生細胞顕微鏡は、研究者が核分裂と微膜分裂の核ダイナミクスをリアルタイムで研究することを可能にします。この方法の強さは、有毒な固定剤や汚れの必要性を排除する正常な生理学的条件下で生きている細胞の核プロセスを研究することから来る。この手法は、遺伝的または生体機械操作に適さない可能性のあるタンパク質のタイミング、安定性、および移動性に関連する質問に対処します。
イメージングの前に、分裂酵母細胞の健康と適合性に細心の注意を払うことは重要です。常に形態と成長特性を調べて、実験全体の結果の一貫性を確保します。このプロトコルは、顕微鏡スライドを調製する比較的簡単な方法を示しており、正しくマスターすると、長時間の生細胞イメージングの一貫性と再現性を高めることができます。
極低温ウェイクアッププレートから細胞物質を拾い始めるには、YESプレートにストリークし、酵母遺伝子型に応じて摂氏25度または摂氏32度でインキュベートし、極低温保存からフィッション酵母株を目覚めさせます。その後、滅菌ループを使用して、目覚めた分裂酵母株の個々のコロニーから細胞を選び、3ミリリットルのYES液体培地を含む試験管に接種します。150~220rpmのシェーカーにチューブを入れ、0.7~1.0の光学密度測定値を求める遅い段階で一晩で25度または32度で成長させます。
培養液10マイクロリットルを顕微鏡スライドに移す。カバースリップを置き、顕微鏡の下に置き、適切な細胞形態と栄養状態を確認します。有糸分裂または明起分析のための顕微鏡スライドを設定するには、まず、最小培地プラス有糸分裂のためのサプリメントまたはマイオシスのための液体胞子体のサプリメントの100ミリリットルを含む500ミリリットルフラスコにアガロースの2グラムを追加します。
アガロース溶液を電子レンジで60%の電力で10秒刻みで温めるか、ビーカーを摂氏55度の水浴に10分間入れます。溶液を旋回して効率的な融解を確保します。ピペットチップホルダーに2つの顕微鏡スライドを設置し、上部スライドを両端のラボテープの2つのスタックに置き、クロスシェイプを作ります。
2つのスライド間の距離を2ミリメートル以上に調整して、イメージングを延長するために次の手順で厚いパッドを形成します。溶融アガロースを室温で1分間冷却した後、上部スライドを取り外し、広いボアピペットチップを使用して、下のスライドに50〜100マイクロリットルを分配してスポットを作ります。アガロースが冷却する前に、上部スライドを上に置き、直径約1センチメートルと1/2〜2センチメートルのスプレッドパッドを生成します。
最適なライブセルイメージングは、後続のデータ処理ステップに不可欠です。溶融アガロースの空気ボーブルを排除し、4時間以上のイメージング期間のための薄いパッドを作成することを確認してください。有糸分裂性のイベントを調べることは、一晩液体EMMまたはPMGプラスサプリメントのいずれかのスターター培養物から細胞を成長させる。
培養液を1ミリリットルをキュベットに移し、595ナノメートルの波長で分光光光度計を測定する。光学密度が0.4に達すると、細胞増殖は中間対数相と見なされます。次いで、1ミリリットルの細胞懸濁液を1ミリリットルで遠心し、1分間375回gを用いた。
上清を取り除き、最小培地に加えて、100マイクロリットルの最終体積に補う細胞ペレットを再懸濁します。画像のメオティックイベントは、一晩最小限の培地プラスサプリメントでスターター培養から細胞を成長させます.595ナノメートルの光学密度が0.7と1の間にある場合、細胞増殖は遅対数相と考えられる。
次に、レイトログ培養から、各合致型株の500マイクロリットルを得て、H陰性とH陽性、1ミリリットルの細胞懸濁液を作り組み合わせる。1分間、375回gで細胞を遠心分離する。上清を取り除き、液状マルトース抽出物の1ミリリットルでペレットを再懸濁します。
マルトースエキスを3回繰り返し、効率的な栄養素除去を確実にします。最後のマルトース抽出物を洗浄した後、細胞を1ミリリットルのマルトース抽出物で再懸濁し、9ミリリットルのマルトース抽出物を含む50ミリリットルフラスコに混合物を移す。50~100rpmの最低回転速度で22~25°Cで12~16時間インキュベートします。
豊富な自己凝集から生じる多くの丸い分裂酵母塊の出現は、効率的な交配を示す。次に、1,375回gの交配培養物と遠心分離機の1ミリリットルのサンプルを1分間服用する。750マイクロリットルの上清を取り除き、残りの上清の細胞を再懸濁する。
塊を混乱させるために5秒間激しく渦を起こさせる。2%アガロースパッドに有糸分裂性または微粒子細胞懸濁液の20マイクロリットルを分配する。スライドを反転し、2〜3秒間、糸くずのないペーパータオルの上に置くことによって、余分な媒体を取り除きます。
スライドを反転し、パッドの上部にガラスカバースリップをそっと置き、気泡を発生させないようにします。セル単層を作成するには、人差し指でカバースリップを1回回転させ、有糸分裂細胞を1回回転させるか、または重症細胞の場合は2回のフルターンを行います。細胞物質がアガロースパッド全体に分散し、単一細胞またはアシスのより良い分離を可能にすることを確認してください。
小さな木製のスティックの助けを借りて、各アガロースパッドを密封するためにカバースリップの端に沿って溶融炭化水素シーラントを分配します。アガロースパッドが密封されたら顕微鏡のステージに置きます。温度チャンバのスイッチを入れ、希望の温度に設定します。
濡れたペーパータオルを入れたプレートをチャンバーに入れ、顕微鏡システムの湿度を制御します。適切な撮像条件で10~15分間平衡させます。これにより、残りの気泡が消散し、最後の最後のアガロースシフトが発生します。
40Xの目的を使用して、画像に対する適切な視野を見つけます。60Xの目標に切り替えて、データの取得を開始します。顕微鏡機能を制御するソフトウェアでは、観察中の蛍光ホルに最も一致する顕微鏡フィルターセットを選択します。
使用される蛍光色素に合わせて励起波長を調整し、一貫した信号を生成する最も低い励起力を採用し、4〜8時間の露光時間を使用して、許容可能でありながら定量化可能で再現可能なイメージングデータを生成します。1 時間ごとに少なくとも 6 つの取得時点を収集します。画像収集ソフトウェアでは、データを取得する少なくとも1つの蛍光チャネルを選択し、0.5マイクロメートル間隔の13セクションからなるZストックを採用します。
フィジーのソフトウェアでは、プラグインメニューの下のバイオフォーマットの輸入機能を選択して、デコンボルブ画像をアップロードします。[インポート オプション] ポップアップ ウィンドウで、[ハイパースタック]、[既定のカラー モード] を選択し、[自動スケール] をオンにして [OK] ボタンを押します。下部にある各バーを横にスクロールして、表示されるウィンドウの蛍光チャンネルと時間枠の数が正しいことを確認します。
データを圧縮しない TIFF ファイルとして保存します。次に、[分析]メニューの[計測値を設定]オプションを使用して、異なるパラメータを選択します。たとえば、面積、最小最大グレー値、統合密度、平均グレー値、中央値、スタック位置、周長、表示ラベルなどです。
[色]を選択し、[チャンネルツール]をクリックします。「チャンネル」ポップアップウィンドウで、強度または面積を測定するカラーチャンネルを確認します。[イメージ]を選択し、[タイプ]をクリックして[32ビット]をクリックします。
[イメージ] メニューの [調整] および [しきい値] 機能を選択します。[暗い背景] チェックボックスをオンにし、[デフォルト] を選択して[赤]を選択して、対象のシグナルをオーバーレイします。wand ツールを使用して目的の各構造をハイライト表示し、キーボードの文字 T を押して、選択した ROI をポップアップ ROI マネージャ ウィンドウに追加します。
次に、ZIP化されたROIフォルダを開いてROIマネージャをロードし、左側のパネルで各ROI識別子をクリックします。[分析] メニューから [測定] を選択し、各 ROI 識別子でこのコマンドを繰り返して、イメージ スタックのすべてのスライスで対象のオブジェクトを定量化します。統計分析のために結果を CSV ファイルとして保存します。
この研究では、細胞が栄養の制限や過剰増殖のために飢えた場合、過剰な空胞子および細胞サイズの減少を示す。対数細胞は、活性DNA複製および細胞分裂、ならびに汎核Tos4-GFP発現およびSad1-DsRed病巣分離を示す。細胞が十分に窒素不足でない場合と同様に、交尾の失敗は、それらが間もない状態に入るのを妨げる。
カルヨガミーを受けている核分裂細胞のペアが示されている。嵌合細胞懸濁液の堅牢な凝集は細胞間相互作用を増加させ、したがって成功した交配および効率的な微量誘導を示す。ジゴティック・アシは、ジグザグとバナナ細胞の形を含む複数の形態をとっている。
細胞が形相からテロ相に移行する有糸分裂では、最初の変化は形相における核サイズの収縮を伴い、2番目の変化はアナフェーズ中に核分裂を示す。マイトティック細胞といくつかの分離ダイナミクスを共有することに加えて、meiotic細胞は相同組換え中に核振動を示し、アナフェーズII.Itの終わりにヌクレオシドのさらなる減少を示す実験パラメータが実験全体で再現され、収集されたデータが下流分析に適合することを確実にする研究者の責任です。生細胞イメージングにより、研究者は有糸分裂と間膜症における核分裂の仕組みを詳細に調べることができた。
蛍光タグと顕微鏡機能が改善されるにつれて、観察できるプロセスの数と種類が増えます。
