このプロトコルは、上皮細胞と第一選択自然免疫細胞、特に先天性T細胞のクロストークを調査するために設計されており、これが我々の関心事である。ヒト由来の初代細胞がこの技術で使用され、ヒトで起こっていることに関連する生理学的クロストークの個々の調査を可能にする。先天性T細胞は、インフルエンザ感染患者の生存率の改善に関与している。
彼らがどのように活性化されるかを知ることは、抗インフルエンザおよび抗ウイルス療法の開発に役立つ可能性があります。この方法は、先天性のT細胞を活性化することができる因子を同定するように設計されており、呼吸器ウイルス感染に対する予防措置の開発に役立つ可能性がある。0日目に、ヒト鼻上皮細胞、またはHNECsに感染する。
まず、150マイクロリットルの1xトリプシンEDTAを膜インサートの頂端チャンバーに、350マイクロリットルの1xトリプシンEDTAを代表ウェルの基底チャンバーに添加することによって細胞を計数する。細胞を摂氏37度で10分間、または細胞が膜から剥離するまでインキュベートする。上下にピペッティングして膜上の細胞を洗い流し、懸濁液を1.5ミリリットルの遠沈管に集める。
200マイクロリットルのDMEMを加えてトリプシン活性をクエンチする。次いで、トリパンブルー染色を介して細胞を計数する。ウェルあたりの細胞数に基づいて、ウイルスの必要な感染倍率 (MOI) を計算します。
それに応じて、氷上の完全なRPMIでウイルスストックを希釈する。感染実験のための残りのウェルのために、膜挿入物の頂端チャンバーに1つの1x DPBSを加える。摂氏37度で10分間インキュベートし、1x DPBSを取り除きます。
膜インサート中の基礎培地を完全なRPMI培地に変更し、インサートをウェルに完全なRPMIを加えた新しいプレートに移すことによって、完全なRPMI培地にする。調製したウイルス接種物を膜挿入物の頂端チャンバーに加える。5%二酸化炭素雰囲気中で摂氏35度で1時間インキュベートし、ウイルス接種物を頂端チャンバーから除去する。
メンブレンインサートの基礎培地を新鮮なRPMI培地に変更し、5%二酸化炭素雰囲気中で摂氏35度で24〜72時間インキュベートする。必要数の末梢血単核球細胞、またはPBMCsを、PBMC懸濁液を感染HNECsの各ウェルの基底チャンバーに直接添加することによって完全なRPMI培地にゼロ日目から播種する。摂氏37度で24〜48時間インキュベートする。
頂端上清を採取するには、各頂端チャンバーに1x DBPSを加え、摂氏37度で10分間インキュベートする。その後、DPBSを1.5ミリリットルのチューブに集めます。プラークアッセイ用の上清を新しい1.5ミリリットルチューブにアリコートし、ストックとアリコートの両方を摂氏マイナス80度で直ちに凍結します。
RNA型HNECを収集するには、メンブレンインサートをクリーンウェルに移します。RNA溶解バッファーを頂端チャンバーに加え、室温で5分間インキュベートする。上清を1.5ミリリットルの遠沈管に集め、分子分析のためにRNA抽出するまでマイナス80°Cで保存します。
最後に、滅菌ピペットチップの広いベースでウェルの表面を静かに掻き取り、ウェル表面に付着している可能性のある活性化PBMCを取り除き、PBMCを採取します。PBMCsを含む基礎培地を2ミリリットルの遠沈管に集める。300マイクロリットルの1x DPBSでウェルを2回洗い流し、同じ2ミリリットルのチューブに洗浄液を回収します。
2ミリリットルのチューブを遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく新鮮な2ミリリットルのチューブに上清を集める。吸引した上清をマイナス80°Cで保存し、サイトカインおよびケモカイン分析を行う。残りの細胞ペレットを200マイクロリットルの1x DPBSに再懸濁する。
このプロトコールは、同じドナーからの上皮細胞および免疫細胞を必要とせずに、インフルエンザ感染後の先天的T細胞を研究するために使用することができる。HNESPCが3T3フィーダ層上で成長するにつれて予想される進行のサンプルをここに示します。これらは、機能的、繊毛化、および杯細胞を有する多層HNECを得るために、空気/液体界面培養における分化に使用された。
HNECsを用いて、先天性T細胞活性化をフローサイトメトリーを用いて調査することができる。これらの結果は、粘膜関連不変体T、またはMAIT細胞、Vデルタ一、ガンマデルタT細胞、およびナチュラルキラーT、またはNKT細胞の検出を示す。これらの細胞は、インフルエンザウイルスに感染したHNECsを含む共培養において有意に増加した。
このセットアップを他のインフルエンザウイルス株、または自然免疫細胞集団に適用して、感染した上皮細胞との共培養条件下でそれぞれの活性化を観察することができます。感染の適切な多重度が使用されることを確実にするためにヒト鼻上皮細胞の数の正確な計算は、活性化の最適なレベルおよびタイミングにとって重要である。上皮細胞と自然免疫細胞とのクロストークはますます注目されており、これは急性または慢性呼吸器免疫学を含む他の方法にさらに適用することができます。
