著者は彼らのアドバイスをジョンGrazul（コーネル大学）、アンドレMarziali（バンクーバーでのブリティッシュコロンビア大学）とヴィンセントタバード-コッサが（オタワ大学）に感謝いたします。この作品は、米国国立科学財団（DMR - 0706517とDMR - 1006332）と国立衛生研究所（R01 - GM088403）からの補助金によって一部で賄われている。材料研究科学工学センター（MRSEC）プログラム（DMR 0520404） - ナノ細孔の掘削は、全米科学財団からの支援と材料研究のためのコーネルセンター（CCMR）の電子顕微鏡施設で行われました。シリコン窒化膜の調製は、国立科学財団（助成ECS - 0335765）でサポートされているコーネルナノスケール施設、国家ナノテクノロジーインフラネットワークのメンバー、で行った。

1。シリコン窒化膜の固体ナノ細孔の製造<ol><li> 200 kVの加速電圧にFEI Tecnai F20のS / TEMをもたらす。別のS / TEMを使用している場合、加速電圧はkVの9より200以上でなければなりません</li><li> TEM試料ホルダに20nmの厚SPI窒化ケイ素のウィンドウのグリッドをロードして、ホルダーからの汚染物質を取り除くために30秒間酸素プラズマでクリーニング。 </li><li> S / TEMにサンプルをロードし、真空排気する真空を可能にする。 S / TEMは真空下に励起されると、Ronchigramで明るい正方形を探すことで明視野TEMモードでの窒化物のウィンドウを見つける。 TEMが適切に配置され、その後、サンプルを調整し、焦点を当てることを確認してください。 </li><li> STEMモードにS / TEMを切り替えます。画像にサンプルをHAADF（または同等の）検出器を使用し、それが適切に配置されていることを確認します。 </li><li>低い値にモノクロメータを設定します。モノクロメータの値が小さいほど、高いオン電を可能に掘削のための利用可能な電子のt。 S / TEMがモノクロメータを持っていない場合、この手順を無視してください。 </li><li>ナノ細孔をあけるための適切なスポットサイズを選択してください。これは、電子プローブの直径に相当する。 3nmのプローブは、5 nmの直径の孔を掘削に適しています。大きなプローブ（5 nm）は、より迅速にドリルと大きな細孔が作成されます。小型プローブ（1 nm）は小さい孔をドリルダウンし、作成に時間がかかります。 </li><li>必要に応じて、STEMのアライメントを調整します。 </li><li>窒化膜を集中し、x1.3Mの倍率にそれをもたらす。微動フォーカスはRonchigramを監視することによって行われる必要があります。 </li><li>サンプルのいずれか動きがある場合は、その後安定するまでサンプルを待ちます。これは時間かかることがあります。窒化物を損傷しないように待っている間に電子ビームをブランク。 </li><li>サンプルの電子プローブを配置し、掘削を開始。 </li><li>定期的にHAADF検出器を走査することによってサンプルをチェックし、両方のナノ細孔は、DRIをされていることを確認するlled（それはダークスポットのようになります）とサンプルのない動きがないことを確認する。サンプルがわずかに変化した場合、ナノ細孔を介してに電子プローブの位置を調整します。 </li><li>細孔が形成されているときに識別するためRonchigramをご覧ください。ときに、フォーカスで、窒化膜は、輝く外観を持っています。これは、ときにナノ細孔のフォームを非表示になります。焦点が少しRonchigramを出すことは、1つは、ナノ細孔に関連付けられているフレネルフリンジを確認することができます。 </li><li> HAADFによるナノ細孔の画像を取る。 </li><li>ナノ細孔の画像の強度プロファイルを実行してください。ナノ細孔の直径は、プロファイルの最も暗い領域を見積もることができます。 </li><li>ナノ細孔の拡大は、細孔の縁に沿って電子プローブを移動させることによって行なうこともできます。 </li><li>ナノ細孔が所望の直径のものであると、TEMモードにS / TEMを置く。 </li><li>サイズを確認するために、明視野TEMを用いたナノ細孔は、その標準的な設定と画像にモノクロメータをもたらす<strong&gt;（図1）。 </li></ol> 2。固体ナノ細孔の湿潤<ol><li> 1 MのKCl、10mMリン酸カリウム、pH7.4を含む脱ガス脱イオン水。これは、真空下でのソリューションを配置し、20分間入浴ソニケーターにそれらを置くことによって行うことができます。 </li><li> 10ミリリットルパイレックスビーカーにナノ細孔を含むシリコン窒化チップを置きます。それは非常にデリケートであるため、窒化ウィンドウを壊さないように注意してください。ドラフト内でホットプレート上でビーカーを置き、100℃に設定</li><li>細心の注意を使用してピラニア溶液とナノ細孔チップを清掃してください。最初のガラスピペットを用いて容器に3mlの硫酸を加える。次に、慎重にピラニア溶液14を作るために硫酸を1 mlの過酸化水素を加える。すべての対策を必ず行ってください。 </li><li>ナノ細孔チップは10分間ピラニア溶液に浸漬することができます。 </li><li>ガラスピペットを用いてビーカーからピラニア溶液を取り外します。適切な保管容器にそれを置きます。 </li><li> Fiのきれいなガラスピペットを用いて脱ガス処刑、脱イオン水でビーカーにしよう。空の水のビーカーと少なくとも5回を繰り返します。 </li><li>清潔なピンセットでナノ細孔チップを取り外し、光吸引によってそれを乾燥させる</li><li>すぐに、チャンバー（図2a、図2b）にナノ細孔チップを封止し。チップがO -リングまたはシリコーンシーリング材でチャンバー内に確保されることがあります。 </li><li> KCl溶液でチャンバーを埋める</li><li>チャンバー（図2b）に銀/塩化銀電極を接続してください。電極が一晩漂白剤に銀線を浸漬することによって行うことができる。 </li><li>電極間の膜電位を印加し、電圧クランプモードで軸索200Bパッチクランプアンプを使用して、現在の応答を監視します。 </li><li>測定結果から、I / V（電流 - 電圧）曲線を構築する。 1 M塩化カリウム（図3）を使用する場合のI / V曲線は直線性の高いはずです。ナノ細孔のコンダクタンスはその直径に対応する必要があります。ナノ細孔は表示されない場合リニアなI / V曲線、電気伝導度が低すぎる、またはナノ細孔の開いて電流が安定していない場合（図4a）、それはナノ細孔が適切に濡れていないとピラニアの洗浄を繰り返す必要があることを意味します。 </li></ol> 3。モニタリングタンパク質吸着<ol><li>それは、タンパク質試料を欠くバッファー条件で電流を監視するために、シングルナノ細孔膜またはナノ細孔の並列配列（下記参照）で制御実験を行うために非常に重要です。我々は、次の2つの手順をお勧めします。（i）高純度レベルでのバッファの使用（純度&gt; 99.9％、クロマトグラフィーグレードのレベル）、および（ii）相互作用の固体ナノ細孔を持つバッファの使用はしないシングルチャネルのイベントを生成します。さらに、我々は標準的なタンパク質化学の手順を使用して高純度のタンパク質試料を取得することをお勧めします。タンパク質試料の純度は、ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミド（SDS - PAGE）ゲル分析により確認されるべきであると高解像度ミリアンペアSS分析法15。 </li><li>チェンバーの接地バスに検討されるタンパク質の精製サンプルを追加。お風呂全体に拡散するサンプルの時間を許可する。測定可能なタンパク質の典型的な濃度はμM範囲7,15-21に数十nmにある。 </li><li>研究されているタンパク質の総電荷量のそれに逆極性で貫通潜在的な電圧のバイアスを適用します。例えば、BSAは、pH7.4で効果的な正味の負電荷を持つため、正電圧のバイアスを適用する必要があります。印加電圧は、反対勢力によって駆動される反対の電荷のナノ細孔内部および蛋白質内で電位勾配が作成されます。ナノ細孔中にタンパク質を駆動するだけの電圧極性は、測定可能な信号を作成します。 </li><li> 200 mVの大きさの印加される電位は、ほとんどの蛋白質の分析対象物を観察するのに十分な大きさでなければなりません。イベントは、ベースラインからの過渡電流の偏向角（図4b）として表示されます。シグナルが観察されていない場合は、チャンバー内のタンパク質の濃度を増加させる。より高い電圧は、信号対雑音比を改善する。窒化物ナノ細孔が数ボルトに耐えることができます。 </li><li>タンパク質の吸着は、ナノ細孔（図4c）の現在のベースラインで長寿命の変化として表示されます。 </li></ol> 4。ナノ細孔の機能化の可能性窒化ケイ素22,23に官能基を適用するためのメソッドがいくつか存在する。必要に応じて最も窒化膜の外側とオゾンへの曝露上に薄い酸化物層を持っていると、追加の酸化物層を作成することができます。異なる有機シランを使用し、そのような層の上に自己組み立てることができます。特に興味深いのは、有機表面の範囲の検査を可能にする、自己 - 組み立てと（すなわち、カルボン酸とアルデヒド）をさらに改変することができる、アミノシランである。ナノ細孔は、ピラニアで洗浄し、chambeに確保された後R、アミンを溶媒として使用される0.5 M TBACl（テトラブチルアンモニウム）および無水MeOH（メタノール）の支持電解質とチャンバー槽に直接添加することができます。単層の形成は、400mVの電圧バイアスと電流ドロップ23の測定のアプリケーションによって監視することができます。 5。見かけ上一次反応速度定数の決定と平行ナノ細孔の配列を使用して定数ラングミュア吸着吸脱着5.1見かけの一次反応速度定数我々は、この方法論の肯定的な側面は、単一分子レベルでの個々のadsorptionsを観察する能力であることを強調する。無機表面へのタンパク質吸着の単一分子測定は、固体ナノポアの平行配列を採用することによってスケールアップすることができます。ナノ細孔の並列配列は、信頼性の高統計を得るためにアッセイ多くの細孔に必要性が必要であるS.この目的のために、ナノ細孔配列の使用は、個々のadsorptionsのモニタリングだけでなく、さらなる分析のために複数のイベントの測定を可能にするであろう。窒化ケイ素のナノ細孔の配列は、単にサンプル中の複数の穴をあけることによって、上記のプロトコルによって形成されることがあります。それぞれのナノ細孔は、同じようなサイズである必要があります。 6x6のまたは7 × 7のナノ細孔の配列で十分です。チャンバー内のタンパク質の分析対象物を添加すると、現在は次の式で指数関数的に減衰します。 I T = I∞ - （I∞ - I 0）はexp（- K&#39;t）は ここで、I T、実験的な時刻 tでの電流を示します。I 0は、ナノ細孔配列を介して元流れる電流です。 私は ∞（つまり、無限大）飽和レベルの電流を示す。K&#39;は見かけの一次反応速度です。目から決定することができる、一定のeは、実験曲線のフィット。より大きなkは &quot;速い吸着速度と解釈することができます。比I∞/ I 0は 、また、正規化された飽和電流と呼ばれる0と1の間の無次元数である。このパラメータは、吸着したタンパク質の分析対象物によって占有の尺度です。したがって、それぞれの別個の実験条件は、I∞/ I 0とk&#39;は二つの特定の出力パラメータに関連付けられている必要があります。 それは、見かけの一次の吸着速度定数と正規化電流はナノ細孔内のタンパク質によって費やされる効果的な時間によって影響されることに留意すべきである。この時間は、バルク水相24中のタンパク質の分析物の濃度に依存しています。したがって、これらの数値の追加補正は、ナノ細孔内部に蛋白質によって費やされる効果的な時間に基づいて実装する必要があります。我々は、FASの周波数を測定することを提案T（転座）イベントなどのイベントの平均滞留時間を掛ける。これは、単位時間あたりのナノ細孔内部に費やしたタンパク質の平均時間を与える。 脱離の速度定数は同様にナノ細孔の並列配列を用いて決定することができる。とすぐに現在のレベルが飽和して（I∞）に達すると、電圧を逆にする必要があるので、これ以上のタンパク質は、ナノ細孔にトラップされていません。個々のタンパク質の脱離が大きい値に向かって記録電流の変化を伴うことになります。速度定数は、現在のレベルの上昇から抽出されます。 5.2ラングミュア吸着定数ナノ細孔の無機表面へのタンパク質の分析物の吸収は、水相中のタンパク質濃度に依存しています。この現象は、すでに単一分子レベル13で観察されている。 θは表している場合<html>の正規化された飽和電流は（I∞/ I 0）、その後、典型的なラングミュア等温式は次式で与えられます。 <img alt="図5.2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig5_2.jpg" />ここで、Cは、水相中のタンパク質濃度である。αはラングミュア吸着定数である。吸着の結合エネルギーの増加とと温度の低下に伴って、この定数が増加する。 θのデータポイントのコレクションは、水相中の様々なタンパク質の濃度で実施した並列配列で測定を採用します。データは、フィットラングミュア吸着定数の大きさを確認するために他の技術と組み合わせて分析する必要があります。さらに、フル原子分子動力学シミュレーション25,26は、得られた実験データの解釈を助けるために使用される場合があります。 タイトル&quot;&gt; 6。代表的な結果固体ナノ細孔の代表的な結果は次のようになります。開孔電流は図に見られるように、非常に安定している必要があります。 4A。ナノ細孔のI / V特性は、1 M塩化カリウム、 図に見られる10リン酸カリウム、pH7.4の、非常に直線的でなければなりません。 2。 I / V曲線の直線近似の傾きは、ナノ細孔の単位コンダクタンスを提供します。コンダクタンスは、ナノ細孔径には直接的な関係を有しており、方程式と一致する必要があります。 <img alt="図の方程式" src="/files/ftp_upload/3560/3560figeqn.jpg" /> 、Gは、ナノ細孔のコンダクタンスであるここで、dはその直径であり、lはその長さであり、σはチャンバ14内の溶液の導電率である。この値は30％以内に一致する必要があります。それが小さすぎる場合、あなたの気孔はおそらく湿らされていません。タンパク質の追加により、迅速なイベントは、 図に見られるように、結果として起きるはず。 4B。 PROTアイン吸着は、 図に表示されている寿命の長い現在のドロップです。 4C。いくつかのタンパク質は非常に不安定と細孔内部に構造的な変革を受けるている。このケースでは、長寿命の電圧降下は、急激な変動を伴うことになります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig1.jpg" /> 図1。Tecnai F20のS / TEMを用いて作製した固体ナノ細孔 。細孔は、直径20nmにSTEMモードで掘削された。画像は、明視野TEMモードで撮影された。窒化物は、厚さ30nmであった。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig2.jpg" /> 図2。商工会議所は、住宅用の抵抗パルス測定における単一固体ナノ細孔を使用する。）商工会議所とフリースタンディング窒化物ウィンドウ（TEMグリッド）とシリコンチップ。ナノ細孔は、ロードする前に、窒化物中に掘られている。レッドO -リングは良いのを形成するために使用されていますイオン溶液の2つのバスを分離チップ、約EAL。ナノ細孔を基準にして解決のお風呂と電極の配置を示す室のB）の回路図。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig3.jpg" /> 図3。異なる直径の固体ナノ細孔のためのI / V（通常）のトレース。シングルチャネルの電気トレースは、1 MのKCl、20 mMトリス、pH 8.5で撮影した。ナノ細孔は、厚さ30nmの窒化シリコンで掘削された。 （注）の窒化物の厚さはナノ細孔の単位コンダクタンスに影響を与えます。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig4.jpg" /> 図4シングルチャネル電流トレースとタンパク質吸着の検出を測定。）10nmの直径のナノ細孔の開いている現在を示す単一チャネルの電気トレース。 B）現在の偏向角の間にウシ血清アルブミン（BSA）のパーティショニング表現ナノ細孔のIOR。 C）BSAの吸着は、窒化物の表面に。すべてのトレースは、1 MのKCl、10mMリン酸カリウム、pH7.4中に同じナノ細孔からです。適用される膜電位は+40 mVであったとBSAは、120 nMの濃度で接地室のバスに追加されました。

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K., Franzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+BSA+binding+to+citrate-coated+gold+nanoparticles+and+surfaces.">Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces.</a> Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).</li><li>Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+protein+adsorption+at+the+single+molecule+level+studied+by+atomic+force+microscopy.">Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy.</a> Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).</li><li>Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+organization+and+cooperativity+during+nonspecific+protein+adsorption+events.">Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).</li><li>Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+concepts+and+phenomena+of+the+nonspecific+adsorption+of+beta-lactoglobulin.">A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin.</a> Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).</li><li>Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+Studies+of+Protein-Functionalized+Atomic+Force+Microscopy+Cantilever+Tips.">Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips.</a> Scanning. 21, 394-397 (1999).</li><li>Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+'windows'+for+nanofabricated+structures.">Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures.</a> Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).</li><li>Giannoulis, C. S., Desai, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+proteins+and+fibroblasts+on+thin+inorganic+films.">Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).</li><li>Gustavsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensors+applications.">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).</li><li>Shirshov, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+response+of+planar+polarization+interferometer+to+molecular+layer+formation:+fibrinogen+adsorption+on+silicon+nitride+surface.">Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface.</a> Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).</li><li>Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+layer+deposition+to+fine-tune+the+surface+properties+and+diamters+of+fabricated+nanopores.">Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores.</a> Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).</li><li>Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+biosensors+based+on+biofunctionalized+conical+gold+nanotubes.">Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).</li><li>Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+Single+Molecules+of+Immunoglobulin+and+Ricin+with+an+Aptamer-Encoded+Glass+Nanopore.">Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore.</a> Anal. Chem. , (2009).</li><li>Kim, M. -. J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Fabrication+of+Uniform+Size+Nanopores+and+Nanopore+Arrays+for+Parallel+DNA+Analysis.">Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis.</a> Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).</li><li>Bezrukov, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+as+molecular+Coulter+counters+to+probe+metabolite+transport.">Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport.</a> J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).</li></ol>

我々は、開示することは何もない。

固体表面へのタンパク質の自発的な吸着27-29などのバイオチップのアプリケーションと機能的なハイブリッド生体材料の新しいクラスの設計などの分野の数が、根本的に重要である。これまでの研究では、固体表面に吸着した蛋白質は、横方向の移動性または重要な脱着率が表示されないことが示されているため、タンパク質の吸着は、一般的に不可逆と非特異的なプロセス30か?...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> Tecnai F20 S / TEM </td><td> FEI </td><td></td><td> S / TEMの加速電圧≥200kVと電界放射源が必要です。 </td></tr><tr><td> TEM用20nmの厚さの窒化シリコン膜のウィンドウ</td><td> SPI </td><td> 4163SN - BA </td><td></td></tr><tr><td>軸索Axopatch 200Bパッチクランプアンプ</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>軸索Digidata 1440A </td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10ソフトウェアをpCLAMP </td><td>分子デバイス</td><td></td><td>電気生理学データ収集と解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>硫酸</td><td> Fisherサイエンティフィック</td><td> A300 </td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> H325 </td><td></td></tr><tr><td>シリコンO -リング</td><td>マクマスター、カー</td><td> 003 S70 </td><td>またPDMSを使用</td></tr><tr><td>銀線</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 348759 </td><td>電極の</td></tr><tr><td> SPC技術、Dサブ接点、ピン</td><td>ニューアーク</td><td> 9K4978 </td><td>電極の</td></tr><tr><td>カリウム塩化</td><td>シグマ</td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基</td><td>シグマ</td><td> P2222 </td><td></td></tr><tr><td>一塩基性リン酸カリウム</td><td>シグマ</td><td> P5379 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td>ダウコーニング</td><td></td><td> Sylgar 184 Elastomerセット。チャンバーを作るための。 </td></tr><tr><td>クイックキャストのシーラント</td><td>世界の精密機器</td><td> KWIK - CAST </td><td>速断シリコーンシーリング材</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ファラデー箱</td><td></td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring protein adsorption with solid-state nanopores

ソリッドステートナノ細孔は、局所構造と柔軟性核酸1-6、タンパク質7の展開、および異なるリガンド8の結合親和性を調べるために、単一分子レベルでの測定を実行するために使用されている。 9月12日の抵抗のパルステクニックにこれらのナノ細孔を結合することによって、そのような測定は、様々な条件の下でとラベリング3を必要とせずに行うことができます。抵抗 - パルス法では、イオン性塩溶液は、ナノ細孔の両側に導入されています。したがって、イオンは定常電流、その結果、適用される膜内外電位差によってチャンバの一方から他方に駆動されています。ナノ細孔への分析対象物の分割は、単一分子情報を抽出するために分析することができる、この電流で明確に定義されたたわみを、引き起こす。このテクニックを使用して、ナノ細孔壁への単一のタンパク質の吸着は、広い範囲の下で監視することができます条件13。マイクロ流体デバイスのサイズが縮小として、単一のタンパク質とこれらのシステムの相互作用が問題となるので、タンパク質の吸着は、重要性が高まっています。このプロトコルは、容易にナノ細孔の掘削の影響を受けやすい他の薄膜、するか、官能窒化物の表面に拡張することができる窒化膜への結合タンパク質の迅速なアッセイについて説明します。タンパク質の様々なソリューションと変性条件の広い範囲で検討されることがあります。また、このプロトコルは、ナノ細孔の分光法を用いてより多くの基本的な問題を探求するために使用されることがあります。

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Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

無機表面へのタンパク質の非特異的吸着を監視するための固体ナノ細孔を用いる方法が説明されています。方法は、リアルタイムで、単一分子レベルで検出対象にする吸着を可能に、抵抗パルスの原理を採用しています。単一タンパク質吸着のプロセスがはるかに平衡からなので、我々は同様にタンパク質吸着の定数見かけ一次反応速度の定量測定と一定のラングミュア吸着のために可能にする、合成ナノ細孔の並列配列の雇用を提案する。

ソリッドステートナノ細孔を持つ監視タンパク質吸着

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

monitoring-protein-adsorption-with-solid-state-nanopores

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K ビュー.  Syracuse University. 無機表面へのタンパク質の非特異的吸着を監視するための固体ナノ細孔を用いる方法が説明されています。方法は、リアルタイムで、単一分子レベルで検出対象にする吸着を可能に、抵抗パルスの原理を採用しています。単一タンパク質吸着のプロセスがはるかに平衡からなので、我々は同様にタンパク質吸着の定数見かけ一次反応速度の定量測定と一?...

ビデオ: Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Registered Bioimaging of Nanomaterials for Diagnostic and Therapeutic Monitoring

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end organs. The latter include the lung, RES, and brain and are operative during human immunodeficiency virus type one (HIV-1) infection. Macrophage entry into tissues is notable in areas of active HIV-1 replication and sites of inflammation. In order to assess the potential of macrophages as nanocarriers, superparamagnetic iron-oxide and/or drug laden particles coated with surfactants were parenterally injected into HIV-1 encephalitic mice. This was done to quantitatively assess particle and drug biodistribution. Magnetic resonance imaging (MRI) test results were validated by histological coregistration and enhanced image processing. End organ disease as typified by altered brain histology were assessed by MRI. The demonstration of robust migration of nanoformulations into areas of focal encephalitis provides '"proof of concept" for the use of advanced bioimaging techniques to monitor macrophage migration. Importantly, histopathological aberrations in brain correlate with bioimaging parameters making the general utility of MRI in studies of cell distribution in disease feasible. We posit that using such methods can provide a real time index of disease burden and therapeutic efficacy with translational potential to humans.

Bioimaging methods used to assess cell biodistribution of nanoparticles are applicable for therapeutic and diagnostic monitoring of nanoformulated compounds. The methods described herein are sensitive and specific when assessed by histological coregistration. The methodologies provide a translational pathway from rodent to human applications.

診断と治療モニタリングのためのナノ材料の登録バイオイメージング

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end ...

生物工学

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

ミササイトメトリー：CyTOFマスメーターで毎日のチューニングと実行した細胞サンプルのためのプロトコル

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Multi-analyte Biochip (MAB) Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes (ASSISE) for Physiological Research

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) that can withstand prolonged storage in complex biological media 1-4. An all-solid-state ion-selective-electrode (ASSISE) is especially attractive for the aforementioned applications. The electrode should have the following favorable characteristics: easy construction, low maintenance, and (potential for) miniaturization, allowing for batch processing. A microfabricated ASSISE intended for quantifying H+, Ca2+, and CO32- ions was constructed. It consists of a noble-metal electrode layer (i.e. Pt), a transduction layer, and an ion-selective membrane (ISM) layer. The transduction layer functions to transduce the concentration-dependent chemical potential of the ion-selective membrane into a measurable electrical signal.
The lifetime of an ASSISE is found to depend on maintaining the potential at the conductive layer/membrane interface 5-7. To extend the ASSISE working lifetime and thereby maintain stable potentials at the interfacial layers, we utilized the conductive polymer (CP) poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) 7-9 in place of silver/silver chloride (Ag/AgCl) as the transducer layer. We constructed the ASSISE in a lab-on-a-chip format, which we called the multi-analyte biochip (MAB) (Figure 1).
Calibrations in test solutions demonstrated that the MAB can monitor pH (operational range pH 4-9), CO32- (measured range 0.01 mM - 1 mM), and Ca2+ (log-linear range 0.01 mM to 1 mM). The MAB for pH provides a near-Nernstian slope response after almost one month storage in algal medium. The carbonate biochips show a potentiometric profile similar to that of a conventional ion-selective electrode. Physiological measurements were employed to monitor biological activity of the model system, the microalga Chlorella vulgaris.
The MAB conveys an advantage in size, versatility, and multiplexed analyte sensing capability, making it applicable to many confined monitoring situations, on Earth or in space.
Biochip Design and Experimental Methods
The biochip is 10 x 11 mm in dimension and has 9 ASSISEs designated as working electrodes (WEs) and 5 Ag/AgCl reference electrodes (REs). Each working electrode (WE) is 240 &mu;m in diameter and is equally spaced at 1.4 mm from the REs, which are 480 &mu;m in diameter. These electrodes are connected to electrical contact pads with a dimension of 0.5 mm x 0.5 mm. The schematic is shown in Figure 2.
Cyclic voltammetry (CV) and galvanostatic deposition methods are used to electropolymerize the PEDOT films using a Bioanalytical Systems Inc. (BASI) C3 cell stand (Figure 3). The counter-ion for the PEDOT film is tailored to suit the analyte ion of interest. A PEDOT with poly(styrenesulfonate) counter ion (PEDOT/PSS) is utilized for H+ and CO32-, while one with sulphate (added to the solution as CaSO4) is utilized for Ca2+. The electrochemical properties of the PEDOT-coated WE is analyzed using CVs in redox-active solution (i.e. 2 mM potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6)). Based on the CV profile, Randles-Sevcik analysis was used to determine the effective surface area 10. Spin-coating at 1,500 rpm is used to cast ~2 &mu;m thick ion-selective membranes (ISMs) on the MAB working electrodes (WEs).
The MAB is contained in a microfluidic flow-cell chamber filled with a 150 &mu;l volume of algal medium; the contact pads are electrically connected to the BASI system (Figure 4). The photosynthetic activity of Chlorella vulgaris is monitored in ambient light and dark conditions.

Multi-analyte Biochip MAB Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes ASSISE for Physiological Research

All-solid-state ion-selective electrodes (ASSISEs) constructed from a conductive polymer (CP) transducer provide several months of functional lifetime in liquid media. Here, we describe the fabrication and calibration process of ASSISEs in a lab-on-a-chip format. The ASSISE is demonstrated to have maintained a near-Nernstian slope profile after prolonged storage in complex biological media.

生理学的研究のための全固体型イオン選択性電極（ASSISE）に基づき、多検体バイオチップ（MAB）

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) ...

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in the tissues are important parameters for successful clinical outcomes. In order to improve tissue integration, porous metallic implants have being developed. Open porosity of metallic foams is very advantageous, since the pore areas can be functionalized without compromising the mechanical properties of the whole structure. Here we describe such modifications using porous titanium implants based on titanium microbeads. By using inherent physical properties such as hydrophobicity of titanium, it is possible to obtain hydrophobic pore gradients within microbead based metallic implants and at the same time to have a basement membrane mimic based on hydrophilic, natural polymers. 3D pore gradients are formed by synthetic polymers such as Poly-L-lactic acid (PLLA) by freeze-extraction method. 2D nanofibrillar surfaces are formed by using collagen/alginate followed by a crosslinking step with a natural crosslinker (genipin). This nanofibrillar film was built up by layer by layer (LbL) deposition method of the two oppositely charged molecules, collagen and alginate. Finally, an implant where different areas can accommodate different cell types, as this is necessary for many multicellular tissues, can be obtained. By, this way cellular movement in different directions by different cell types can be controlled. Such a system is described for the specific case of trachea regeneration, but it can be modified for other target organs. Analysis of cell migration and the possible methods for creating different pore gradients are elaborated. The next step in the analysis of such implants is their characterization after implantation. However, histological analysis of metallic implants is a long and cumbersome process, thus for monitoring host reaction to metallic implants in vivo an alternative method based on monitoring CGA and different blood proteins is also described. These methods can be used for developing in vitro custom-made migration and colonization tests and also be used for analysis of functionalized metallic implants in vivo without histology.

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

In this video, we will demonstrate modification techniques for porous metallic implants to improve their functionality and to control cell migration. Techniques include development of pore gradients to control cell movement in 3D and production of basement membrane mimics to control cell movement in 2-D. Also, a HPLC-based method for monitoring implant integration in-vivo via analysis of blood proteins is described.

毛穴グラデーション、高分子電解質とその間接的モニタリングの金属インプラントのマルチスケール変更<em生体内で&gt;</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic performance of microalgae-based biofuel production. Models that estimate microalgal growth under different conditions can help to optimize PBR design and operation. To be effective, the growth parameters used in these models must be accurately determined. Algal growth experiments are often constrained by the dynamic nature of the culture environment, and control systems are needed to accurately determine the kinetic parameters. The first step in setting up a controlled batch experiment is live data acquisition and monitoring. This protocol outlines a process for the assembly and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used to conduct microalgal growth experiments. This protocol describes how to size and assemble a flat-plate, bench-scale PBR from acrylic. It also details how to configure a PBR with continuous pH, light, and temperature monitoring using a data acquisition and control unit, analog sensors, and open-source data acquisition software.

This paper describes the assembly process and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used, in conjunction with other methods, to estimate pertinent kinetic growth parameters. This system continuously monitors the pH, light, and temperature using sensors, a data acquisition and control unit, and open-source data acquisition software.

動力学的成長試験のための温度、光およびpHモニタリングを有するベンチスケール藻類光合成バイオリアクターの構築およびセットアップ

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Construction of a Wireless-Enabled Endoscopically Implantable Sensor for pH Monitoring with Zero-Bias Schottky Diode-based Receiver

Ambulatory pH monitoring of pathological reflux is an opportunity to observe the relationship between symptoms and exposure of the esophagus to acidic or non-acidic refluxate. This paper describes a method for the development, manufacturing, and implantation of a miniature wireless-enabled pH sensor. The sensor is designed to be implanted endoscopically with a single hemostatic clip. A fully passive rectenna-based receiver based on a zero-bias Schottky diode is also constructed and tested. To construct the device, a two-layer printed circuit board and off-the-shelf components were used. A miniature microcontroller with integrated analog peripherals is used as an analog front end for the ion-sensitive field-effect transistor (ISFET) sensor and to generate a digital signal which is transmitted with an amplitude shift keying transmitter chip. The device is powered by two primary alkaline cells. The implantable device has a total volume of 0.6 cm3 and a weight of 1.2 grams, and its performance was verified in an ex vivo model (porcine esophagus and stomach). Next, a small footprint passive rectenna-based receiver which can be easily integrated either into an external receiver or the implantable neurostimulator, was constructed and proven to receive the RF signal from the implant when in proximity (20 cm) to it. The small size of the sensor provides continuous pH monitoring with minimal obstruction of the esophagus. The sensor could be used in routine clinical practice for 24/96 h esophageal pH monitoring without the need to insert a nasal catheter. The &#34;zero-power&#34; nature of the receiver also enables the use of the sensor for automatic in-vivo calibration of miniature lower esophageal sphincter neurostimulation devices. An active sensor-based control enables the development of advanced algorithms to minimize the used energy to achieve a desirable clinical outcome. One of the examples of such an algorithm would be a closed-loop system for on-demand neurostimulation therapy of gastroesophageal reflux disease (GERD).

The manuscript presents a miniature implantable pH sensor with ASK modulated wireless output together with a fully passive receiver circuit based on zero-bias Schottky diodes. This solution can be used as a basis in the development of in vivo calibrated electrostimulation therapy devices and for ambulatory pH monitoring.

ゼロバイアスショットキーダイオードベース受信機を用いたpHモニタリング用ワイヤレス対応内視鏡型埋め込み型センサの構築

Ambulatory pH monitoring of pathological reflux is an opportunity to observe the relationship between symptoms and exposure of the esophagus to acidic or ...

Coral Growth and Monitoring Using the Micro-Device System

マイクロデバイスシステムを用いたサンゴの生育とモニタリング

ヒト尿からの連続的な細胞外小胞分離のためのマイクロ流体デバイス

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. Nevertheless, the current methodologies for isolating EVs present significant challenges, such as complexity, time consumption, and the need for bulky equipment, which hinders their clinical translation. To address these limitations, we aimed to develop an innovative microfluidic system based on cyclic olefin copolymer-off-stoichiometry thiol-ene (COC-OSTE) for the efficient isolation of EVs from large-volume samples in a continuous manner. By utilizing size and buoyancy-based separation, the technology used in this study achieved a significantly narrower size distribution compared to existing approaches from urine and cell media samples, enabling the targeting of specific EV size fractions in future applications. Our innovative COC-OSTE microfluidic device design, utilizing bifurcated asymmetric flow field-flow fractionation technology, offers a straightforward and continuous EV isolation approach for large-volume samples. Furthermore, the potential for mass manufacturing of this microfluidic device offers scalability and consistency, making it feasible to integrate EV isolation into routine clinical diagnostics and industrial processes, where high consistency and throughput are essential requirements.

著者スポットライト:バイオリアクター統合のための非対称フィールドフローフラクショネーション

Extracellular vesicles hold immense promise for biomedical applications, but current isolation methods are time-consuming and impractical for clinical use. In this study, we present a microfluidic device that enables the direct isolation of extracellular vesicles from large volumes of biofluids in a continuous manner with minimal steps.

二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語)

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...