Yazarlar, onların tavsiyelerini John Grazul (Cornell Üniversitesi), Andre Marziali (Vancouver, British Columbia Üniversitesi) ve Vincent yeleği Cossa (Ottawa Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, ABD Ulusal Bilim Vakfı (DMR-0.706.517 ve DMR-1.006.332) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01-GM088403) hibe kısmen finanse edilmektedir. Malzeme Araştırma Bilim ve Mühendislik Merkezleri (MRSEC) programı (DMR 0.520.404) - nanopore delme, Ulusal Bilim Vakfı desteği ile Cornell Malzeme Araştırma Merkezi (CCMR) Elektron Mikroskopi Tesisleri&#39;nde yapıldı. Silisyum nitrür membranların hazırlanması, Ulusal Bilim Vakfı (Hibe ECS-0.335.765) tarafından desteklenen Cornell Nanoseviye Tesisi, Ulusal Nanoteknoloji Altyapı Ağı üyesi yapıldı.

1. , Silisyum nitrür membranlar solid-state nanopores üretimi <ol><li> 200 kV bir ivme gerilimi FEI Tecnai F20 S / TEM getirin. Farklı bir S / TEM kullanıyorsanız, ivme gerilimi 200 kV 9 eşit veya daha büyük olmalıdır </li><li> 20 nm kalınlığında SPI silisyum nitrür pencere ızgara TEM numune tutucu içine yerleştirin ve 30 saniye boyunca oksijen plazma ile temiz sahibinden herhangi bir kirleri çıkarmak için. </li><li> S / TEM örnek Yük ve aşağı pompa vakum izin verir. S / TEM vakum aşağı pompalanır sonra, parlak bir kare için Ronchigram bakarak aydınlık alan TEM modu nitrür penceresi bulabilirsiniz. TEM düzgün takıldığından emin olun, sonra hizaya getirin ve örnek odaklanma. </li><li> S / TEM KÖK moduna geçin. Örnek görüntü HAADF (veya eşdeğer) detektörü kullanın ve düzgün takıldığından emin olun. </li><li> Monokromatör düşük bir değere ayarlayın. Monokromatör daha düşük bir değer daha yüksek bir para birim sağlardelme için elektron t. S / TEM Monokromatör yoksa, bu adımı görmezden gelebilirsiniz. </li><li> Nanopore sondaj için uygun bir nokta boyutunu seçin. Bu elektron prob çapı karşılık gelir. 3 nm prob 5 nm çaplı gözenekler delmek için iyi çalışır. Büyük bir prob (5 nm) daha hızlı delme ve daha büyük bir gözenek yaratacaktır. Küçük bir prob (1 nm) daha küçük bir gözenek matkap ve oluşturmak için daha uzun sürer. </li><li> Gerekirse, KÖK hizalanmalar ayarlayın. </li><li> Odak nitrür membran ve x1.3M bir büyütme getirmek. Güzel odaklama Ronchigram izleme yapılmalıdır. </li><li> Örnek herhangi bir hareket varsa, o örnek stabilize etmek için bekleyin. Bu bir saat kadar sürebilir. Elektron ışını nitrür zarar vermemek için beklerken boş. </li><li> Örnek üzerinde elektron prob ve sondaj başlayın. </li><li> HAADF dedektörü ile tarayarak periyodik olarak numune kontrol, hem nanopore dri ediliyor emin olunlled (karanlık bir nokta gibi görünecek) ve örnek bir hareket olup olmadığını kontrol edin. Örnek biraz sürükleniyor, nanopore üzerinde elektron prob konumunu ayarlamak. </li><li> Gözenek oluşturmuştur tanımlamak için Ronchigram izleyin. Odak, nitrür filmi ışıltılı bir görünüme sahiptir. Bu zaman nanopore formları kaybolur. Biraz odak dışı Ronchigram koymak nanopore ile ilişkili bir Fresnel saçak görmek için izin verir. </li><li> HAADF nanopore bir görüntü çekin. </li><li> Nanopore görüntünün bir yoğunluk profili yapın. Nanopore çapı profil karanlık bölgeye göre tahmin edilebilir. </li><li> Nanopore Genişleme elektron prob gözenek kenarları boyunca hareket ettirerek yapılabilir. </li><li> Nanopore istenilen çapı sonra, TEM moduna S / TEM koymak. </li><li> Monokromatör boyutu onaylamak için aydınlık alan TEM kullanarak, standart belirleme ve görüntü nanopore getirin <strong&gt; (Şekil 1). </li></ol> 2. Solid-state nanopore, Islatma <ol><li> De-gaz içeren 1 M KCl, 10 mM potasyum fosfat, pH 7.4 de-iyonize su. Bu, vakum altında çözümler koyarak ve 20 dakika boyunca banyo sonikatör yerleştirerek yapılabilir. </li><li> 10 ml Pyrex behere nanopore içeren silisyum nitrür çipi yerleştirin. Çok hassas olduğu gibi nitrür penceresi kırmamaya özen gösterin. Davlumbaz ocak behere koyun ve 100 ° C&#39;ye kadar ayarlı </li><li> Nanopore çip piranha çözümü ile büyük bir özenle kullanarak temizleyin. Önce cam bir pipet kullanarak konteyner 3 ml sülfürik asit ekleyin. Sonra, dikkatle piranha çözüm 14 yapmak için 1 ml sülfürik asit, hidrojen peroksit ekleyin. Lütfen tüm tedbirleri almak. </li><li> Nanopore çip piranha çözüm emmek için 10 dakika izin verin. </li><li> Piranha çözüm cam bir pipet kullanarak kaptan çıkarın. Uygun bir depolama yuvasına yerleştirin. </li><li> Fitemiz bir cam pipet kullanarak de-gaz verilerek, de-iyonize su ile beher ll. Boş su beher ve en az 5 kez tekrarlayın. </li><li> Temiz bir cımbız ile nanopore çip ışık emme çıkarın ve kurulayın </li><li> Hemen nanopore odası (Şekil 2a, 2b) içine çip mühür, O-ring veya silikon çip odasında güvenli olabilir . </li><li> Odanın KCl çözeltisi ile doldurun </li><li> Odası (Şekil 2b) Ag / AgCl elektrot bağlayın. Elektrotlar gece çamaşır gümüş tel iliklerine tarafından yapılabilir. </li><li> Elektrotlar arasında bir transmembran potansiyeli uygulayın ve voltaj-klemp modunda bir Axon 200B patch-kelepçe amplifikatör kullanarak geçerli bir yanıt monitör. </li><li> Ölçümlerden bir I / V (akım-gerilim) eğrisi oluşturun. 1 M KCI (Şekil 3) kullanarak I / V eğrisi son derece doğrusal olmalıdır. Nanopore iletkenlik çapına uygun olmalıdır. Nanopore görünmüyorsadoğrusal I / V eğrisi, iletkenliği çok düşük, ya da nanopore açık akım sabit değildir (Şekil 4a), düzgün nanopore ıslatılmış ve piranha yıkama tekrar edilmelidir anlamına gelir. </li></ol> 3. İzleme protein adsorpsiyonu <ol><li> Bu protein örneği olmayan tampon koşulları ile şimdiki izlemek için bir tek nanopore membran veya nanopores paralel dizi (aşağıya bakınız) ile kontrol deneyleri gerçekleştirmek için büyük önem taşımaktadır. Biz aşağıdaki iki adımları uygulamanızı öneririz: (i) yüksek saflık düzeyinde bir tampon kullanımı (saflık&gt;% 99.9; kromatografisi-sınıf düzeyi), ve (ii), etkileşim, solid-state nanopore bir tampon kullanımı değildir tek kanallı olaylarını üretir. Buna ek olarak, yüksek saflıkta protein örnek standart protein kimyası prosedürleri kullanarak elde öneriyoruz. Protein örnek saflığı sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel (SDS-PAGE) analizi ve yüksek çözünürlüklü ma tarafından kontrol edilmelidirss spektrometresi 15. </li><li> Topraklı banyo odasının içine incelenecektir arıtılmış örnek protein ekleyin. Banyo boyunca diffüz örnek için zaman tanıyın. McM aralığı 7,15-21 nM onlarca tipik protein konsantrasyonu ölçülebilir. </li><li> Toplam çalışılan protein ücretten polarite tam tersi olan bir transmembran potansiyel gerilim önyargı uygulayın. Örneğin, BSA, pH 7.4 &#39;de etkili bir net negatif yük vardır ve bu nedenle pozitif bir gerilim önyargı uygulanmalıdır. Uygulanan gerilim zıt güçler tarafından tahrik olacak, karşılıklı suçlamaların nanopore iç ve proteinlerin içinde potansiyel degrade oluşturur. Nanopore proteinler sürücü sadece gerilim polarizasyona ölçülebilir sinyalleri yaratacaktır. </li><li> Uygulanan potansiyeli 200 mV büyüklükte bir çok protein analitler gözlemlemek için yeterli büyüklükte olması gerekir. Etkinlikler temel (Şekil 4b) geçici akım deplasmanlar gibi görünecektir.Hiç sinyal görülürse, oda protein konsantrasyonu artırır. Yüksek gerilimler için sinyal gürültü oranını iyileştirir. Nitrür nanopores birkaç volt dayanabilir. </li><li> Protein Adsorpsiyon, uzun ömürlü, nanopore (Şekil 4c) temel akımı değişiklikleri gibi görünecektir. </li></ol> 4. Nanopores işlevsellik için Olanakları Silisyum nitrür 22,23 fonksiyonel gruplar uygulamak için çeşitli yöntemler mevcuttur. Nitrür filmlerin çoğu ince bir oksit tabakası, dış ve ozon maruz kalma, gerekirse ek bir oksit tabakası oluşur. Farklı organosilanes katmanlar üzerine kullanılan ve kendi kendini monte edilebilir. Özellikle ilgi çekici olan, aminosilane organik yüzeylerin bir dizi inceleme için izin, öz-montaj ve daha fazla (yani, karboksilik asit ve aldehit) modifiye edilebilir. Nanopore piranha ile yıkanır ve Chambe emniyete sonrar, amin odasının banyosuna 0.5 M TBACl (tetrabutylammonium) ve çözücü olarak kullanılan susuz MeOH (metanol) destekleyici bir elektrolit ile direkt olarak ilave edilebilir. Monolayer oluşumu, 400 mV gerilim önyargı ve cereyanı 23 ölçüm uygulama tarafından takip edilebilir. 5. Belirgin birinci dereceden reaksiyon hızı sabit belirlenmesi ve paralel nanopore dizileri kullanarak sabit Langmuir adsorpsiyon 5.1 absorpsiyon ve desorpsiyon için belirgin birinci dereceden reaksiyon hız sabitleri Biz bu metodoloji olumlu yönü tek-molekül düzeyinde bireysel Adsorpsiyon gözlemlemek kabiliyeti olduğunu vurgulamak. Protein adsorpsiyonu inorganik bir yüzeye tek-molekül ölçümleri kullanılarak solid-state nanopores paralel diziler kadar ölçeklendirilebilir. Nanopores paralel dizi güvenilir istatistik almak için tahlil birçok gözenekleri ihtiyacı nedeniyle gereklis Bu amaçla, bir nanopore dizi kullanımı, bireysel Adsorpsiyon izlenmesi yanı sıra, daha fazla analiz için birden fazla olaylar ölçümü sağlayacak. Yukarıdaki örnek sadece birden fazla delik delme protokolü tarafından oluşturulan silisyum nitrür nanopores bir dizi olabilir. Her nanopore benzer büyüklükte olmalıdır. 6x6 ya da 7x7 nanopores Diziler yeterli olmalıdır. Analit odasına protein ilavesi üzerine, mevcut aşağıdaki ifade ile, üstel bir şekilde çürümeye: I t = I ∞ (∞ - I 0) exp (-k &#39;t) Burada, ben t, deneysel bir t zamanında mevcut gösterir. 0 nanopore dizi üzerinden orijinal akım geçiyor. ∞ (yani sonsuz) doygunluk düzeyinde akımı gösterir. K &#39;görünürdeki birinci dereceden reaksiyon hızını sabit, inci tespit edilebilire deneysel eğrinin uygun. Büyük bir k &#39;daha hızlı bir adsorpsiyon oranı olarak yorumlanabilir. Bu oran I ∞ / I 0, aynı zamanda, normalize doyma akımı olarak adlandırılan 0 ve 1 arasında boyutsuz bir sayıdır. Bu parametre, adsorbe protein analitler doluluk bir ölçüsüdür. Bu nedenle, her farklı deneysel durum iki spesifik çıkış parametreleri I ∞ / 0 ve k &#39;ile ilişkili olmalıdır. Bu görünürdeki birinci dereceden adsorpsiyon hız sabitleri ve normalize akımları nanopores içindeki proteinler tarafından harcanan zamanı etkili etkilenen olduğunu belirtmek gerekir. Bu sefer toplu sulu faz 24 protein analitlerin konsantrasyonuna bağlıdır. Bu nedenle, bu sayıların ek düzeltme nanopore iç içindeki proteinler tarafından harcanan zamanı etkili dayanarak uygulanması gerekmektedir. Biz sülfüroz frekans ölçüm öneririzt (translokasyon) ortalama ile çarpılması olaylar ve bu olayların bekleme süresi. Bu proteinlerin birim zamanda nanopore iç içinde harcanan ortalama süre verecek. Desorpsiyon oranı sabit, hem de nanopores paralel bir dizi kullanılarak tespit edilebilir. Mevcut düzeyi en kısa sürede doygunluk (I ∞) ulaştığında, voltaj ters olmalı, o yüzden artık proteinler nanopores içine sıkışmış. Desorpsiyon bireysel proteinlerin büyük değerler doğru kaydedilen akımının değişmesi ile eşlik edecek. Hız sabiti, daha sonra mevcut seviyesinin yükselişi çıkarılan olacaktır. Sabit 5.2 Langmuir adsorpsiyon Nanopores inorganik yüzeyler üzerine protein analitlerin emme sulu faz protein konsantrasyonu bağlıdır. Bu olgu, zaten tek-molekül düzeyinde 13 gözlenmiştir. Θ temsil ediyorsa<html> s normalize doyma akımı (I ∞ / I 0), daha sonra tipik bir Langmuir izoterm denklemi aşağıdaki ifade ile verilir : <img alt="Şekil 5.2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig5_2.jpg" /> C sulu faz protein konsantrasyonu. α Langmuir adsorpsiyon sabit. Bu sabit bir artış ile adsorpsiyon bağlayıcı enerji ve sıcaklık bir azalma ile artar. Θ veri toplama noktaları, sulu faz çeşitli protein konsantrasyonları yürütülen paralel diziler ölçümler istihdam sağlayacak . Veri büyüklüğü monte Langmuir adsorpsiyon sabit doğrulamak için diğer tekniklerle birlikte analiz edilmelidir. Buna ek olarak, tam atomlarla moleküler dinamik simülasyonları 25,26 da, elde edilen deneysel veriler yorumlara yardımcı olabilir . başlığı &quot;&gt; 6 Temsilcisi Sonuçlar Solid-state nanopores için tipik sonuçlar aşağıdaki gibi olacaktır. Açık gözenek akımı Şekil de görüldüğü gibi, son derece kararlı olmalıdır. 4a. Nanopore I / V özellikleri 1 M KCl 10 Şekil görüldüğü gibi potasyum fosfat, pH 7.4, yüksek doğrusal olmalıdır. 2. I / V eğrisinin doğrusal bir uyum eğimi nanopore üniter iletkenlik sağlayacak. Iletkenlik nanopore çapı doğrudan bir ilişki vardır ve denklem uymalıdır: <img alt="Şekil denklemi" src="/files/ftp_upload/3560/3560figeqn.jpg" /> L, G nanopore iletkenlik, d çapı, uzunluğu ve 14 oda çözüm iletkenliği σ. Bu değer% 30 içinde eşleşmesi gerekir. Çok küçük ise, gözenek muhtemelen ıslatılmış değildir. Protein ilavesi ile, hızlı olaylar Şekil de görüldüğü gibi, birbirini takip gerekir. 4b. Protein adsorpsiyon Şekil görüntülenir, uzun ömürlü bir akım damla. 4c. Bazı proteinler çok dayanıksız ve gözenek iç içinde yapısal değişim geçirmiştir. Bu durumda, uzun ömürlü bir gerilim düşümü hızlı dalgalanmalar eşlik edecek. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig1.jpg" /> Şekil 1 Tecnai F20 S / TEM kullanılarak üretilen Solid-state nanopore. Gözenek çapı 20 nm KÖK modunda açılmış. Görüntü aydınlık alan TEM modu alınmıştır. Nitrür 30 nm kalınlığında idi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig2.jpg" /> Şekil 2. Odası rezistif-nabız ölçümleri tek bir solid-state nanopore konut için kullanılır.) Odası ve serbest duran nitrür penceresi (TEM ızgara) ile bir silikon yongası. Nanopore yüklemeden önce nitrür içine delinmiş. Red O-ring, iyi bir s oluşturmak için kullanılır.iyonik çözüm iki hamam ayıran çip hakkında eal. B) odası nanopore açısından çözüm banyoları ve elektrot yerleştirme gösteren şematik. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig3.jpg" /> Şekil 3 farklı çaplarda solid-state nanopores Tipik I / V izler. Tek kanallı elektrik izlerini 1 M KCl 20 mM Tris, pH 8.5 alınmıştır. 30 nm kalınlığında silisyum nitrür Nanopores delinmiştir. Not nitrür kalınlığı nanopore üniter iletkenlik etkileyecektir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3560/3560fig4.jpg" /> Şekil 4 tek kanallı mevcut izleri ve protein adsorpsiyonu algılama ölçülmüştür. A) 10 nm çapında nanopore açık gösteren bir tek kanal elektrik iz. B) Cari deplasmanlar arası (BSA), sığır serum albümin bölümleme temsilnanopore IOR. C) Adsorpsiyon BSA nitrür yüzeye. 1 M KCl 10 mM potasyum fosfat, pH 7.4 de aynı nanopore tüm izleri. Uygulanan transmembran potansiyeli +40 mV ve BSA 120 nM konsantrasyonda topraklı odasının banyosuna eklendi.

<ol>
	<li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion-beam+sculpting+at+nanometre+length+scales.">Ion-beam sculpting at nanometre length scales.</a> Nature. 412, 166-169 (2001).</li><li>Li, J., Gershow, M., Stein, D., Brandin, E., Golovchenko, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+molecules+and+configurations+in+a+solid-state+nanopore+microscope.">DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope.</a> Nat. Mater. 2, 611-615 (2003).</li><li>Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+nanopores.">Solid-state nanopores.</a> Nature. Nanotechnology. 2, 209-215 (2007).</li><li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+and+challenges+of+nanopore+sequencing.">The potential and challenges of nanopore sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1146-1153 (2008).</li><li>Wanunu, M., Morrison, W., Rabin, Y., Grosberg, A. Y., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrostatic+focusing+of+unlabelled+DNA+into+nanoscale+pores+using+a+salt+gradient.">Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient.</a> Nat. Nanotechnol. 5, 160-165 (2010).</li><li>Peng, H., Ling, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+DNA+translocation+through+a+solid-state+nanopore+by+magnetic+tweezers.">Reverse DNA translocation through a solid-state nanopore by magnetic tweezers.</a> Nanotechnology. 20, 185101-185101 (2009).</li><li>Talaga, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+protein+unfolding+in+solid+state+nanopores.">Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 9287-9297 (2009).</li><li>Zhao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+SNPs+using+a+synthetic+nanopore.">Detecting SNPs using a synthetic nanopore.</a> Nano. Lett. 7, 1680-1685 (2007).</li><li>Storm, A. J., Chen, J. H., Ling, X. S., Zandbergen, H. W., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+solid-state+nanopores+with+single-nanometre+precision.">Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision.</a> Nat. Mater. 2, 537-540 (2003).</li><li>Sexton, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistive-pulse+studies+of+proteins+and+protein/antibody+complexes+using+a+conical+nanotube+sensor.">Resistive-pulse studies of proteins and protein/antibody complexes using a conical nanotube sensor.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 13144-13152 (2007).</li><li>Martin, C. R., Siwy, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry.+Learning+nature's+way:+biosensing+with+synthetic+nanopores.">Chemistry. Learning nature's way: biosensing with synthetic nanopores.</a> Science. 317, 331-332 (2007).</li><li>Sexton, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adsorption-based+model+for+pulse+duration+in+resistive-pulse+protein+sensing.">An adsorption-based model for pulse duration in resistive-pulse protein sensing.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 6755-6763 (2010).</li><li>Niedzwiecki, D. J., Grazul, J., Movileanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+protein+adsoption+onto+an+inorganic+surface.">Single-molecule observation of protein adsoption onto an inorganic surface.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 10816-10822 (2010).</li><li>Wanunu, M., Meller, A., Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-molecule techniques: a laboratory manual. , 395-420 (2008).</li><li>Han, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+detection+of+single+protein+molecules+and+protein-protein+interactions+using+synthetic+nanopores.">Label-free detection of single protein molecules and protein-protein interactions using synthetic nanopores.</a> Anal. Chem. 80, 4651-4658 (2008).</li><li>Han, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+protein+molecules+using+nanofabricated+pores.">Sensing protein molecules using nanofabricated pores.</a> Appl. Phys. Lett. 88, (2006).</li><li>Fologea, D., Ledden, B., McNabb, D. S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+characterization+of+protein+molecules+by+a+solid-state+nanopore.">Electrical characterization of protein molecules by a solid-state nanopore.</a> Appl. Phys. Lett. 91, (2007).</li><li>Firnkes, M., Pedone, D., Knezevic, J., Doblinger, M., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+Facilitated+Translocations+of+Proteins+through+Silicon+Nitride+Nanopores:+Conjoint+and+Competitive+Action+of+Diffusion,+Electrophoresis,+and+Electroosmosis.">Electrically Facilitated Translocations of Proteins through Silicon Nitride Nanopores: Conjoint and Competitive Action of Diffusion, Electrophoresis, and Electroosmosis.</a> Nano. Lett. , (2010).</li><li>Pedone, D., Firnkes, M., Rant, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+analysis+of+translocation+events+in+nanopore+experiments.">Data analysis of translocation events in nanopore experiments.</a> Anal. Chem. 81, 9689-9694 (2009).</li><li>Oukhaled, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Completely+Unfolded+and+Native+Proteins+through+Solid-State+Nanopores+as+a+Function+of+Electric+Driving+Force.">Dynamics of Completely Unfolded and Native Proteins through Solid-State Nanopores as a Function of Electric Driving Force.</a> ACS. Nano.. , (2011).</li><li>Yusko, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+protein+translocation+through+nanopores+with+bio-inspired+fluid+walls.">Controlling protein translocation through nanopores with bio-inspired fluid walls.</a> Nat. Nanotechnol. 6, 253-260 (2011).</li><li>Arafat, A., Schroen, K., de Smet, L. C., Sudholter, E. J., Zuilhof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailor-made+functionalization+of+silicon+nitride+surfaces.">Tailor-made functionalization of silicon nitride surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 8600-8601 (2004).</li><li>Wanunu, M., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+modified+solid-state+nanopores.">Chemically modified solid-state nanopores.</a> Nano. Lett. 7, 1580-1585 (2007).</li><li>Movileanu, L., Cheley, S., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+individual+flexible+polymers+into+a+nanoscopic+protein+pore.">Partitioning of individual flexible polymers into a nanoscopic protein pore.</a> Biophys. J. 85, 897-910 (2003).</li><li>Aksimentiev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+ionic+current+signatures+of+DNA+transport+through+a+nanopore.">Deciphering ionic current signatures of DNA transport through a nanopore.</a> Nanoscale. 2, 468-483 (2010).</li><li>Timp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopore+Sequencing:+Electrical+Measurements+of+the+Code+of+Life.">Nanopore Sequencing: Electrical Measurements of the Code of Life.</a> IEEE Trans. Nanotechnol. 9, 281-294 (2010).</li><li>Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tailoring+for+controlled+protein+adsorption:+effect+of+topography+at+the+nanometer+scale+and+chemistry.">Surface tailoring for controlled protein adsorption: effect of topography at the nanometer scale and chemistry.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 3939-3945 (2006).</li><li>Roach, P., Farrar, D., Perry, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+protein+adsorption:+surface-induced+conformational+changes.">Interpretation of protein adsorption: surface-induced conformational changes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 8168-8173 (2005).</li><li>Brewer, S. H., Glomm, W. R., Johnson, M. C., Knag, M. K., Franzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+BSA+binding+to+citrate-coated+gold+nanoparticles+and+surfaces.">Probing BSA binding to citrate-coated gold nanoparticles and surfaces.</a> Langmuir. 21, 9303-9307 (2005).</li><li>Schon, P., Gorlich, M., Coenen, M. J., Heus, H. A., Speller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+protein+adsorption+at+the+single+molecule+level+studied+by+atomic+force+microscopy.">Nonspecific protein adsorption at the single molecule level studied by atomic force microscopy.</a> Langmuir. 23, 9921-9923 (2007).</li><li>Rabe, M., Verdes, D., Zimmermann, J., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+organization+and+cooperativity+during+nonspecific+protein+adsorption+events.">Surface organization and cooperativity during nonspecific protein adsorption events.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13971-13980 (2008).</li><li>Rabe, M., Verdes, D., Rankl, M., Artus, G. R., Seeger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+concepts+and+phenomena+of+the+nonspecific+adsorption+of+beta-lactoglobulin.">A comprehensive study of concepts and phenomena of the nonspecific adsorption of beta-lactoglobulin.</a> Chemphyschem. 8, 862-872 (2007).</li><li>Micic, M., Chen, A., Leblanc, R. M., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Electron+Microscopy+Studies+of+Protein-Functionalized+Atomic+Force+Microscopy+Cantilever+Tips.">Scanning Electron Microscopy Studies of Protein-Functionalized Atomic Force Microscopy Cantilever Tips.</a> Scanning. 21, 394-397 (1999).</li><li>Grant, A. W., Hu, Q. H., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+'windows'+for+nanofabricated+structures.">Transmission electron microscopy 'windows' for nanofabricated structures.</a> Nanotechnology. 15, 1175-1181 (2004).</li><li>Giannoulis, C. S., Desai, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+proteins+and+fibroblasts+on+thin+inorganic+films.">Characterization of proteins and fibroblasts on thin inorganic films.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 13, 75-80 (2002).</li><li>Gustavsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+modifications+of+silicon+nitride+for+cellular+biosensors+applications.">Surface modifications of silicon nitride for cellular biosensors applications.</a> J. Mater. Sci: Mater. Med. 19, 1839-1850 (2008).</li><li>Shirshov, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+response+of+planar+polarization+interferometer+to+molecular+layer+formation:+fibrinogen+adsorption+on+silicon+nitride+surface.">Analysis of the response of planar polarization interferometer to molecular layer formation: fibrinogen adsorption on silicon nitride surface.</a> Biosens. Bioelectron. 16, 381-390 (2001).</li><li>Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+layer+deposition+to+fine-tune+the+surface+properties+and+diamters+of+fabricated+nanopores.">Atomic layer deposition to fine-tune the surface properties and diamters of fabricated nanopores.</a> Nano. Lett. 4, 1333-1337 (2004).</li><li>Siwy, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+biosensors+based+on+biofunctionalized+conical+gold+nanotubes.">Protein biosensors based on biofunctionalized conical gold nanotubes.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5000-5001 (2005).</li><li>Ding, S., Gao, C., Gu, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+Single+Molecules+of+Immunoglobulin+and+Ricin+with+an+Aptamer-Encoded+Glass+Nanopore.">Capturing Single Molecules of Immunoglobulin and Ricin with an Aptamer-Encoded Glass Nanopore.</a> Anal. Chem. , (2009).</li><li>Kim, M. -. J., Wanunu, M., Bell, C. D., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Fabrication+of+Uniform+Size+Nanopores+and+Nanopore+Arrays+for+Parallel+DNA+Analysis.">Rapid Fabrication of Uniform Size Nanopores and Nanopore Arrays for Parallel DNA Analysis.</a> Adv. Mater. 18, 3149-3153 (2006).</li><li>Bezrukov, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+as+molecular+Coulter+counters+to+probe+metabolite+transport.">Ion channels as molecular Coulter counters to probe metabolite transport.</a> J. Membr. Biol. 174, 1-13 (2000).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Solid-state yüzeyler üzerine 27-29 protein spontan adsorpsiyon biochip uygulamaları ve fonksiyonel melez Biyomalzemelerin yeni bir sınıf tasarım gibi alanlarda bir dizi, temelde önemli. Önceki çalışmalar, solid-state yüzeylere adsorbe proteinler yatay hareketlilik veya önemli desorpsiyon oranlarının görünmüyor olduğunu göstermiştir ve bu nedenle protein adsorpsiyon genellikle nonspesifik ve geri dönüşü olmayan bir süreç 30-32 olarak kabul edilir. Katı hal yüzeylerinden ...

<table border="1"><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Tecnai F20 S / TEM </td><td> FEI </td><td></td><td> S / TEM hızlandırma gerilimi ≥ 200kV ve saha emisyon kaynağı gerektirir. </td></tr><tr><td> TEM için 20 nm kalınlığında silisyum nitrür membran pencere </td><td> SPI </td><td> 4163SN-BA </td><td></td></tr><tr><td> Akson Axopatch 200B patch-kelepçe amplifikatör </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Akson Digidata 1440A </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 yazılım pCLAMP </td><td> Moleküler Cihazlar </td><td></td><td> Elektrofizyoloji Veri Toplama ve Analiz Yazılımı </td></tr><tr><td> Sülfürik Asit </td><td> Fisher Bilimsel </td><td> A300 </td><td></td></tr><tr><td> hidrojen peroksit </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325 </td><td></td></tr><tr><td> Silikon O-ring </td><td> McMaster-Carr </td><td> 003 S70 </td><td> Alternatif PDMS kullanın </td></tr><tr><td> gümüş tel </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 348759 </td><td> Elektrotlar için </td></tr><tr><td> SPC: Teknoloji, D alt iletişim, pin </td><td> Newark </td><td> 9K4978 </td><td> Elektrotlar için </td></tr><tr><td> potasyum klorür </td><td> Sigma </td><td> P9541 </td><td></td></tr><tr><td> potasyum fosfat dibazik </td><td> Sigma </td><td> P2222 </td><td></td></tr><tr><td> potasyum fosfat tekbazlı </td><td> Sigma </td><td> P5379 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Sylgar 184 Elastomer ayarlanır. Odasının yapmak için. </td></tr><tr><td> Kwik-Oyuncular Mastik </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> Kwik-Cast </td><td> Hızlı hareket eden silikon </td></tr><tr><td> sıcak plaka </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Faraday kafesi </td><td></td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring protein adsorption with solid-state nanopores

Solid-state nanopores tek-molekül düzeyinde, nükleik asitlerin yapısını ve esnekliğini 1-6, proteinler 7 açılımına ve değişik ligandlar 8 afinitesi incelemek için ölçümler yapmak için kullanılmaktadır . 9-12 rezistif-pulse tekniği bu nanopores kaplin, bu ölçümler çok çeşitli koşulları altında ve etiketleme 3 için gerek kalmadan yapılabilir. Rezistif-pulse tekniği, iyonik bir tuz çözeltisi nanopore iki tarafta tanıtıldı. Bu nedenle, iyonlar, sürekli bir akım uygulanan bir transmembran potansiyel odasının bir tarafı diğerine tahrik edilmektedir. Nanopore içine bir analitin bölümleme, tek-molekül bilgileri ayıklamak için analiz edilebilir, bu akımı iyi tanımlanmış bir sapma neden olur. Bu tekniği kullanarak, nanopore duvarlara tek proteinlerin adsorpsiyon geniş bir yelpazede altında izlenebilirkoşulları 13. Mikroakışkan cihazların boyutu küçültmek gibi, bu sistemlerin tek proteinleri ile etkileşimi bir endişe olur çünkü protein adsorpsiyonu, önemi de büyüyor. Bu protokol, diğer ince filmler, nanopore delme mükellef veya Fonksiyonlu nitrür yüzeylere kolayca uzatılabilir nitrür filmler, bağlayıcı protein için hızlı bir tahlil açıklamaktadır. Proteinlerin çeşitli geniş bir yelpazede çözümler ve denatüre koşulları altında incelenebilir. Ayrıca, bu protokol nanopore spektroskopi kullanarak daha fazla temel sorunları keşfetmek için kullanılıyor olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores at JoVE.com

Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Inorganik bir yüzeye proteinlerin non-spesifik adsorpsiyon izlemek için solid-state nanopores kullanarak bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak ve tek-molekül düzeyinde probed olması adsorpsiyon için izin, rezistif-pulse prensibi kullanmaktadır. Tek bir protein adsorpsiyon süreci denge noktasından uzak olduğu için, kantitatif protein adsorpsiyonu sabit görünen birinci dereceden reaksiyon hızı belirlenmesi yanı sıra ve Langmuir adsorpsiyon sabit sağlayan sentetik nanopores paralel diziler istihdam teklif.

Solid-state Nanopores ile izlenmesi Protein Adsorpsiyon

Solid-state nanopores have been used to perform measurements at the single-molecule level to examine the local structure and flexibility of nucleic acids ...

monitoring-protein-adsorption-with-solid-state-nanopores

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K Görüntüleme.  Syracuse University. Inorganik bir yüzeye proteinlerin non-spesifik adsorpsiyon izlemek için solid-state nanopores kullanarak bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak ve tek-molekül düzeyinde probed olması adsorpsiyon için izin, rezistif-pulse prensibi kullanmaktadır. Tek bir protein adsorpsiyon süreci denge noktasından uzak olduğu için, kantitatif protein adsorpsiyonu sabit görünen birinci dereceden reaksiyon hızı belirlenmesi yanı sıra ve Langmuir...

Video: Monitoring Protein Adsorption with Solid-state Nanopores

Registered Bioimaging of Nanomaterials for Diagnostic and Therapeutic Monitoring

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end organs. The latter include the lung, RES, and brain and are operative during human immunodeficiency virus type one (HIV-1) infection. Macrophage entry into tissues is notable in areas of active HIV-1 replication and sites of inflammation. In order to assess the potential of macrophages as nanocarriers, superparamagnetic iron-oxide and/or drug laden particles coated with surfactants were parenterally injected into HIV-1 encephalitic mice. This was done to quantitatively assess particle and drug biodistribution. Magnetic resonance imaging (MRI) test results were validated by histological coregistration and enhanced image processing. End organ disease as typified by altered brain histology were assessed by MRI. The demonstration of robust migration of nanoformulations into areas of focal encephalitis provides '"proof of concept" for the use of advanced bioimaging techniques to monitor macrophage migration. Importantly, histopathological aberrations in brain correlate with bioimaging parameters making the general utility of MRI in studies of cell distribution in disease feasible. We posit that using such methods can provide a real time index of disease burden and therapeutic efficacy with translational potential to humans.

Bioimaging methods used to assess cell biodistribution of nanoparticles are applicable for therapeutic and diagnostic monitoring of nanoformulated compounds. The methods described herein are sensitive and specific when assessed by histological coregistration. The methodologies provide a translational pathway from rodent to human applications.

Teşhis ve Tedavi İzleme Nanomalzemelerin Kayıtlı bio

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end ...

Biyomühendislik

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Kütle Sitometri: Bir CyTOF Kütle Sitometre Daily Tuning ve Koşu Hücre Örnekleri için protokol

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Multi-analyte Biochip (MAB) Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes (ASSISE) for Physiological Research

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) that can withstand prolonged storage in complex biological media 1-4. An all-solid-state ion-selective-electrode (ASSISE) is especially attractive for the aforementioned applications. The electrode should have the following favorable characteristics: easy construction, low maintenance, and (potential for) miniaturization, allowing for batch processing. A microfabricated ASSISE intended for quantifying H+, Ca2+, and CO32- ions was constructed. It consists of a noble-metal electrode layer (i.e. Pt), a transduction layer, and an ion-selective membrane (ISM) layer. The transduction layer functions to transduce the concentration-dependent chemical potential of the ion-selective membrane into a measurable electrical signal.
The lifetime of an ASSISE is found to depend on maintaining the potential at the conductive layer/membrane interface 5-7. To extend the ASSISE working lifetime and thereby maintain stable potentials at the interfacial layers, we utilized the conductive polymer (CP) poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) 7-9 in place of silver/silver chloride (Ag/AgCl) as the transducer layer. We constructed the ASSISE in a lab-on-a-chip format, which we called the multi-analyte biochip (MAB) (Figure 1).
Calibrations in test solutions demonstrated that the MAB can monitor pH (operational range pH 4-9), CO32- (measured range 0.01 mM - 1 mM), and Ca2+ (log-linear range 0.01 mM to 1 mM). The MAB for pH provides a near-Nernstian slope response after almost one month storage in algal medium. The carbonate biochips show a potentiometric profile similar to that of a conventional ion-selective electrode. Physiological measurements were employed to monitor biological activity of the model system, the microalga Chlorella vulgaris.
The MAB conveys an advantage in size, versatility, and multiplexed analyte sensing capability, making it applicable to many confined monitoring situations, on Earth or in space.
Biochip Design and Experimental Methods
The biochip is 10 x 11 mm in dimension and has 9 ASSISEs designated as working electrodes (WEs) and 5 Ag/AgCl reference electrodes (REs). Each working electrode (WE) is 240 &mu;m in diameter and is equally spaced at 1.4 mm from the REs, which are 480 &mu;m in diameter. These electrodes are connected to electrical contact pads with a dimension of 0.5 mm x 0.5 mm. The schematic is shown in Figure 2.
Cyclic voltammetry (CV) and galvanostatic deposition methods are used to electropolymerize the PEDOT films using a Bioanalytical Systems Inc. (BASI) C3 cell stand (Figure 3). The counter-ion for the PEDOT film is tailored to suit the analyte ion of interest. A PEDOT with poly(styrenesulfonate) counter ion (PEDOT/PSS) is utilized for H+ and CO32-, while one with sulphate (added to the solution as CaSO4) is utilized for Ca2+. The electrochemical properties of the PEDOT-coated WE is analyzed using CVs in redox-active solution (i.e. 2 mM potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6)). Based on the CV profile, Randles-Sevcik analysis was used to determine the effective surface area 10. Spin-coating at 1,500 rpm is used to cast ~2 &mu;m thick ion-selective membranes (ISMs) on the MAB working electrodes (WEs).
The MAB is contained in a microfluidic flow-cell chamber filled with a 150 &mu;l volume of algal medium; the contact pads are electrically connected to the BASI system (Figure 4). The photosynthetic activity of Chlorella vulgaris is monitored in ambient light and dark conditions.

Multi-analyte Biochip MAB Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes ASSISE for Physiological Research

All-solid-state ion-selective electrodes (ASSISEs) constructed from a conductive polymer (CP) transducer provide several months of functional lifetime in liquid media. Here, we describe the fabrication and calibration process of ASSISEs in a lab-on-a-chip format. The ASSISE is demonstrated to have maintained a near-Nernstian slope profile after prolonged storage in complex biological media.

Fizyolojik Araştırma All-katı hal İyon seçici elektrotlar (Assise) dayanarak Çok analit Biochip (MAB)

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) ...

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in the tissues are important parameters for successful clinical outcomes. In order to improve tissue integration, porous metallic implants have being developed. Open porosity of metallic foams is very advantageous, since the pore areas can be functionalized without compromising the mechanical properties of the whole structure. Here we describe such modifications using porous titanium implants based on titanium microbeads. By using inherent physical properties such as hydrophobicity of titanium, it is possible to obtain hydrophobic pore gradients within microbead based metallic implants and at the same time to have a basement membrane mimic based on hydrophilic, natural polymers. 3D pore gradients are formed by synthetic polymers such as Poly-L-lactic acid (PLLA) by freeze-extraction method. 2D nanofibrillar surfaces are formed by using collagen/alginate followed by a crosslinking step with a natural crosslinker (genipin). This nanofibrillar film was built up by layer by layer (LbL) deposition method of the two oppositely charged molecules, collagen and alginate. Finally, an implant where different areas can accommodate different cell types, as this is necessary for many multicellular tissues, can be obtained. By, this way cellular movement in different directions by different cell types can be controlled. Such a system is described for the specific case of trachea regeneration, but it can be modified for other target organs. Analysis of cell migration and the possible methods for creating different pore gradients are elaborated. The next step in the analysis of such implants is their characterization after implantation. However, histological analysis of metallic implants is a long and cumbersome process, thus for monitoring host reaction to metallic implants in vivo an alternative method based on monitoring CGA and different blood proteins is also described. These methods can be used for developing in vitro custom-made migration and colonization tests and also be used for analysis of functionalized metallic implants in vivo without histology.

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

In this video, we will demonstrate modification techniques for porous metallic implants to improve their functionality and to control cell migration. Techniques include development of pore gradients to control cell movement in 3D and production of basement membrane mimics to control cell movement in 2-D. Also, a HPLC-based method for monitoring implant integration in-vivo via analysis of blood proteins is described.

Gözenek Gradiyentler Polielektrolitler ve Bunların Dolaylı İzleme ile Metalik İmplant Çok Ölçekli Modifikasyon<em&gt; In vivo</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

Construction and Setup of a Bench-scale Algal Photosynthetic Bioreactor with Temperature, Light, and pH Monitoring for Kinetic Growth Tests

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic performance of microalgae-based biofuel production. Models that estimate microalgal growth under different conditions can help to optimize PBR design and operation. To be effective, the growth parameters used in these models must be accurately determined. Algal growth experiments are often constrained by the dynamic nature of the culture environment, and control systems are needed to accurately determine the kinetic parameters. The first step in setting up a controlled batch experiment is live data acquisition and monitoring. This protocol outlines a process for the assembly and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used to conduct microalgal growth experiments. This protocol describes how to size and assemble a flat-plate, bench-scale PBR from acrylic. It also details how to configure a PBR with continuous pH, light, and temperature monitoring using a data acquisition and control unit, analog sensors, and open-source data acquisition software.

This paper describes the assembly process and operation of a bench-scale photosynthetic bioreactor that can be used, in conjunction with other methods, to estimate pertinent kinetic growth parameters. This system continuously monitors the pH, light, and temperature using sensors, a data acquisition and control unit, and open-source data acquisition software.

Kinetik Büyüme Testleri için Sıcaklık, Işık ve pH İzleme ile Bir Bench Ölçekli Algal Fotosentetik Biyoreaktörün Kurulması ve Kurulması

The optimal design and operation of photosynthetic bioreactors (PBRs) for microalgal cultivation is essential for improving the environmental and economic ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

Vesiculo 'da otonom vezikül büyümesi için peptid membran öncülerinin sentezini

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Construction of a Wireless-Enabled Endoscopically Implantable Sensor for pH Monitoring with Zero-Bias Schottky Diode-based Receiver

Ambulatory pH monitoring of pathological reflux is an opportunity to observe the relationship between symptoms and exposure of the esophagus to acidic or non-acidic refluxate. This paper describes a method for the development, manufacturing, and implantation of a miniature wireless-enabled pH sensor. The sensor is designed to be implanted endoscopically with a single hemostatic clip. A fully passive rectenna-based receiver based on a zero-bias Schottky diode is also constructed and tested. To construct the device, a two-layer printed circuit board and off-the-shelf components were used. A miniature microcontroller with integrated analog peripherals is used as an analog front end for the ion-sensitive field-effect transistor (ISFET) sensor and to generate a digital signal which is transmitted with an amplitude shift keying transmitter chip. The device is powered by two primary alkaline cells. The implantable device has a total volume of 0.6 cm3 and a weight of 1.2 grams, and its performance was verified in an ex vivo model (porcine esophagus and stomach). Next, a small footprint passive rectenna-based receiver which can be easily integrated either into an external receiver or the implantable neurostimulator, was constructed and proven to receive the RF signal from the implant when in proximity (20 cm) to it. The small size of the sensor provides continuous pH monitoring with minimal obstruction of the esophagus. The sensor could be used in routine clinical practice for 24/96 h esophageal pH monitoring without the need to insert a nasal catheter. The &#34;zero-power&#34; nature of the receiver also enables the use of the sensor for automatic in-vivo calibration of miniature lower esophageal sphincter neurostimulation devices. An active sensor-based control enables the development of advanced algorithms to minimize the used energy to achieve a desirable clinical outcome. One of the examples of such an algorithm would be a closed-loop system for on-demand neurostimulation therapy of gastroesophageal reflux disease (GERD).

The manuscript presents a miniature implantable pH sensor with ASK modulated wireless output together with a fully passive receiver circuit based on zero-bias Schottky diodes. This solution can be used as a basis in the development of in vivo calibrated electrostimulation therapy devices and for ambulatory pH monitoring.

Zero-Bias Schottky Diyot Tabanlı Alıcı ile pH İzleme için Kablosuz Özellikli Endoskopik Olarak Yerleştirilebilir Sensör yapımı

Ambulatory pH monitoring of pathological reflux is an opportunity to observe the relationship between symptoms and exposure of the esophagus to acidic or ...

Coral Growth and Monitoring Using the Micro-Device System

Mikro cihaz sistemini kullanarak mercan büyümesi ve izlenmesi

İnsan İdrarından Sürekli Hücre Dışı Vezikül İzolasyonu için Mikroakışkan Cihaz

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. Nevertheless, the current methodologies for isolating EVs present significant challenges, such as complexity, time consumption, and the need for bulky equipment, which hinders their clinical translation. To address these limitations, we aimed to develop an innovative microfluidic system based on cyclic olefin copolymer-off-stoichiometry thiol-ene (COC-OSTE) for the efficient isolation of EVs from large-volume samples in a continuous manner. By utilizing size and buoyancy-based separation, the technology used in this study achieved a significantly narrower size distribution compared to existing approaches from urine and cell media samples, enabling the targeting of specific EV size fractions in future applications. Our innovative COC-OSTE microfluidic device design, utilizing bifurcated asymmetric flow field-flow fractionation technology, offers a straightforward and continuous EV isolation approach for large-volume samples. Furthermore, the potential for mass manufacturing of this microfluidic device offers scalability and consistency, making it feasible to integrate EV isolation into routine clinical diagnostics and industrial processes, where high consistency and throughput are essential requirements.

Yazar Spotlight: Biyoreaktör Entegrasyonu için Asimetrik Alan Akış Fraksiyonasyonu

Extracellular vesicles hold immense promise for biomedical applications, but current isolation methods are time-consuming and impractical for clinical use. In this study, we present a microfluidic device that enables the direct isolation of extracellular vesicles from large volumes of biofluids in a continuous manner with minimal steps.

Çatallı A4F Mikroakışkan Cihaz ile Büyük Hacimli Örneklerden Hücre Dışı Veziküllerin Tek Adımlı İzolasyonu

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...