微小血管の流れは毛細血管の間で変化し、数秒間で変化するため、フィールド全体の流れの連続的な定量化方法が必要です。スタッフは、手動で入手するには数ヶ月かかる顕微鏡フィールド全体の流速のほぼ連続的な測定を可能にします。これらの手順は簡単ですが、ビジュアルデモンストレーションは、新しいユーザーが初めてスタッフをナビゲートするのに大きく役立ちます。
TrakEM2 を使用して血管ネットワークを定義するには、まずファイル、新規、および TrakEM2 Blank を選択して新しい空の TrakEM2 プロジェクトをセットアップし、ムービーの単一イメージを含む新しいフォルダーをプロジェクトフォルダーとして選択します。TrakEM2 ウィンドウが開きます。メイン作業領域を右クリックし、[イメージのインポートとインポート]を選択します。
保存した単一の画像に移動し、イメージを選択します。メインワークエリアでもう一度右クリックし、[キャンバス/レイヤーセットの表示と自動サイズ変更]を選択します。次に、作業ウィンドウの左クリックします。
画像が作業領域いっぱいになります。血管ネットワークを含む画像の領域を選択するには、小さな TrakEM2 ウィンドウでテンプレート[エニシング]を右クリックし、[新しい子とエリア リストの追加]を選択します。小さな TrakEM2 ウィンドウでテンプレート Anything を無題のプロジェクトオブジェクトにドラッグします。
次に、テンプレート Anything、エリアリスト、プロジェクトオブジェクト、無題のプロジェクト、エニシングにドラッグします。[プロジェクト オブジェクト]の下の無題のプロジェクトで、[すべての領域]リストが表示されます。[Z スペース] タブの下のメインの TrakEM2 ウィンドウに、[エリア リスト] というラベルの付いたバーが作成されます。
クリックしてリストを選択します。メインの TrakEM2 ウィンドウでペイントブラシ ツールを選択し、マウス ホイールを回転させながら Shift をクリックして、目的の脈管の直径よりも小さいペイントブラシのサイズを選択します。Control S を押してプロジェクトを保存します。
ペイントブラシツールを使用して、焦点外の領域を除く血管ネットワークをペイントします。ラベルが完成したら、TrakEM2 のメイン ウィンドウを右クリックし、[ラベルとしてエクスポートおよびエリア リスト] を選択します。ポップアップ ウィンドウで[縮尺、100%]を選択し、すべてのエリア リストをエクスポートします。
TrakEM2 ウィンドウを閉じ、[はい] を選択してプロジェクトを保存します。エリアリストの画像が開き、空白の黒い画像として表示される場合があります。フィジーのメイン メニューで、[画像]、[調整]、[明るさ/コントラスト] を選択します。
[明るさとコントラスト]ウィンドウで、[自動]をクリックすると、[エリアリスト]が表示されます。フィジーのメイン メニューで、[イメージ]、[ルックアップ テーブル]、および [参照テーブルの反転] を選択します。白い背景に黒いラベルのこの画像を t-i-f ファイルとして保存し、イメージを閉じます。
フィジーでラベルファイルを開き、プラグイン、スケルトン、スケルトンアイを選択します。次に、スケルトンアイズイメージを t-i-f ファイルとして保存します。新しいスタッフプロジェクトを作成するには、「プラグイン」「マクロ」「開く/プロジェクトを開く/作成」を選択し、プロンプトに従って構成ファイルを作成または更新します。
[開く/作成]プロジェクトメニューから、プロジェクトディレクトリの入力ファイルフォルダ、入力ムービーファイル、スケルトンファイルに移動して選択します。[最大計測速度]、[最大速度マッピング]、[最小セグメント長]、[ピクセル サイズ]、および [フレーム レート] の値を入力します。画像の背景の輝度が周期的に点滅する場合は、[ちらつき補正]ボックスをオンにして、[OK]をクリックします。データの最適な視覚化に合わせてパラメーターを調整します。
データがカラー スケールの全範囲にわたってマップされるように、[マップされた最大速度] を設定してデータの約 95% を含めます。スケルトンを分析するには、「プラグイン、マクロ」および「スケルトンの分析」を選択します。スケルトンファイルが開き、対象領域マネージャが開いて実行されます。
[対象地域] マネージャーで、[すべて表示] と [ラベル] をクリックし、[OK] をクリックします。時間間隔を選択するには、「プラグイン、マクロ」、および「時間間隔の編集」を選択し、ムービーの合計時間にわたって 1 つのセグメントからキモグラフが生成されるのを待ちます。コントロールのプラスとマイナスのキーを使用して、必要に応じて、キモグラフのサイズを大きくし、四角形選択ツールを使用して、各時間間隔の周りに長方形を描画します。T キーを押すか、[追加] ボタンをクリックして[時間間隔]の選択を記録し、必要な時間間隔だけ選択を繰り返します。
パラメータの選択を評価するには、3 ~ 4 時間間隔を選択し、その間隔の分析を完了します。時間間隔の選択が完了したら、[OK] をクリックします。選択した間隔がプロジェクト フォルダに保存されると、ポップアップ ウィンドウが表示されます。
[OK] をクリックします。フローを分析するには、[プラグイン]、[マクロ]、[フローの分析] を選択します。[フロー パラメータの分析] ダイアログ ボックスが開き、[プロジェクトを開く/プロジェクトを作成]ステップで入力した値が表示されます。必要に応じてこれらの値を編集し、[OK] をクリックします。[出力ファイル名] ダイアログ ボックスが開き、[プロジェクトを開く/プロジェクトを作成] ステップで入力した名前が表示されます。
必要に応じてこれらの名前を編集し、[OK]をクリックしてフロー解析を開始します。フローが解析されたことを示すダイアログボックスが表示されたら、[OK]をクリックして解析結果をCSVスプレッドシートファイルに保存します。空間マップを作成するには、[プラグイン]、[マクロ]、および [空間マップの作成] を選択します。
[空間マップ パラメーター] ウィンドウが開き、[プロジェクトを開く/プロジェクトを作成] ステップで入力した値が表示されます。必要に応じてこれらの値を編集し、[OK]をクリックします。流速の空間マップのテンポラルシーケンスは、流速を示す各色で生成されます。生成された 1 つの画像のスタックを 1 つの間隔でスクロールして、フローの空間的および時間的な変動を視覚化し、ファイルをムービーとして共有する a-v-i ファイルとしてスタックを保存します。
スタッフ分析は、数秒から数分に及ぶ時間の期間にわたって、顕微鏡フィールド全体にわたって微小血管速度の完全な国勢調査を生成します。例えば、マウスの肝臓におけるこの時系列の微小血管ネットワークの単一の画像を使用して、生成された骨格化された画像を使用して微小血管流の軸を定義し、Staffが生成した個々の血管セグメントの地図を、その後の流量定量のために同定することを可能にした。スケルトン化された画像から生成された個々の血管セグメントから、時間の経過に伴う各線分に沿った強度を表すキモグラフを生成することができる。
スケルトンとユーザー供給の時間間隔を使用して、各セグメントのキモグラフを個々のセグメント時間間隔に分割できます。Staffは、各セグメントの時間間隔からカイモグラフの主な角度を識別し、計算された速度の測定値をCSVデータファイルとして提供します。スタッフCSV出力を使用して、全体的な速度分布を分析し、個々の血管セグメントの速度を時間の経過に従ってプロットすることができます。
色分けされた速度マップ画像のスタックとして視覚化できます。Staff から得られた結果は、サンプルの安定性、フレームレート、解像度、および信号対雑音比に関して、画像シリーズの品質に依存することに注意してください。スタッフ速度マップ出力を使用すると、空間フローパターニングを直感的に探索でき、スタッフCSV出力では、処理グループ内および処理グループ間の流速の統計解析が可能になります。
