃度良好な標的である。しかし、これらの高希釈を、時には下で標識細胞をもたらした。この場合は、標識の最適密度が観察されるまで、追加のMQDを添加することができる。 0.5 nMのMQD（ 図4B参照 ）、標的細胞の基底面で〜20 MQDSの取り付けをもたらしたSNAP-タグ付きヒトNotch1の場合には、&gt; 10 nMのMQDの濃度は、高密度のラベリング細胞を作り出した。 MQDSによる細胞標識はプレートされた細胞の密集度の非常に依存していた。過度にコンフルエント細胞は、その基底面にラベルを付けていない。 要約すると、一価およびモジュールのQDを生成する簡単な方法を説明した。これらMQDSライブU2OS細胞上のNotch受容体を画像化することによって実証されるように、生細胞イメージングの幅広い用途において有用性を見出す。 MQDSの適用は、この特定のケースに限定されるものではなく、潜在的に他のタンパク質、核酸、および酵素のような他の細胞標的のために拡張することができる。

生細胞上の単一分子のダイナミクスは、それらの生物学的機能に寄与する。単一分子蛍光イメージングは、細胞表面1,2,3上の単一分子のダイナミクスを研究するための一般的な手法です。しかし、これらの研究において、最も一般的に使用されるイメージングプローブは、いくつかの重要な欠点を有する。例えば、従来の有機色素および蛍光タンパク質は、典型的な生細胞イメージングの条件下で約10 5〜10 6光子の放出後に漂白、適度な明るさ、約10 5〜10 6 M -1 cm -1でを提供するが、光化学的に不安定である4,5。対照的に、半導体ナノ粒子、頻繁に呼び出される量子ドット（QD）は、10 6〜10 7 M -1 cm -1での範囲とphotobl前に10 7 -10 8放出された光子を超えること吸光係数で、かなり明るく、より安定である5 eaching。有機フルオロフォアの上QDの改善された明るさと光安定性が大幅に高速フレームレートで単一分子の観察を可能にし、上ではるかに長い6を軌道。 その利点と商業的利用にもかかわらず、いくつかの負債は、これらの強力な造影剤のために残っている。第一に、彼らは不十分目標と生体分子6の架橋をもたらし得る、原子価をターゲットに定義しました。第二に、彼らは一般的に、特定の混雑した細胞環境7への接近が制限され、大きな流体力学的サイズ（&gt; 20 nm）を持っている。第三に、彼らは、モジュール7をターゲットに限られている。いくつかの戦略は、これらの問題8,9,10に対処しようとしましたが、一般的に実装するために専門的な知識や試薬を必要としている。 これらの問題に対処するために、本発明者らは最近、小さな価を調製するための「立体排除」戦略を報告し、そしてモジュラー量子ドット11。量子ドットは、単一の長いホスホロチオエートDNA（ptDNA）ポリマーで包まれている。 ptDNAは、表面露出Zn原子とptDNAポリマーのホスホロチオエート基の間の複数のZn-Sの相互作用を介してQDの表面に結合する。シングルバウンドポリマーは、立体的に静電著しく、粒子の全体的なサイズ（約2nm）を増加させることなく、ポリマーの追加的な同等物の結合を除外している。全ての試薬は、製品が高収率で形成され、市販されており、プロセスは、精製のための唯一の脱塩工程を必要とする。シングルptDNA（MQDS）ドメイン（ 例えば 、ベンジルグアニン（BG）、ベンジルシトシン、またはハロゲン化アルキル）を標的とするベアリングの相補的DNA鎖に結合して包まれたら、ラベル、量子ドット。 これらの機能は、具体的には、遺伝的に、目的のタンパク質に融合されるSNAP、CLIP＆HALOのような酵素タグにMQDSをターゲットにしています。これは合成のためのプロトコルです、ターゲティング、および立体排除によって生成MQDSの生細胞イメージング。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="497">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:91px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">mQD Production:</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Phosphorothioate DNA:</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">(A*)x50-(ACTG)x5</td>
			<td style="width:71px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:91px;">Most DNA Synthesis companies</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Quantum Dots:</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">QDots 525, 585, 605 &#38; 625</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605)</td>
			<td style="width:91px;">Custom QD synthesis for QD625.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">QD610</td>
			<td style="width:71px;">Ocean Nanotech</td>
			<td style="width:119px;">QSP-610-10&#160;</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">QD 610 lamda</td>
			<td style="width:71px;">Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">731854</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Chloroform, 99.8%</td>
			<td style="width:71px;">ACROS</td>
			<td style="width:119px;">67-66-3</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Tetrabutylammonium bromide, 98.0%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">426288</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">mPEG thiol [2,5,8,11,14,17,20-Heptaoxadocosane-22-thiol], MW 354.5, 95%</td>
			<td style="width:71px;">Polypure</td>
			<td style="width:119px;">11156-0695</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">HSC11EG6CO2H&#160; [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H]</td>
			<td style="width:71px;">ProChimia</td>
			<td style="width:119px;">TH 003-m11.n6-0.1</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Boric Acid, 99.5%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0394</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Sodium Hydroxide, 99.0%</td>
			<td style="width:71px;">ACROS</td>
			<td style="width:119px;">S/4845</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sodium Chloride, 98%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">310166</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Agarose LE</td>
			<td style="width:71px;">U.S. Biotech Sources</td>
			<td style="width:119px;">G02PD-125</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459828</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">BG-DNA Production:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Amine DNA:</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">(CAGT)5-NH2</td>
			<td style="width:71px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:91px;">Most DNA Synthesis companies</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">(CAGT)5(T)40-NH2</td>
			<td style="width:71px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td style="width:91px;">Most DNA Synthesis companies</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">NHS-GLA-Benzylguanine</td>
			<td style="width:71px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">S9151</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8428</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">HEPES Buffer</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83264</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">NAP5 Column</td>
			<td style="width:71px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0853-01</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">C18 Column</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Mammalian Cell Culture &#38; Imaging:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Cell line expressing SNAP-tagged protein</td>
			<td style="width:71px;">New England Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">E9100S</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">McCoys 5A</td>
			<td style="width:71px;">UCSF Cell Culture Facility (?)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:91px;">Specific to U2OS culture</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">UCSF Cell Culture Facility (?)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:91px;">Specific to U2OS culture</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">UCSF Cell Culture Facility (?)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:71px;">Thermo-Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">155409</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:216px;">Matriplate 96-well plate</td>
			<td style="width:71px;">Brooks Life Science Systems</td>
			<td style="width:119px;">MGB096-1-2-LG-L</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">5% Alkali-soluble Casein</td>
			<td style="width:71px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70955</td>
			<td style="width:91px;">Not all caseins are the same</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">(Optional) DNA Synthesis Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">5&#8217; Amine modifier C6</td>
			<td style="width:71px;">Glen Research</td>
			<td style="width:119px;">Oct-06</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">dA-Thiophosphoramidite</td>
			<td style="width:71px;">Glen Research</td>
			<td style="width:119px;">10-700</td>
			<td style="width:91px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Analysis Software:</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">FIJI</td>
			<td colspan="3">http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">RyTrack.pro</td>
			<td colspan="3">http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Tracker</td>
			<td colspan="3">http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and targeting of monovalent quantum dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

有機から水相へのQDの相転移は、MQDSの製造のために重要であるが、コンディショニング及びQD固有の両方であり得る。セクション1.1における相転移は、 図3の最初の2つのバイアルのようにきれいな表示されます。転送がよりバイアル3のように表示された場合は、1つが異なる条件で再度試してみてください。 量子ドットは、それらが非包まれた量子ドットとは別にゲル上で移行する必要が負に帯電したDNAで被覆されている一度。コントロールとして開封された量子ドットの一定分量を使用して、第二の、より速く移動するバンドは、 図2Bの第一のゲルに見られるように、ptDNAを添加すると表示されます。 MQDSの完全な形成は、不動帯の損失、および図2Bの最後のゲルに見られるように、モバイル帯にその崩壊で実証されている。あなたのMQD産物の一部が開封された量子ドットから分離単一のバンドとして移動する場合は、あなたのMQDSは、一価およびrである<html>さらなるステップで使用するのにeady。 細胞標識は、選択した標的に特異的であるべきであり、タンパク質の発現レベルとMQD濃度に依存すべきである。 MQD濃度およびMQDパッシベーション両方の実証最適化は、多くの場合、どのようなアプリケーションに必要とされる。 図4Bは、0.5 nMのから10 nMの濃度範囲MQDSでSNAP-タグ付けされたNotch受容体を発現しているU2OS細胞を標識することを示しています。 <img fo:content-width="6in" width="600" alt="図1" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig1highres.jpg" /> 図1 MQDSの標的化モジュール。MQDSは、さまざまな標的化分子によって官能のssDNAにハイブリダイズする。ベンジルグアニン-連結されたDNAは、SNAP-タグ付き融合タンパク質をMQDSをターゲットにしています。その他の5 &#39;修飾とDNA配列は、他の生体分子のさまざまなMQDSのターゲティングを可能にする。/files/ftp_upload/52198/52198fig1highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img fo:content-width="6in" width="600" alt="図2" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig2highres.jpg" /> MQDSの生産のための図2のスキーム 。 （A）有機相QDはptDNAで包まれたmPEGチオール及びTBABで処理することにより水相に移し、カルボキシPEG6アルカンチオールで不動態化されている。代表TEM画像をそれぞれ、有機QD545、QD585、及びQD605です。 （B）実験的に上記二つのステップで量子ドットとptDNA間の相互作用の化学量論を決定するための方法。 1（QD：ptDNA）QD＆ptDNA化学量論は、経験的に、最終的な反応化学量論が1であるような濃度測定によって確認される。 ptDNAのモル数の初期値は、量子ドットの割合を乗じて：MQD、実際のボリュームのafことで調整<html> 1達成するために必要なモル数得TER共役：1共役を<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img fo:content-width="6in" width="600" alt="図3" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig3highres.jpg" /> 図3 MQDSの生産のための実験の詳細。（A）が成功の代表的な写真や相間移動に失敗しました。 QDは、視覚的に濃密有機相および低密度水相との間で転送する必要があります。不完全な相分離は、転写不良を示している。 （B）ptDNAアルカン-PEG-チオールに置き換えることができる。右ゲルデータはptDNAのかなりの割合が過不動態化による量子ドットから変位された反応を表している。es.jpg &quot;ターゲット=&quot; _ブランク」&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img fo:content-width="6in" width="600" alt="図4" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig4highres.jpg" /> 生細胞上の図4のラベリングSNAP-タグ付きタンパク質を、（A）図BG-目標とMQDとSNAP-タグ付き受容体の発現を実証し、添付ファイルおよびラベリング。 （B）は、さまざまなMQD濃度で構築SNAP-ノッチ-mCherryを発現する細胞の代表的なラベリング。 PEG12で不動態化MQDSはmCherryを、特定のラベルを示すと共局在。下部ラベリング密度（&lt;0.5 nM）を、一般に、単一粒子追跡のために好適である。スケールバーは10μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

生産と一価量子ドットの標的

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.4K ビュー.  University of California, San Francisco. We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications. 

ビデオ: Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

Quantum dots (QDs) are fluorescent semiconductor nanoparticles with size-dependent emission spectra that can be excited by a broad choice of wavelengths. QDs have attracted a lot of interest for imaging, diagnostics, and therapy due to their bright, stable fluorescence1,2 3,4,5. QDs can be conjugated to a variety of bio-active molecules for binding to bacteria and mammalian cells6.
QDs are also being widely investigated as cytotoxic agents for targeted killing of bacteria. The emergence of multiply-resistant bacterial strains is rapidly becoming a public health crisis, particularly in the case of Gram negative pathogens 7. Because of the well-known antimicrobial effect of certain nanomaterials, especially Ag, there are hundreds of studies examining the toxicity of nanoparticles to bacteria 8. Bacterial studies have been performed with other types of semiconductor nanoparticles as well, especially TiO2 9,10-11, but also ZnO12 and others including CuO 13. Some comparisons of bacterial strains have been performed in these studies, usually comparing a Gram negative strain with a Gram positive. With all of these particles, mechanisms of toxicity are attributed to oxidation: either the photogeneration of reactive oxygen species (ROS) by the particles or the direct release of metal ions that can cause oxidative toxicity. Even with these materials, results of different studies vary greatly. In some studies the Gram positive test strain is reportedly more sensitive than the Gram negative 10; in others it is the opposite 14. These studies have been well reviewed 15.
In all nanoparticle studies, particle composition, size, surface chemistry, sample aging/breakdown, and wavelength, power, and duration of light exposure can all dramatically affect the results. In addition, synthesis byproducts and solvents must be considered16 17. High-throughput screening techniques are needed to be able to develop effective new nanomedicine agents.
CdTe QDs have anti-microbial effects alone18 or in combination with antibiotics. In a previous study, we showed that coupling of antibiotics to CdTe can increase toxicity to bacteria but decrease toxicity to mammalian cells, due to decreased production of reactive oxygen species from the conjugates19. Although it is unlikely that cadmium-containing compounds will be approved for use in humans, such preparations could be used for disinfection of surfaces or sterilization of water.
In this protocol, we give a straightforward approach to solubilizing CdTe QDs with mercaptopropionic acid (MPA). The QDs are ready to use within an hour. We then demonstrate coupling to an antimicrobial agent.
The second part of the protocol demonstrates a 96-well bacterial inhibition assay using the conjugated and unconjugated QDs. The optical density is read over many hours, permitting the effects of QD addition and light exposure to be evaluated immediately as well as after a recovery period. We also illustrate a colony count for quantifying bacterial survival.

Nanoparticles such as semiconductor quantum dots (QDs) can be used to create photoactivatable agents for anti-microbial or anti-cancer applications. This technique shows how to water-solubilize cadmium telluride (CdTe) QDs, conjugate them to an antibiotic, and perform a bacterial inhibition assay based upon growth curves and plate count.

成長曲線とプレートカウントにより、量子ドットや細菌の毒性試験の可溶化とバイオ共役

Quantum dots (QDs) are fluorescent semiconductor nanoparticles with size-dependent emission spectra that can be excited by a broad choice of wavelengths. ...

生物工学

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the target site while minimizing deleterious effects to off-target sites. Magnetic cell targeting is an efficient, safe, and straightforward delivery technique. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and can be endocytosed into cells to render them responsive to magnetic fields. The synthesis process involves creating magnetite (Fe3O4) nanoparticles followed by high-speed emulsification to form a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) coating. The PLGA-magnetite SPIONs are approximately 120 nm in diameter including the approximately 10 nm diameter magnetite core. When placed in culture medium, SPIONs are naturally endocytosed by cells and stored as small clusters within cytoplasmic endosomes. These particles impart sufficient magnetic mass to the cells to allow for targeting within magnetic fields. Numerous cell sorting and targeting applications are enabled by rendering various cell types responsive to magnetic fields. SPIONs have a variety of other biomedical applications as well including use as a medical imaging contrast agent, targeted drug or gene delivery, diagnostic assays, and generation of local hyperthermia for tumor therapy or tissue soldering.

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

細胞標識および超常磁性酸化鉄ナノ粒子とターゲティング

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

細胞内ターゲティングアプリケーションのための固体脂質ナノ粒子（SLNs）

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

タンパク質 - 小分子標的薬のスクリーニングのための迅速かつ定量的蛍光法

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

細胞集積量の増加と腫瘍標的化の改善のためウイルス由来ペプチド修飾抗体複合体の初期評価

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with turn-key performance and microjoule-level pulse energy is used to seed the regenerative chirped-pulse amplifier. The amplifier is placed in airtight housing. It operates at room temperature and exhibits stable operation at a 5 kHz repetition rate, with a pulse-to-pulse stability less than 1%. By employing a 1.5 mm-thick beta barium borate crystal, the frequency of the laser output is doubled to 515 nm, with an average power of 70 W, which corresponds to an optical-to-optical efficiency of 70%. This superior performance makes the system an attractive pump source for optical parametric chirped-pulse amplifiers in the near-infrared and mid-infrared spectral range. Combining the turn-key performance and the superior stability of the regenerative amplifier, the system facilitates the generation of a broadband, CEP-stable seed. Providing the seed and pump of the optical parametric chirped-pulse amplification (OPCPA) from one laser source eliminates the demand of active temporal synchronization between these pulses. This work presents a detailed guide to set up and operate a Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier, based on chirped-pulse amplification (CPA), as a pump source for an optical parametric chirped-pulse amplifier.

A protocol for the operation of a high-energy, high-power optical parametric chirped pulse amplifier pump source based on an Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier is presented here.

20mJ、1ps Yb：YAGシンディスク再生アンプ

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. Atherosclerosis is also the leading cause of sudden death and myocardial infarction, instigated by unstable plaques that rupture and occlude the blood vessel without warning. Current imaging modalities cannot differentiate between stable and unstable plaques that rupture. Peptide amphiphiles micelles (PAMs) can overcome this drawback as they can be modified with a variety of targeting moieties that bind specifically to diseased tissue. Monocytes have been shown to be early markers of atherosclerosis, while large accumulation of monocytes is associated with plaques prone to rupture. Hence, nanoparticles that can target monocytes can be used to discriminate different stages of atherosclerosis. To that end, here, we describe a protocol for the preparation of monocyte-targeting PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs are self-assembled through synthesis under mild conditions to form nanoparticles of 15 nm in diameter with near neutral surface charge. In vitro, PAMs were found to be biocompatible and had a high binding affinity for monocytes. The methods described herein show promise for a wide range of applications in atherosclerosis as well as other inflammatory diseases.

This paper presents a method involving the synthesis and characterization of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles and the corresponding assays to test for biocompatibility and ability of the micelle to bind to monocytes.

アテローム性動脈硬化のイメージングのためのペプチド両親媒性分子ミセルの単球ターゲットの合成

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

粒子の合成機能 10 nm ポリマー コーティング金対象化、血管内皮細胞とドラッグデリバリー

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

対話型、患者固有のモデルを用いた脳深部刺激療法の神経繊維の管を対象と

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...