1。準備<ol><li>キシラジン - ケタミンソリューションを（ケタミンは、規制薬物である。詳細な記録が保持され、ソリューションは、安全、ロックされた場所に格納されている必要があります）を用意。 </li><li>機械を洗浄し、滅菌する。 </li><li>無菌剤で拭くし、滅菌紙タオルで覆うことにより、手術の領域を準備し、マイクロマニピュレーターを設定します。 </li></ol> 2。移植用細胞の調製<ol><li>細胞を100,000細胞の濃度/ E Lに再懸されるべきであると、のみ25万細胞をマウスごとに移植されているが、細胞の過剰は、シリンジのローディングの目的（セルを受信し、マウスあたり少なくとも30万のセルを用意）が必要です。 </li><li> 50 mlコニカルバイアルにHBSSで3回移植される細胞を洗浄する。最後のスピンの前に細胞を数える。 </li><li>ダウン最後のスピンの後、デカンテーションHBSSとペレットに達することから液滴を防ぐために下の位置に逆さまにバイアルをおきます。 </li><li> UV照射、滅菌キムワイプで内側の壁を乾かします。ペレットを乾燥させないでください。 </li><li>直立管を保持し、ゆっくりと非常に繊細にHBSSの半分の最終的な目的のボリュームで細胞を懸濁します。 </li><li>ピペットの先端にサスペンションの大部分をピペッティングし、全体の懸濁液がピペットチップになるまで、ピペッターのダイヤルを調整することで、総容積を測定します。これにより、所望の濃度のために必要とされるどれだけ多くのHBSSを教えてくれます。 </li><li> HBSSを添加することにより、所望の量にボリュームをもたらす。 </li><li>氷上に戻って置きます。彼らは2時間よりも長い間氷の上に存在する必要がある場合、細胞の生存を確認してください。 </li></ol> 3。手術と移植のためのマウスの準備<ol><li> 〜100μlの用量または同等の麻酔薬のケタミン（100mg/kg）とキシラジン（10mg/kgより少ない）の腹腔内注射によってマウスを麻酔。手術の準備から縫合まですべての手続きは30〜40分かかります。 </li><li> （オプション：識別を確実にするために、各マウスの尾に番号付け、色のテープを適用） </li><li>腰から首までマウスの背側領域をそぎ落とし、そして電気バリカンで正中線から両側2cmの、拡張。髪はできるだけ近くに（それは地域に何度も行くことが必要な場合があります）としてカットされるべきである。 </li><li>残りの毛を削除するには、ガーゼで脱毛クリーム（Nairさん）の薄層を適用すると、アプリケーターをひっくり返した。 </li><li> 1〜2分後に、せっけん水で軽く湿らせたガーゼでオフNairさん拭いてください。準備領域は、その後の外科手術中に傷口に得ることができる毛のある浮遊片のないクリーンな素肌にする必要があります。 ヨウ化物溶液でプリペアドエリアを滅菌する。 </li></ol> 4。椎弓切除<ol><li>頻繁に変更すると/または手続き中は手袋を消毒する。 （あなたは右利きの場合）、左を指している頭部とマウス背側を上に置きます。無菌性を確保するために動物を羽織るだけ坊主領域が露出されていること。胸椎約T8からT12にスパニングlaminecomyサイト上の縦切開（〜1.3センチメートル）を作る。 </li><li>左手で開催されたグレーフェの鉗子で、しっかりとT9（ 図1A）で脊柱を固定し、脊椎湾曲を誇張するために、マウスを持ち上げる。 </li><li> T10とT11の間の接合部、二つのとげの突起の間にスペースを獲得するためにメスを使用してください。さらに慎重に骨（ 図1Bを参照して、C）を公開する離れて筋肉層を廃棄による接合を公開。 </li><li>離れてラミナから、小さな切れ端で椎弓根の周り明確な筋肉を促進するためにはさみを使用してください。これは椎骨の間の小さなスペースをオープンすることになります。ゆっくりと繊細に、このギャップにはさみの一つのブレードを挿入し、茎をスニップ。はさみの曲率は常に離れて臍帯から、横方向に配置されていることを確認してください。反対側に繰り返します。 （ 図1D、Eを参照してください） </li><li>コー​​ドを公開するラミナを持ち上げ、慎重にそれをチョキンと切る。背後にある任意のフリーまたはぎざぎざの骨片を残ししないように注意してください。 （ 図1Fを参照） </li><li>注射の前に、滅菌綿棒で離して血液をきれいに。 </li></ol> 5。細胞の注入<ol><li>ハミルトンシリンジに針ナットと針を取り付け、水、次に70％エタノールで数回フラッシュすることにより、それらをきれいに、そして最終的にHBSS。水、70％エタノール、またはHBSSでそれぞれ充填した後、プランジャーを挿入します。 </li><li>プランジ​​ャーを取り外すと、針のナットを緩めて、背圧を防止するために注射器から針を引いて、セルの負荷のためにハミルトンシリンジを準備します。針とナットの慎重な取り扱いが滅菌手袋で行われていることを確認します。 </li><li>ピペットチップに細胞の15μlをロードし、シリンジに細胞をロードするために注射器のバックエンドにしっかりと先端を押してください。 </li><li> 5mm程度プランジャーを挿入し、針のナットを締めます。 </li><li>プランジ​​ャー国連を押し下げゴマ細胞懸濁液の一部が針を終了する見られている。 </li><li>シリンジ内に気泡がないことを確認して、重力によって勾配を作ることから細胞を防止するために水平位置にシリンジを下に置く。 </li><li> T8とT9（ 図2B、C）のシナプス結合棘背筋の筋肉によってlaminectomizedマウスを手につかむ。 </li><li>マウスの前足が空中に存在し、その後部足が軽く図2Aと2Bのように、滅菌ペーパータオルのプラットフォームに触れるように左（垂直）マイクロマニピュレータの腕に止血クランプ。 </li><li>右側のマイクロマニピュレータのアーム（70 °の角度で）にシリンジを接続し、クランプの前に可能な限り低い位置に注射器をスライドさせます。 </li><li>ペーパータオルに対して、その尾部を固定することによって、マウスを安定させ、ゆっくりと注射器（ 図2B）を下げる。 </li><li>コードに向かって針を下ろし、背側正中線（ 図2C）を介して反対側の半球に針1mmを挿入する。針の先端は中心管に近い灰白質にする必要があります。 </li><li>徐々に細胞の2.5μlを注入する。 1μlの/ 5秒の速度で注入する。針が脊髄の外になるまで細胞を注入した後、一度に10秒ごとに回転の10分の1を10秒経ってから針を引っ込める。細胞懸濁液の可能流出に注意を払う。 </li><li>すぐに注射器を収納し、マニピュレータのアームからそれを切り離す。水平にシリンジを定める。 </li><li>マウスと縫合のテーブルへの転送を離します。 </li><li>シリンジが空になるまで繰り返して、各マウスに対して5.7から5.14までを繰り返します。ツール（滅菌）と動物の間に針を（エタノールで拭いて）滅菌する。セルを廃棄し、凝集が表示されている場合はリロード。 </li><li>負荷との間のステップ5.1のように注射器を清掃してください。 </li></ol> 6。縫合と術後ケア<ol><li>切開を縫合。縫合針は、切開の両側の浅筋膜に挿入されます。スレッドは、それによって削除されたラミナのサイトで公開された脊髄を覆う、（ 図3A）一緒に浅筋膜を引っ張って、によって張られている。背中の皮膚または骨格筋​​に接続されている皮膚の筋肉を縫合しないでください。約1 / 2&quot;のまま、通過スレッド全体を引っ張る。ニードルホルダーを使用して、3つのノットが形成され、スレッドはできるだけ結び目の近くにトリミングされます。 </li><li>皮膚（ 図3B）、2〜3のステープルを（切開の大きさに応じて）適用することで、切開を閉じます。慎重に、基礎となる筋肉をステープル避けるため、マウスから肌を引き出します。 </li><li> 26G3 / 8針を使用すると、皮下離れて切開から背中の下部に0.5ミリリットル乳酸リンゲルを注入する。 </li><li>そのケージに戻ってマウスを置きます。それは麻酔下にある間快適に呼吸できることを確認するために、マウスは、手術部位とケージの寝具との間の接触を避け、ケージの中にその側に配置する必要があります。ケージは、加熱パッド上に配置する必要があります。 </li><li>麻酔は、出血がおさまるを確保するために切れる後にマウスが監視されて、縫合糸は閉じたまま、そのマウスは、手術前のモビリティに戻ります。 </li><li>鎮痛剤ブプレノルフィン（0.05〜0.1 mg / kg）を以下の手術でマウスを一度に扱う。 </li><li>障害のあるマウスは食べ物と水への十分なアクセスがあることを確認：水のボトルは、拡張された3.5インチ噴出している手の飼育水及び/または高カロリー栄養補助食品（ニュートリカル、Tomlynを）歩くことができないマウスが取り付けられています。 </li></ol> 7。代表的な結果： 望ましい結果は、注入時の細胞懸濁液の流出の欠如によって、プロシージャに続く脊髄の完全な外観によって識別されます。そのためには、椎弓切除中および注入中にマウスの脊椎で明るく、直接照明していることは大切です。最適な照明は光ファイバー照明（ 図2A）によって促進される。 <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="図1"/> 図1 - 。椎弓切除 （）椎T9後はしっかりとマイクロはさみのエントリを容易にするために、T10とT11の間にメスと脊椎スコア（B、C）、グレーフェの鉗子で開催されます。 （D）慎重にT10とT11の間にスペース（矢印とはめ込み、E）を介してマイクロハサミをスライドさせ、背板を解放するためにそれぞれの側に茎（ダッシュ、E）をカット。 （F）吻方ラミナをフリップアップし、それを切断。 <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。 NSCの注入。（A）70の角度で、右腕に左腕とハミルトンシリンジに接続されているマウスを保持している止血剤によるマイクロマニピュレータの一般的なセットアップ。 （B）止血剤は、T8とT9の棘を結ぶ棘背筋の筋肉をホールド。 （C）針は、tによって低下する彼正中線と中心管の近位の反対側の半球上の灰白質、に。 <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。縫合糸、創傷閉鎖。（）縫合糸は、切開の両側の浅筋膜に適用されます。 （一ステープル3を必要とする傷に表示されている）必要に応じて（B）切開は2-3ホッチキスで閉じられます。

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	<li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system:+host-virus+stand-off.">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li><li>Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+multiple+sclerosis:+how+do+we+cure+a+chronic+heterogeneous+disease.">The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease.</a> Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).</li><li>Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+demyelination+induced+by+coronavirus+JHM+(MHV-4):+molecular+identification+of+a+viral+determinant+of+paralytic+disease.">Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease.</a> Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).</li><li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination,+axonal+sparing,+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis.">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).</li><li>Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+engrafted+neural+stem+cells+is+mediated+by+CXCL12+signaling+through+CXCR4+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis.">Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).</li><li>Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+a+viral+model+of+multiple+sclerosis+induces+remyelination+in+the+absence+of+an+attenuated+inflammatory+response.">Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response.</a> Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).</li><li>Blakemore, W. F., Crang, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , (1992).</li><li>Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation.">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).</li><li>Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury.">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).</li><li>Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+patient+enters+trial+to+test+safety+of+stem+cells+in+spinal+injury.">First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury.</a> BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

よく実行される移植は主に細胞の慎重な椎弓切除と注入にかかっています。椎弓切除時に回避するために、主要な落とし穴は、脊髄の損傷です。これは、プロシージャ自体の間にまたは手順に従って、残された鋭い骨片による損傷によって発生する可能性があります。これらを回避するために、湾曲したマイクロはさみのポイントは常に離れてコードから直面していることを確認し、慎重にすべての骨片がクリアされていることを確認するlaminectomized背骨を検査し、残りの椎体構造は、あからさまに突出またはぎざぎざの縁がないことを。 前述のように光が射出中に露出脊髄上に明るくして、直接輝いている場合、流出の検出が可能となる。流出は、30ゲージの針（33ゲージ対）とし、注射があまりにも急速に行われている場合に発生する可能性が高いです。このプロトコルは、私達によい結果を与えているものの、他の人は注射8,9に続く後退する前に針を長く待っている期間（最大5分まで）を報告している。また、小さなゲージの針が望ましいですが、我々は33ゲージの針を通過する際、一部の細胞があまりにも容易に溶解することを観察した。 効率を最大化するために、4つの異なる局を（マウスの準備、椎弓切除、注射、および縫合糸）配乗移植チームが望ましい。また、各プロシージャのタイミングは、細胞は氷の上で待っている時間を最小限にするために最適化する必要があります。例えば、我々は4つ（シリンジの各負荷における投与量の数）のグループ私たちのマウスに移植、細胞を注入する人は、第3のマウスがlaminectomizedされた後にシリンジのロードを開始し、マウスを準備する人は、以下を麻酔してください前のグループの2番目のマウス後のグループはlaminectomizedされています。各マウスは、約30-40分かかりますにもかかわらず、このように、我々は約3時間で40マウスに細胞を（またはコントロールのメディア）移植で​​きます。 いくつかの中枢神経系疾患の治療用細胞の補充療法は、10の臨床試験で現在です。そこNSC移植のin vivoモデルに代わるものはないとウイルス誘発脱髄を有するマウスの脊髄にNSCの移植のための我々のプロトコルは、MSの重要なモデルの使用を容易にし、また簡単に他のモデルに適合させることができます。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/装置の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td>フェニックスParmaceuticals </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td>塩酸キシラジン</td><td> MPのバイオメディカル</td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td>ナイル</td><td>教会＆ドワイト社</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10μlのハミルトンシリンジのw /リムーバブルニードル</td><td>ハミルトン社</td><td> 7635〜01 </td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン針、30Gまたは33 G、½インチ、30 °ベベル</td><td>ハミルトン社</td><td> 7803-077803-05 </td><td>使用する最適なゲージを識別するために針を通過させるに従って、細胞の生存率をテストする</td></tr><tr><td>マイクロはさみ</td><td>世界の精密機器</td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td>小さなグレーフェ鉗子</td><td> FST </td><td> 11053〜10 </td><td></td></tr><tr><td>定位の</td><td> Kopfは楽器</td><td>モデル1772ユニバーサルホルダー</td><td></td></tr><tr><td>定位の</td><td> Kopfは楽器</td><td>モデル1773電極ホルダー</td><td></td></tr><tr><td>定位の</td><td> Kopfは楽器</td><td>モデル902小動物の定位</td><td></td></tr><tr><td>定位の</td><td> Kopfは楽器</td><td>モデル960左側の電極キャリア</td><td></td></tr><tr><td>縫合</td><td>エチコン</td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td>乳酸リンガー</td><td>ホスピーラ</td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td>ステープルズ</td><td>ファイン科学</td><td> 12032〜07 </td><td></td></tr><tr><td>止血剤</td><td> FST </td><td> 13010〜12 </td><td></td></tr><tr><td>メス、サイズ10,11 </td><td>フィッシャー</td><td> 268878、268879 </td><td></td></tr><tr><td>縫合</td><td>エチコン</td><td> 1676G </td><td>サイズ5-0、3 / 8&quot;サークル、19ミリメートル針、45センチメートル編組のスレッド</td></tr><tr><td>反射7創傷クリップアプリケーター</td><td> FST </td><td> 12031〜07 </td><td></td></tr><tr><td> 7ミリメートル反射創傷クリップ</td><td> FST </td><td> 12032〜07 </td><td></td></tr><tr><td>オルセン-ヘーガル針ホルダー</td><td> FST </td><td> 12502〜12 </td><td></td></tr></tbody></table>

surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus

マウス肝炎ウイルスの神経向性JHM株（MHV）に感染したマウスでは、脱髄疾患多発性硬化症（MS）の患者と同様の病理学と臨床転帰を開発する。我々は両方の再ミエリン化にと臨床転帰の有意な改善で病気のマウスの結果の脊髄にNSCのその移植を示している。慢性的な神経疾患の治療のための細胞置換療法は、今や現実のものであり、in vivoモデルで移植細胞と宿主組織の微小環境との相互作用を理解する上で不可欠です。このプレゼンテーションは、JHMV感染マウスの脊髄に細胞を移植するための適応方法を提供する。簡単に言えば、我々は、私のための手順を提供する）前に移植にNSCの準備、II）マウスの術前ケア、iii）の椎弓切除を介して脊髄の露出、ⅳ）定位NSCの注入、及びiv）術後ケア。

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Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

確立された脱髄とマウスの脊髄にマウス神経幹細胞（NSC）の移植が詳述されます。 NSCの準備、胸椎9（T9）の椎弓切除、そしてNSCの移植は、マウスの前と術後ケアと一緒に概説されています。

神経向性マウス肝炎ウイルスに感染したマウスの脊髄にマウス神経幹細胞の外科的移植

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K ビュー.  University of California, Irvine. 確立された脱髄とマウスの脊髄にマウス神経幹細胞（NSC）の移植が詳述されます。 NSCの準備、胸椎9（T9）の椎弓切除、そしてNSCの移植は、マウスの前と術後ケアと一緒に概説されています。

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Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

神経科学

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

化学遺伝子解析で作られた皮質間ニューロン前駆体を早期産後マウス脳に移植

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

マウスの神経幹細胞と脳における5-ヒドロキシメチルシトシンの検出

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...