著者は彼らの技術支援のためにアマンダタルドで、博士はモスタファBouljihad、ステファニーフィーリー、キャロルコイン、博士エリンRibka、博士はピートディディエとドロシーキュブラーに感謝します。この作品は、NIHの助成金R01 - DK076653とKSに3R01 - DK076653 - 02S1とTNPRC RR000164の基本オペレーティング助成金によってサポートされていました。

1。皮膚生検標本のコレクション<ol><li>前に皮膚生検の手順に、tiletamine塩酸塩とzolazepam塩酸telazol混合物（フォートダッジアニマルヘルス、フォートドッジ、アイオワ州）の2.5 mg / kgの筋肉内で動物を麻酔。横臥位までは麻酔薬の投与から動物を監視し、それらのエンクロージャから取り外します。 </li><li> betadineスクラブとアルコールを交互に準備を無菌的にサイズ40のブレード（オスタープロフェッショナルプロダクツ、マックミンヴィル、テネシー州）でオスターゴールデンA5シングルスピード獣医クリッパーを利用し、興味の皮膚領域から髪を削除します。選択された生検のサイト上に滅菌有窓ドレープを固定します。 </li><li>わずかな圧力で時計回りに180度時計回りと反楽器を回転させながら生検パンチが皮下TIに真皮層を介してトランセクトまで、無菌テクニックを使用して、皮膚に対して4.0ミリメートルMiltexパンチ皮膚生検器具（Miltex、ヨーク、ペンシルバニア州）を配置ssue。生検標本を取り出して、鉗子と皮下組織から無償で皮膚のtransected部分を把握する。 </li><li>靭帯パターン3 / 8サークルカット針（Ethilon、エチコン、ジョンソン＆ジョンソンメディカルリミテッド、バークシャー、英国）に接続されている3から0ナイロン縫合糸で皮膚の欠陥を閉じます。すべての動物に術後鎮痛のための筋肉注射では0.01 mg / kgの塩酸ブプレノルフィン（ホスピーラ、レイクフォレスト、イリノイ州）を得た。 </li></ol> 2。サンプル処理<ol><li>慢性皮膚炎と健常対照から皮膚生検サンプルで作業はアカゲザル。二〜三（直径4 mm）の各動物からのサンプルを生検取得します。 </li><li> 24時間（Z -修正、Anatech（株）、バトルクリーク、ミシガン州）亜鉛ホルマリンで最初のサンプルを修正し、ASP300ライカの組織のプロセッサ（ライカマイクロシステムズ社に、30分間水で洗浄、70％エタノールで簡単に洗浄、および場所組織は70％、80％、95％および100％エタノール48の昇順グレードで脱水、バッファローグローブ、KS）キシレンの二つの変更（フィッシャー）に続いて、各（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、PA）を、分</li><li>室温で長期保存のためにパラフィンのメディア（フィッシャー）に埋め込みます。場所前の切片に20分間-20℃。ロータリーミクロトーム（HM325、Micromインターナショナル、ルドルフ、ドイツ）を用いて6μmの切片を作製します。帯電したスライド（フィッシャー）と一晩60℃での乾燥空気の上に置いてセクション。ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）の標準方式（後述）で染色。 </li><li>室温で30分間、2％パラホルムアルデヒド（USBコーポレーション、クリーブランド、オハイオ州）で二番目のサンプルを修正し、（PBS、ギブコ- Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、30％ショ糖の代わりに（フィッシャー）のために4時間、およびOCT凍結培地（サクラファインテック、トーレンス、カリフォルニア州）に埋め込みます。前の切片に20分間、80℃で保管してください。クライオスタットを（HM560、サーモサイエンティフィック、カラマズー、ミシガン州）を使用して15μmの切片を作製します。 </li></ol> 3。 H＆E染色<ol><li>埋め込みを脱パラフィンキシレンの三つの変更（フィッシャー）を通じて、DEDのセクションおよび傾斜ethanolsを通して水分補給をする：100％、95％の二つの変更、80％、蒸留水のいずれかの変更が、2分ごとの3つの変更を。 </li><li> 1分間のためのヘマトキシリン​​（リチャード - アラン科学、カラマズー、ミシガン州）で染色し、水道水を流しての簡単な洗浄によって従ってください。 </li><li> 6分間エオシン（シグマ）と対比。 </li><li> 95％と無水エタノール、キシレンの三つの変更で2分ごとにしてクリアを2回交換し、3分ごとに通過ステンド組織を脱水する。 </li><li> H＆E染色切片上Cytoseal封入剤を使用してマウントのカバーガラス（リチャード - アラン科学）。 </li></ol> 4。病理組織学的評価 SPOTインサイトデジタルカメラ（デジタルインスツルメンツ社、ミシガン州、米国）との組み合わせで最大40倍の倍率とライカの顕微鏡 - 4を使用して光学顕微鏡下でH＆E染色生検皮膚切片を検査する。 5。免疫蛍光STAI寧<ol><li>免疫蛍光染色のためのOCT -埋め込まれた皮膚切片で動作。染色する前に、PBSで20分が0.1％でOCTを削除すると、組織を透過性にトリトンX - 100（Sigma社）0.2％、魚皮ゼラチン（FSG、Sigma）を含むために浸漬。 </li><li>スライドを洗浄した後、加湿スライドチャンバー内で、室温で、1時間PBS - FSGで希釈した10％正常ヤギ血清（NGS、シグマ）、でインキュベートする。 </li><li> IgAとtTG2抗体の沈着を可視化するために、1時間に10％NGS - PBS - FSGで希釈した抗アカゲザルIgAおよびtTG2一次抗体、を使用してスライドをインキュベートする。 </li><li> 10分間PBS - FSGが続く10分、のためにPBS - FSG -トリトンX - 100（Sigma）で洗ってください。 </li><li> 1:1000希釈でのAlexa Fluor ®蛍光色素488（緑）、568（赤）または633（青）（Molecular Probes社 - インビトロジェン社）でタグ付けされた二次、アイソタイプ特異的抗体でインキュベートする。核DNAを可視化するToPro - 3色素を使用してください。抗体の希釈液として10％NGS - PBS - FSGを使用してください。 </li><li>染色した組織切片をマウントするためにアンチクエンチング溶液（Sigma）を使用してください。 </li></ol> 6。共焦点像 488nmでアルゴン - クリプトンレーザー（緑）、568 nmのクリプトンレーザー（：3つのレーザー（利用可能な励起のための6行）を搭載したライカTCS SP2共焦点レーザー走査顕微鏡（ライカ、ヴェッツラー、ドイツ）でイメージングを実行する赤）とスペクトルの遠赤側からは見えませんからスパン633 nmの（青）、ヘリウム - ネオンレーザー。非標識組織アーキテクチャの評価のための記録の微分干渉コントラスト（DIC）のイメージ。 7。代表的な結果 tTG2およびIgA抗体の両方でETGの肯定的な認識の例を図に示します。 3A。人間の患者の状況とアカゲザルでもグルテン感受性CD -様よりDHのような皮膚炎の非常に低い有病率に起因すると一貫性、皮膚生検標本のほとんどは、翔に期待されていますワットtTG2抗体とがtTG2 +型IgA +二重陽性細胞（図4）の存在なしに陽性反応。これらのDH -無関係な微生物起源の皮膚炎の場合を含む場合は、、いくつかの単一陽性型IgA +上皮の下に散らばって細胞がtTG2およびIgA標識マーカー（図3B及び4）の間にないスペクトルの重なりを明らかにする。したがって、それは病理組織学的評価（図2）と、他の、より一般的な皮膚炎の原因となる薬剤も特定できない場合にのみ、焦点が続く臨床検査（図1）、で始まる、提案されたテスト手順の順序を維持することが重要です。 tTG2とIgAについて染色した皮膚生検の顕微鏡検査が保証されている。単独で臨床的および/または病理組織学的評価は、この条件の肯定的な診断には十分ではありません。このような場合で、二重陽性（tTG2 + IgAの+）細胞が真皮乳頭の領域の周囲に識別され、DHのような皮膚炎の診断を発行することができます。食事のグルテンのような場合には、撤退とグルテンフリー食事療法の投与は、皮膚炎の症状を緩和するために推奨されます。 <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" alt="図1" /> 図1前EM96マカクの鼠径部（A）と後（B）5週間の食事グルテンの撤退。食事グルテンの再導入は、皮膚炎の再現（C）と一致した。 <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。HEは、前に収集EM96マカク皮膚生検の染色（A）と後（B）9週間のための食事グルテンの撤退。 ：上皮は角化細胞の厚い表層地殻変性好中球を浸透して（上皮細胞の7月15日層）厚く。好中球は上皮の内側にも表示され、リンパ球、形質細胞、及び真皮上層の付属器周囲組織球の中程度の数値と混合されています。 B：一部hyperkeratOSISがまだ存在する、上皮の厚さは、真皮上層の最小限のリンパ形質細胞の浸潤と（4-7層）正規化されています。 C：無リンパ形質細胞の浸潤とFR56ニホンザルからのノーマル腹部の皮膚は、、比較のために含まれています。倍率20倍。 <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。前に収集EM96マカク皮膚生検の共焦点顕微鏡像（A）と後（B）9週間のための食事グルテンの撤退。 ：IgAの染色（緑）、tTG2（赤）とToPro - 3核DNAマーカー（青）。 IgAとtTG2の共局在は皮膚papilaeの周辺に黄色で表示されます。 B：グルテンフリー食には、いくつかの上皮下のIgAがまだ存在している間tTG2（赤）、（緑）上皮内にはIgAを示していないとToPro - 3核DNAマーカー（青）の9週間後に採取した皮膚サンプル。 <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 </動物が慢性的（DH -無関係）皮膚炎の症状を示すしている間に収集GI24アカゲザルの皮膚生検の強い&gt;共焦点顕微鏡画像。 IgAの染色は赤で緑、tTG2にあり、ToPro - 3核DNAマーカーが青になります。赤と緑のマーカーの間には広範なスペクトルの重なりが検出されない間、tTG2 +細胞は、上皮下に上皮、いくつかの型IgA +細胞の内部に存在する。 <table border="1"><tbody><tr><td> 動物タグ </td><td> セックス [M / F] </td><td> 年齢 [年] </td><td> 臨床症状 </td><td> プラズマtTG2 抗体 </td><td> ダイエット [1,2] * </td></tr><tr><td> HJ71 </td><td> F </td><td> 1.3 </td><td>健康</td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HD13 </td><td> M </td><td> 1.4 </td><td>健康、時折の下痢</td><td> + </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FR56 </td><td> M </td><td> 5.4 </td><td>慢性特発性下痢</td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EM96 </td><td> F </td><td> 5.0 </td><td>慢性皮膚炎</td><td> + / - （ボーダーライン） </td><td> 1と2 </td></tr><tr><td> GI24 </td><td> F </td><td> 4.6 </td><td>慢性皮膚炎</td><td> - </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>皮膚生検のコレクションのために使用される表1。TNPRCはアカゲザル *ダイエット1 - 定期的なサルチョウ（グルテン含有）、ダイエット2 - グルテンフリー食

<ol>
	<li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+the+adaptive,+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients.">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li><li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celiac+disease:+epidemiology,+pathogenesis,+diagnosis,+and+nutritional+management.">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li><li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+transglutaminase+(TGase+3)+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis.">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li><li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet.">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li><li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques.">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li><li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+&#x03B1;-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques.">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from &#x03B1;-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li><li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Celiac+disease:+from+pathogenesis+to+novel+therapies.">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li><li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response.">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li><li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis.">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

グルテン感受性の私達の新しく設立された非ヒト霊長類モデルは、最近の食事グルテン5,6によって引き起こされる腸の透過性の変化を研究するために使用されていました。プラズマtTG2抗体だけでなく、腸のtTG2 +型IgA +堆積物は、いくつかのグルテンに敏感なマカクザルで検出された。我々は最近、アカゲザルコロニーでは通常の（代謝/感染症）病因が確立できなかったニホンザルを?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号/製品コード </td><td> （注） </td></tr><tr><td>抗ヒトIgA - FITC * </td><td>シグマ、セントルイス、MO </td><td> F - 5259 </td><td> 1:100希釈率</td></tr><tr><td>抗ヒトtTG2 </td><td>サーモサイエンティフィック、カラマズー、ミシガン</td><td> MS - 300 - P1ABX </td><td> 1:100希釈率</td></tr><tr><td>抗マウスIgG1 ** </td><td>インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州</td><td> - 21124 </td><td> 1:1000希釈率</td></tr><tr><td> ToPro - 3 DNAプローブ*** </td><td>インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州</td><td> T - 3605 </td><td> 1:1000希釈率</td></tr><tr><td>ホルマリン亜鉛 （Z -修正） </td><td> Anatech（株）、バトルクリーク、ミシガン</td><td> 171 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> OCT凍結 中</td><td>サクラファインテック、トーレンス、カリフォルニア州</td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal取り付け 中</td><td>リチャード - アラン科学、カラマズー、ミシガン</td><td> 8312から4 </td><td></td></tr><tr><td>アンチクエンチング ソリューション</td><td>シグマ、セントルイス、MO </td><td> P 3130 </td><td></td></tr><tr><td> Ethilon （ナイロン縫合糸） </td><td>エチコン、ジョンソン＆ジョンソン、バークシャー州、イギリス</td><td> 663G </td><td></td></tr><tr><td> Miltexパンチ皮膚生検器具</td><td> Miltex、ヨーク、ペンシルバニア州</td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td>オスターゴールデンA5サイズ40ブレードとシングルスピードの獣医クリッパー</td><td>オスター製品、マックミンヴィル、テネシー州</td><td> 78005-050 </td><td></td></tr><tr><td>ライカのティッシュプロセッサ</td><td>ライカマイクロシステムズ株式会社。、バッファローグローブ、カンザス州</td><td> ASP300 </td><td></td></tr><tr><td>回転式ミクロトーム</td><td> Micromインターナショナル、 ルドルフ、ドイツ</td><td> HM325 </td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>サーモサイエンティフィック、 カラマズー、ミシガン</td><td> HM560 </td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ、ウェッツラー、 ドイツの</td><td> TCS SP2 </td><td></td></tr></tbody></table> *フルオレセインイソチオシアネート tTG2一次抗体の後に使用される**セカンダリ（のAlexa Fluor ® 568 -共役）抗体 **色素

recognition of epidermal transglutaminase by iga and tissue transglutaminase 2 antibodies in a rare case of rhesus dermatitis

組織トランスグルタミナーゼ2（tTG2は）すでに部分的に消化された食物グルテンなどグリアジンのペプチドをdeamidates腸の消化酵素です。遺伝的素因のある個体では、tTG2は小腸壁1,2にtTG2抗体およびその直接堆積の生産によって特徴づけられる自己免疫応答をトリガします。このような抗体の存在は、セリアック病（CD）の主要な特徴の一つである。表皮トランスグルタミナーゼ（ETG）はまた、CD患者のごく少数の自己抗原として​​機能することができるトランスグルタミナーゼファミリーの別のメンバーです。これらは比較的まれなケースでは、ETGは臨床的に疱疹状皮膚炎（DH）として知られる自己免疫反応（皮膚の発疹）をトリガします。 CDとDH発症の正確なメカニズムはよく理解されていないが、それが知られているtTG2とCDとDH患者3,4の両方から血清抗体によって認識することができる株式の抗原エピトープをETG。 アカゲザル ）（表1、図1および図2）の皮膚病変からの生検サンプルの共焦点顕微鏡検査は患部組織を研究するために使用されていました。一匹（EM96）でIgAとtTG2抗体（図3）のスペクトルの重複が実証された。ダブルポジティブtTG2 +型IgA +細胞の存在は、真皮乳頭の周りに、深い表皮に集中していた。これは、DHの患者3に記載された病変と一致している。 EM96は、グルテンフリー食事療法、皮膚炎だけでなく、tTG2に置かれたときに+型IgA +預金は消失し（図1-3）はもはや検出されなかった。皮膚炎は、EM96での食事グルテンの再導入（図示せず）に基づいて、しかし、再び現れた。関係のない皮膚炎を持つ動物を含む他のニホンザルでは、tTG2 +型IgA +預金は検出されなかった。その皮膚のtTG2の存在と一緒にEM96の皮膚炎のグルテンフリー食事療法に依存した寛解+型IgA +細胞は、DH -など、自己免疫を示唆しているこの条件の開発のためのメカニズム。これは、任意の非ヒト霊長類におけるDHのような皮膚炎の最初の報告である。

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Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

疱疹状皮膚炎（DH）は、IgAおよび表皮トランスグルタミナーゼ（ETG）の間に自己免疫反応を特徴とする慢性炎症性疾患です。 DHは、グルテン過敏性および/または腹腔患者の非常に小さな部分で開発しています。この研究の結果は、DHもidiopatic皮膚炎の症状とアカゲザルのホストで開発できることを示している。

の稀なケースでIgAおよび組織トランスグルタミナーゼ2抗体による表皮トランスグルタミナーゼの認識アカゲザル炎

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

recognition-epidermal-transglutaminase-iga-tissue-transglutaminase-2

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

24.4K ビュー.  Tulane National Primate Research Center. 疱疹状皮膚炎（DH）は、IgAおよび表皮トランスグルタミナーゼ（ETG）の間に自己免疫反応を特徴とする慢性炎症性疾患です。 DHは、グルテン過敏性および/または腹腔患者の非常に小さな部分で開発しています。この研究の結果は、DHもidiopatic皮膚炎の症状とアカゲザルのホストで開発できることを示している。

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

アカゲザルの細胞性免疫応答のマルチカラーフローサイトメトリー解析

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

免疫・感染学

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

IGY技術：ポリエチレングリコール（PEG）沈殿により卵黄からニワトリ抗体の抽出

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

We describe an in vitro method for culturing schistosomula of the flatworm parasite Schistosoma mansoni, via the harvesting and transformation of infective cercariae from the fresh water snail intermediate host Biomphalaria glabrata.

セルカリア変換と in vitroで</emの>栽培マンソン住血吸虫 Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents in standard laboratory techniques. In contrast, several human IgMs demonstrated proof of efficacy in cancer models and models of CNS disorders including multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Reasons for their lack of consideration include difficulties to express, purify and stabilize IgM antibodies, challenge to identify (non-protein) antigens, low affinity binding and fundamental knowledge gaps in carbohydrate and lipid research. 
This manuscript uses HIgM12 as an example to provide a detailed protocol to detect antigens by Western blotting, immunoprecipitations and immunocytochemistry. HIgM12 targets polysialic acid (PSA) attached to the neural cell adhesion molecule (NCAM). Early postnatal mouse brain tissue from wild type (WT) and NCAM knockout (KO) mice lacking the three major central nervous system (CNS) splice variants NCAM180, 140 and 120 was used to evaluate the importance of NCAM for binding to HIgM12. Further enzymatic digestion of CNS tissue and cultured CNS cells using endoneuraminidases led us to identify PSA as the specific binding epitope for HIgM12.

Antibody Binding Specificity for Kappa (V&amp;#954;) Light Chain-containing Human (IgM) Antibodies: Polysialic Acid (PSA) Attached to NCAM as a Case Study

We present a protocol to identify protein moieties containing antigens for human and mouse IgM antibodies with specific kappa (V&#954;) light chains. This protocol is not limited to IgM class antibodies but applies to all immunoglobulin isotypes that target their antigen with sufficiently high affinity during immunoprecipitations.

カッパ（Vκ）に対する抗体の結合特異性軽鎖を含むヒト（IgM抗体）抗体：ポリシアル酸（PSA）ケーススタディとしてNCAMに添付

Antibodies of the IgM isotype are often neglected as potential therapeutics in human trials, animal models of human diseases as well as detecting agents ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

ハイブリドーマ技術によってマウスモノクローナル抗体の作製

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析<sup&gt; +</sup&gt;ペプチドMHC-I四量体染色によりアカゲザルにおけるT細胞

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

新生児カプサイシン処置によるアトピー性皮膚炎のモデルラットにホルムアルデヒドの暴露の影響

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...